转瓶细胞观察台

生物显微镜观察细胞，光强对细胞状态有影响吗

想问生物显微镜观察细胞，光强会对细胞状态有影响吗，有没有懂这方面的，麻烦说一下谢谢

近日，德国IBIDI公司成功开发出一款超高分辨率生物显微镜。该公司宣称基于新型随机光学重建显微技术“（d）STORM”，利用该公司独创的特殊塑料底板“μ-Slides”可实现超高分辨率观察活体细胞。 STED，SIM，（F）PALM 和（d）STORM等新型光学显微技术可有效避免衍射极限，获得纳米级水平的超高分辨率成像。这些超高分辨率显示技术可应用到生物实验研究，观察了解组织细胞分子结构。IBIDI公司采用了创新性的含有亲水性膜涂层的塑料材质底板“μ-Slides”替代传统玻璃底板，首次实现了“活体细胞”超高分辨率观察。这种被成为“ibi-Treat”的亲水性膜涂层性能可以与标准的细胞培养瓶和培养皿相媲美。 IBIDI公司相关研发工作受到了德国联邦教研部《生命科学领域光学技术—基本细胞功能》项目的资助。

现在大多数对细胞超微结构的观察多采用化学染色法固定、染色、脱水、包埋的前处理，电镜观察。想请教一下各位大虾，有没有什么好的技术能实现对活细胞的超微结构的实时动态观察啊？最好不要染色什么的处理，直接在生理状态下就能观察。需要国内能够买到的仪器，谢谢大家了。目前查了一下文献，好像原子力显微镜、相差显微镜说可以，但我看了一下成像，感觉不如电镜的分辨率高啊。还有共聚焦显微镜，需要使用特定的荧光探针。

[align=left][font='times new roman'][size=18px]细胞培养及[/size][/font][font='times new roman'][size=18px]形态学观察[/size][/font][/align][font='宋体'][size=16px]（[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1[/size][/font][font='宋体'][size=16px]）[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞复苏：从液氮中取出细胞后，将细胞冻存管用细胞复苏[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]盒迅速[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]转移至[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]37[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]℃[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]恒温水浴锅中，轻摇使细胞迅速解冻。细胞解冻后立即吸取至[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]10 mL[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]预热的完全培养基中，吹打混匀，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]9[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]00 rpm [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]离心[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]8[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]min[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]吸弃上[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]清，用[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]5 mL[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]完全培养基重悬细胞，将细胞接种至[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]25 cm[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]培养瓶中，沿培养瓶瓶底吹打，使细胞附着在培养瓶瓶底，恒温[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]37[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]℃[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]5% CO[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]条件下培养。[/size][/font][font='宋体'][size=16px]（[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='宋体'][size=16px]）[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞传代：[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]H[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]446[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]为半贴壁半悬浮细胞，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]D[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]MS114[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]为贴壁细胞，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]H[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]69[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]H[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]526[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]为悬浮细胞。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]吸弃培养基[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]后用[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]5 mL 1[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]×[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]PBS[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]清洗[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]次，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]吸弃上[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]清，每[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]25 cm[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]培养瓶或[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]6 cm[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]培养皿加入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1 mL[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]胰酶消化[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2 min[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]。镜下观察细胞变圆形或轻拍开始脱落，加入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2 mL[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]完全培养基终止消化（悬浮细胞不需胰酶消化），移入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]15 mL[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]离心管内，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]9[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]00 rpm[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，离心[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]8[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] min[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]吸弃上清液[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，加入新鲜培养基重悬细胞并吹打混匀。将细胞按实验需求接种于培养瓶或培养皿中，培养条件同上。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]（[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]）细胞计数：制备细胞悬液（实验步骤同细胞传代），吹打混匀，取[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]200 [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]μ[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]L[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]的细胞悬液至[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1.5 mL EP[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]管内，再加入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]200 [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]μ[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]L[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]的[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]台盼蓝[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]染色剂，充分吹打混匀细胞悬液。取适量细胞悬液滴加于细胞计数板上，在显微镜下观察并计数（被[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]台盼蓝[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]染成蓝色的细胞为死细胞，死细胞不计数），分别计数视野中计数板上四个大格子中细胞的数量，并计算平均值。细胞密度[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]=[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]平均值×[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]10[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]4[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，即每毫升培养基中细胞的数量。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]（[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]4[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]）[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞冻存：将处于对数生长期的细胞制备成细胞悬液（步骤同上）并计数。每[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0.8-1.0[/size][/font][font='arial'][size=16px]×[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]10[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]个细胞加入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1 mL[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞冻存液，轻轻吹打混匀，每支冻存管加[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1 mL[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]的细胞悬液（标记清楚冻存细胞代数，所用培养基，细胞来源，冻存日期，冻存者姓名缩写）。将冻存管用封口胶封好后放入细胞冻存盒（含异丙醇）中，放入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]-80[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]℃[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]冰箱保存，第二天将细胞移至液氮罐中以长期保存。[/size][/font][font='times new roman'][size=18px]细胞形态学观察[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]（[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]）铺板[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]取[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]对数生长期[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] H446[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]H[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]69[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]H[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]526[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]D[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]MS114[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]计数，分别接种等量细胞至[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]孔板，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]“[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]十字形[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]”[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]晃动，使细胞分布均匀，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]继续[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]培养。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]（[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]）药物处理[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]待细胞融合率约[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]80%[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]加入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]不同浓度（[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]IC20[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]IC50[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]）含药培养基[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]。每组均设置[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]D[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]MSO[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]对照组。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]（[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]）放入培养箱培养[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]48[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]72[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]h[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]后观察细胞形态并拍照。[/size][/font]

