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[size=4] 大家好,我的实验过程中遇到了些问题希望能得到大家的帮助,谢谢啊! 为了测定实验动物小鼠的肝肾中的[color=#940000]顺乌头酸酶[/color],我用提取液匀浆,[color=#940000]提取液[/color]成分(50mM Tris-HCl,1mM半胱氨酸,1mM柠檬酸钠,0.5mM MnCl2 ,PH8.0 ),离心后上清液与测定液(50mM Tris-HCl,20mM柠檬酸钠,PH8.0)反应,测紫外吸收,文献报道是240nm会有最大吸收,但是我的实验结果是在230nm有吸收峰,所以怀疑此230nm吸收峰是不是就是我要测的吸收峰,然后用排除法,因为测定液中的柠檬酸钠是酶反应的底物,当测定液中不加人底物,如果没有发现吸收峰的话那此吸收峰可能就是我要测的顺乌头酸酶跟底物柠檬酸钠反应产生的顺乌头酸的吸收,但是,紫外200-300nm扫描发现在200-235nm间有馒头状高吸收,是有底物条件下吸收峰的3倍甚至更高,这是为什么呢? 为什么我加入底物之后使紫外吸收显示出一个吸收峰,整体的吸光度下降那么多呢?[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/03/201003312114_209275_2024887_3.jpg[/img][img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/03/201003312117_209276_2024887_3.jpg[/img][/size]
http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/02/201402201500_490669_1060668_3.bmp问题1:如果基线出现较大波动,是否四氢呋喃氧化造成的问题2:流动相加冰醋酸后,PH为4.7,但是没出峰,是否还需要调节PH测乌头碱的条件如下:以乙腈-四氢呋喃(25:15)为流动相A,以0.1mol/L醋酸铵溶液(每1000ml加冰醋酸0.5ml)为流动相B,按下表中的规定进行梯度洗脱;检测波长为235nm。时间(分钟)流动相A(%)流动相B(%)0~4815→2685→7448~4926→3574→6549~58356558~6535→1565→85对照品溶液的制备取乌头碱对照品、次乌头碱对照品、新乌头碱对照品适量,精密称定,加异丙醇-三氯甲烷(1:1)混合溶液分别制成每1ml含乌头碱50μg、次乌头碱和新乌头碱各0.15mg的混合溶液,即得。
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