现在的问题在于，以前有人用扫描电镜这种方法，用扫描电镜应该肯定没有问题。如果用透射电镜，是否存在图象效果不是很好的问题（但是放大倍数好象不小，可能可以看清楚？），是否在观察的时候，因为样品有一定的厚度要求，因为这里观察的是细胞，所以直接观察细胞是否影响效果？是否还有其他我没有考虑到的因素，比如说是制备样品过程中的问题呢？同样是否可以用冰冻蚀刻技术呢？

我想用透射电镜观察不同类型的淋巴细胞，想问一下固定前的操作有哪些注意的？大概需要多少细胞？（我用流式分离的）离心时要多大的离心力？不知道有没有有经验的老师能给点帮助。谢谢

问题：观察细胞调往用透视电镜还是扫描电镜？回答：应该是用扫描电镜。首先你应该选用24孔板，然后把一个大约边长1厘米的盖玻片（自己用剪刀剪的）保证无菌，放入24孔板的底部，然后把细胞点入培养板，培养过夜，让细胞帖壁于小盖玻片上，然后加药，按照你需要的处置时间，培养48小时，或者是72小时，然后用镊子把小盖玻片拿出来，用固定液固定梯度脱水，染色。最后由电镜专业操作人员在扫描电镜下观察。可以帮你分析是否出现淍亡小体，淍亡小泡等。

低温扫描电子显微镜可以观察不同含水量样品的细胞超微结构吗

我要观察重金属对植物细胞形态的影响，请问各位我是用扫描电镜还是用透射电镜？

各位好，新人报道，请多关照今天用FEI的透射电镜观察细胞样品，设置加速电压200kv，结果视野混乱不堪，没法看。后查阅文献，发现别人都设置80~120kv，我想请教各位，发射电压会对最终的结果产生决定性影响吗，多谢！

蔡康显微镜下的观察纤维细胞的微管分布-技术精华 目前显微镜观察微生物有：生物显微镜 蔡康高档显微镜 荧光显微镜 倒置显微镜 都可以观察研究微生物，请看下面阐述介绍 [img=340,340]http://www.zskp.org.cn/Article/UploadFiles/200803/2008030615471734.jpg[/img]一、目的要求　　1．明确显微镜计数的原理。　　2．学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。　　二、基本原理　　利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（ 0．1mm2），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。　　血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。血球计数板构造如图Ⅷ-1。　　计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格（图Ⅷ-2）；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格（图Ⅷ-1，C）。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25=400小方格，如图Ⅷ-2。　　每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0．1mm，所以计数室的容积为0．1mm3。　　在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。　　下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数　　因1ml=1cm3=1000mm3，　　 　　 (即0.1mm3中的总菌数)为(A/5)*25*B=50000AB（个）　　同理，如果是16个中方格的计数板，设五个中方格的总菌数为A＇，则　　 1ml菌液中总菌数=(A＇/5)*16*10*1000*B＇=32000A＇B＇(个)　　 　　　三、器材　　酿酒酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管。　　四、操作步骤　　1．稀释　　将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。　　2．镜检计数室　　在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。　　3．加样品　　将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。　　4．显微镜计数　　静止5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。　　5．清洗血球计数板　　使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。　　五、实验报告　　1．结果　　将结果记录于下表中。 A表示五个中方格中的总菌数； B表示菌液稀释倍数。　　2．思考题　　根据你实验的体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？这是多年以来上海蔡康光学经历磨炼 得出的结果，也为研究人员带来的方便，为国家作出贡献.

大家还记得我吗？好久好久没有来发帖了，肯定都快被遗忘了。一直在忙着养细胞，这次过来给大家分享一些自己的心得体会。↓↓↓养了很久的细胞，有一些经验和体会总结一下，和大家分享一下。关于如何把细胞养的形态很好更漂亮。1.不同的细胞，喜欢的环境是不一样的。这个不仅仅是说培养基的不同，还有就是细胞生长的空间密度问题。有一些细胞是数量多一点比较好生长，生长状态也比较好。这种一般是属于生长速度慢的细胞。譬如内皮细胞。而有一些是细胞是数量少一点细胞状态会生长的比较好，譬如巨噬细胞和某些肿瘤细胞。尤其是巨噬细胞，生长速度非常得快，贴壁速度很快，所以传代时就应该留很少量的细胞，这样细胞状态会比较好。并且巨噬细胞比较喜欢扎堆生长，而堆与堆之间是有空间的。如果长成相连在一起的一满片的时候，细胞形态基本上就会差了，老化的会比较多，对后期实验结果是不好的。所以在养细胞的时候应该摸索该细胞喜欢的生长空间密度问题。2.对于有些人总是会遇到养的细胞形态怎么都不好的问题。这个其实是有一个方法可以改善的。对于贴壁细胞，如果细胞形态不好，（或者细胞形态不清晰，表面似有异物等）可以在传代的时候进行如下操作：首先，倒掉旧的培养基，加入3ml新的培养基（有无血清的都可）洗涤一次，用滴管吸走，然后再加入3ml的培养基，进行预吹打，控制吹打力度，轻轻地大概沿着瓶底过一遍，然后吸走。这时侯再开始正式的消化、吹打。（巨噬细胞我们只吹打，不消化的）其次，把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内，培养瓶事先加入培养基，放入培养箱内培养，按时间点观察细胞贴壁情况。10分钟观察一次，20分钟，30分钟观察一次。选择一个时间点，已经有部分细胞贴壁的情况下，重新置于洁净台，底面朝上迅速倒出其中的培养基，加入3ml新培养基再轻轻洗一次。然后加入完全培养基培养。后续观察细胞生长情况以及形态。我称之为“二传”。呵呵。如果一次效果还不理想，可重复多次。直到找到细胞完美形态。其中要注意，结合细胞喜欢的生长情况。喜欢多一点数量长得好的细胞你就等贴壁细胞比较多点的时候再传。反之亦然。这个是我师兄发明的，谢谢他了。这个方法真的很好用！3.关于培养瓶内加入培养基的量的问题。这个是要靠自己去摸索你所养的细胞的。并不是小的玻璃方瓶12ml，大方瓶14ml的。有些细胞反而是培养基少一点相反细胞形态会长得比较好。（可能也是竞争很大，有优胜劣汰吧。呵呵。）对于生长速度快的细胞，易生长的细胞加少一点培养基细胞形态会更好。但是要注意换液掌握。4.关于选择培养瓶的问题。个人发现生长速度快的细胞在玻璃瓶内生长的状态会比一次性塑料瓶相对好一些。而对于同一种细胞，在其生长旺盛快速的时期在玻璃瓶内的生长状态也比塑料瓶内好。这可能是因为塑料瓶比玻璃瓶更容易贴壁。生长速度快的细胞在塑料瓶这种相对“更安逸”的环境里反而长得状态不如玻璃瓶好。所以对于生长速度慢的细胞如果想要更漂亮的细胞状态，塑料瓶比玻璃瓶会好，对于生长速度慢的细胞，玻璃瓶则会更好。同样，对于同一种细胞，在其生长速度慢的时候，塑料瓶会好一点，比如刚刚复苏的时候，或者原代培养的时候。而在其生长旺盛的时候，玻璃瓶则相对会好一点。今天就先分享到这里吧，等下次有时间来逛帖的时候再来分享。大家一定要注意：要想把细胞养的漂亮，一定要保持实验室干净整洁。至于怎么保持，方法很重要，更重要的是要有责任心。方法的话，可能每个人都会有自己的一套方法，不过能走捷径的还是可以走的。像我们实验室，现在很多都是利用软件来管理的。还记得之前给你们推荐的那款软件吗？我们实验室现在还在用，倒是真的蛮好用的，至少大家做实验的时候不会再乱堆乱放了（因为有领用记录）可能新朋友不知道，或者没有看过我上篇帖子的人不了解，如果相信我的推荐，可以看下我上一篇帖，谢谢，希望能帮到大家！差点忘了，那款软件更新成了iLab，不叫Mr.F了。其他不多说，省得被当成打广告的！

大家还记得我吗？好久好久没有来发帖了，肯定都快被遗忘了。一直在忙着养细胞，这次过来给大家分享一些自己的心得体会。↓↓↓养了很久的细胞，有一些经验和体会总结一下，和大家分享一下。关于如何把细胞养的形态很好更漂亮。1.不同的细胞，喜欢的环境是不一样的。这个不仅仅是说培养基的不同，还有就是细胞生长的空间密度问题。有一些细胞是数量多一点比较好生长，生长状态也比较好。这种一般是属于生长速度慢的细胞。譬如内皮细胞。而有一些是细胞是数量少一点细胞状态会生长的比较好，譬如巨噬细胞和某些肿瘤细胞。尤其是巨噬细胞，生长速度非常得快，贴壁速度很快，所以传代时就应该留很少量的细胞，这样细胞状态会比较好。并且巨噬细胞比较喜欢扎堆生长，而堆与堆之间是有空间的。如果长成相连在一起的一满片的时候，细胞形态基本上就会差了，老化的会比较多，对后期实验结果是不好的。所以在养细胞的时候应该摸索该细胞喜欢的生长空间密度问题。2.对于有些人总是会遇到养的细胞形态怎么都不好的问题。这个其实是有一个方法可以改善的。对于贴壁细胞，如果细胞形态不好，（或者细胞形态不清晰，表面似有异物等）可以在传代的时候进行如下操作：首先，倒掉旧的培养基，加入3ml新的培养基（有无血清的都可）洗涤一次，用滴管吸走，然后再加入3ml的培养基，进行预吹打，控制吹打力度，轻轻地大概沿着瓶底过一遍，然后吸走。这时侯再开始正式的消化、吹打。（巨噬细胞我们只吹打，不消化的）其次，把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内，培养瓶事先加入培养基，放入培养箱内培养，按时间点观察细胞贴壁情况。10分钟观察一次，20分钟，30分钟观察一次。选择一个时间点，已经有部分细胞贴壁的情况下，重新置于洁净台，底面朝上迅速倒出其中的培养基，加入3ml新培养基再轻轻洗一次。然后加入完全培养基培养。后续观察细胞生长情况以及形态。我称之为“二传”。呵呵。如果一次效果还不理想，可重复多次。直到找到细胞完美形态。其中要注意，结合细胞喜欢的生长情况。喜欢多一点数量长得好的细胞你就等贴壁细胞比较多点的时候再传。反之亦然。这个是我师兄发明的，谢谢他了。这个方法真的很好用！3.关于培养瓶内加入培养基的量的问题。这个是要靠自己去摸索你所养的细胞的。并不是小的玻璃方瓶12ml，大方瓶14ml的。有些细胞反而是培养基少一点相反细胞形态会长得比较好。（可能也是竞争很大，有优胜劣汰吧。呵呵。）对于生长速度快的细胞，易生长的细胞加少一点培养基细胞形态会更好。但是要注意换液掌握。4.关于选择培养瓶的问题。个人发现生长速度快的细胞在玻璃瓶内生长的状态会比一次性塑料瓶相对好一些。而对于同一种细胞，在其生长旺盛快速的时期在玻璃瓶内的生长状态也比塑料瓶内好。这可能是因为塑料瓶比玻璃瓶更容易贴壁。生长速度快的细胞在塑料瓶这种相对“更安逸”的环境里反而长得状态不如玻璃瓶好。所以对于生长速度慢的细胞如果想要更漂亮的细胞状态，塑料瓶比玻璃瓶会好，对于生长速度慢的细胞，玻璃瓶则会更好。同样，对于同一种细胞，在其生长速度慢的时候，塑料瓶会好一点，比如刚刚复苏的时候，或者原代培养的时候。而在其生长旺盛的时候，玻璃瓶则相对会好一点。今天就先分享到这里吧，等下次有时间来逛帖的时候再来分享。大家一定要注意：要想把细胞养的漂亮，一定要保持实验室干净整洁。至于怎么保持，方法很重要，更重要的是要有责任心。方法的话，可能每个人都会有自己的一套方法，不过能走捷径的还是可以走的。像我们实验室，现在很多都是利用软件来管理的。还记得之前给你们推荐的那款软件吗？我们实验室现在还在用，倒是真的蛮好用的，至少大家做实验的时候不会再乱堆乱放了（因为有领用记录）可能新朋友不知道，或者没有看过我上篇帖子的人不了解，如果相信我的推荐，可以看下我上一篇帖，谢谢，希望能帮到大家！差点忘了，那款软件更新成了iLab，不叫Mr.F了。其他不多说，省得被当成打广告的！

【序号】：1【作者】：刘璐璐【题名】：三维培养条件下骨髓间充质干细胞的形态学观察【期刊】：山西医科大学【年、卷、期、起止页码】：2022【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C475KOm_zrgu4lQARvep2SAkueNJRSNVX-zc5TVHKmDNkhj_JpBBTDZS90To-XUT-zkJYyY14qZp-BPIDn6w4bDJ&uniplatform=NZKPT

各国争相发展的重点项目　　iPS技术，即诱导性多能干细胞技术，是一种将成体成熟、分化的体细胞重编程获得类似胚胎干细胞的新兴技术。2007年11月美国和日本科学家分别独立宣布可将人类皮肤细胞转化为iPS细胞。这一发现被《自然》和《科学》杂志分别评为2007年第一和第二大科学进展。之后，iPS细胞研究迅猛发展，不同的国家和实验室纷纷报道了多种方法建立的iPS细胞系。就连世界第一只体细胞克隆动物多利羊的培育者伊恩·威尔莫特也宣布放弃人类胚胎干细胞克隆研究，转而进行 iPS 细胞研究，因为他认为这种细胞比胚胎干细胞更具潜在优势。　　我国连续多年将干细胞研究列入“863”、“973”、国家自然基金重点项目。国务院2006年发布的《国家中长期科学和技术发展规划纲要（2006-2020年）》中，干细胞作为五项生物技术之一成为未来15年我国前沿技术的重点研究领域。　　致瘤风险浮出水面　　Yamanaka研究组在《自然·生物技术》上发表的文章显示，用iPS细胞诱导的神经干细胞，即使不含c-Myc（曾被认为是导致肿瘤的主要原因），在植入NOD/SCID免疫缺陷小鼠后仍有很强的致瘤性，甚至高于胚胎干细胞。　　　他们共研究了36个iPS细胞克隆，在诱导方式上，有些诱导剂配方中含有c-Myc基因，有些没有，因此具有较好的代表性。同时他们选择了3株胚胎干细胞作为对照。在45周的观察中，移植胚胎干细胞来源神经干细胞的34只小鼠有4只长出肿瘤。在100只移植胚胎成纤维细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中34只发现肿瘤，概率和胚胎干细胞相当。在55只移植成人成纤维细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中46只发现肿瘤，概率远高于胚胎干细胞。在36只移植肝细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中10只发现肿瘤，概率高于胚胎干细胞。8只移植胃上皮细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中未发现肿瘤。病理学检查证实肿瘤均为畸胎瘤，部分为恶性畸胎瘤。　　研究还发现，以前认为致瘤性很强的c-Myc在去掉后并没有减少iPS神经干细胞的致瘤性，相反以前认为没有致瘤性的Nanog基因却可以明显增强iPS神经干细胞的致瘤性。　　这次试验的另一个意外结果是并未发现在生成的肿瘤细胞中有c-Myc或其他基因的激活。以前的观点认为，转入的癌基因是iPS致瘤性的基础，只要在iPS细胞诱导成功后通过各种方法去除已完成使命的癌基因即可使iPS细胞免于致瘤性。这次试验的结果无疑给这些想法留下了阴影，而且使iPS致瘤的机制更加扑朔迷离。

[font='times new roman'][size=18px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=18px][color=#000000]顺铂的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=18px][color=#000000]细胞毒性实验及细胞形态学观察[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]（[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]）当[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]H1299[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]细胞融合到[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]80%-90 %[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]左右，消化处理细胞并计数。将[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]H1299[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]细胞以[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]10[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]5[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]个[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]/[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]孔的比例接种到[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]96[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]孔板中，保证细胞分布均匀，培养过夜使细胞[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]贴[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]壁。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]（[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]）分别配置[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]0[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]10[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]100[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]1000[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]μ[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]M[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]含顺铂[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]培养基，沿着侧壁加入到[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]96[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]孔板中，每孔[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]200[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]μ[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]L[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，每个浓度设置[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]6[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]个复孔。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]96[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]孔板外围加入[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]100[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]μ[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]L[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]PBS[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]缓冲液[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，防止边缘效应[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]（[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]）将[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]96[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]孔板放入培养箱培养[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]天后，用倒置相差显微镜观察细胞形态并拍照。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]（[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]4[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]）用[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]MTS[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]法测定细胞活力，每孔加入[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]20[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]μ[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]L[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] MTS[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]试剂，全程避光，继续培养[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3 h[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。利用酶标仪[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]在[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]490 nm[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]波长检测各孔[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]OD[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]值。用[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]ODtreat[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]/[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]ODcontrol[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]表征细胞活力，计算细胞活力。细胞活力测定数据是基于三次独立的实验。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px]在细胞迁移过程中，细胞内上皮间充质转化（[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]EMT[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]）相关蛋白的表达量会发生相应的变化。为了检测外[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]泌[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]体与细胞孵育时间对[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]EMT[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]相关蛋白的影响，实验[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]测定了加入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1×[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]10[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]10[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]个外[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]泌[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]体颗粒后[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]在[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]第[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]4[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]天[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]EMT[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]相关蛋白的表达[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]量[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]变化[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]。如图所示，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]E-Cad[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]蛋白的表达量在第[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]天逐渐减少至[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]最初[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]的[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0.7[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]倍。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]N-Cad[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]和[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]Vimentin[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]蛋白在第[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]天的表达量分别增加了[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1.5[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]倍和[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1.4[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]倍。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]以上结果说明[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]外[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]泌[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]体[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]与细胞共培养[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]天后，细胞内[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]EMT[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]相关蛋白变化更为显著。[/size][/font][table][tr][td][align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/08/202108012221112395_9347_5111497_3.jpeg[/img][/align][/td][/tr][/table][align=center][font='times new roman']图[/font][font='times new roman']1[/font][font='times new roman']外[/font][font='times new roman']泌[/font][font='times new roman']体与[/font][font='times new roman']H1299[/font][font='times new roman']细胞孵育时间对[/font][font='times new roman']EMT[/font][font='times new roman']相关蛋白的影响[/font][/align][font='times new roman'][size=16px]为了进一步在蛋白水平上验证外[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]泌[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]体可以促进细胞迁移，我们提取共育[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]天的细胞蛋白质，检测[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]EMT[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]相关蛋白的表达变化。实验结果显示，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]随着外[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]泌[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]体浓度的增加，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]E-Cad[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]蛋白表达降低，而[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]N-Cad[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]蛋白和[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]Vim[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]en[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]tin[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]蛋白表达增加。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]上述[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]结果可进一步证明捕获的外[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]泌[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]体可以诱导[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]迁移[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]具有良好的生物活性。[/size][/font]

做cell biology实验，细胞铺板大概是最常见的一个实验了。但是有很多人不是很得要领，铺得不是均匀： 要么中间密周围稀，要么周围密中间秃顶。以下是我的一些技巧，希望可以帮助到大家。1. 一般96孔板我每孔是加100微升细胞悬液，从孔的左边靠近底部加入，加完半边板后，将未加的细胞悬液混一下再，继续加剩余的半边板子，都加完后盖上盖子，左手轻轻扶住板的左边，右手轻轻敲击板的右边缘，注意把握力度（我一般轻巧敲三下），太强或次数太多会导致细胞集中成堆，将板顺时针旋转（逆时针效果不好），依次敲击剩余三个边，静置约5分钟，放入37度培养箱。 6孔板12孔板或24孔板，我均采用将第一个孔加入少量无血清培养基，晃动浸润整个孔底，然后用移液枪吸至第二孔，同样方法浸润孔底，其它孔一次类推，这样整个孔底都是湿润的，细胞悬液会平铺在整个孔底，加细胞悬液的时候可以避免加在中间中间细胞多，而加在周边晃匀后周边细胞多中间少的现象，细胞分散较均匀，注意加完细胞悬液后要放工作台静置一下。这个方法就是有点慢，但操作熟练了也不慢。也可以采用轻拍的方式，但力度没有96孔板好掌握，效果没有96孔板好，所以我放弃改用浸润孔底的方法。2.细胞悬液加完后，将细胞培养板抬高，对着灯光，从底部往上看，看细胞有没有抱团。然后从底部敲击，使之分散。3. 如果实验室有平板振荡器的话，我建议用这个仪器稍振荡一下，效果不错，就是振幅小，频率高的那种。4. 细胞要尽量打散，大部分呈单个状态。离心后，要充分悬浮！还有转移到六孔板后，是要晃得！晃的时候最好不要让那个细胞液转圈，不然细胞就全被带到中间去了，就会不均匀！5. 一瓶细胞长满后，正常处理，在培养瓶里吹匀，然后铺6孔板，每孔2毫升，铺完之后不用观察直接用酒精棉擦拭，然后放到培养箱里，轻微的左三圈右三圈 前三圈 后三圈。基本上24小时之后观察 每孔的细胞都会很均匀。6.计算好所需要的全部液体量和细胞量，混匀后，加到六孔板里，六孔板按横8字型晃，显微镜下观察，如果不均匀，按上述方法再晃。如果细胞未计数直接种的话，在种六孔板的过程中，随时晃一下混匀用的瓶子，瓶子我通常是顺时针或逆时针转圈。7.放在水平板面上先上下移动，再左右移动，每个方向５到６次，但关键的是摇完后最好直接放入培养箱中，不要再做过多的运动，例如放到镜下去看，否则很容易就又聚到中间去了。

感受态细胞的制备(一)制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞　　下述操作方案是由Hanahan(1983)提供的，所制备的大肠杆菌DHl、DH5和ＭＭ249感受态细胞培养物能使每微克超螺旋ＤＮＡ以≥5x108转化菌落的频率进行转化，其他大多数大肠杆菌菌株的最高转化率大约只有前述菌株的1/10-1/5。尽管如此，实际上对所有克隆方面的用途来说，这已绰绰有余。一些大肠杆菌菌株（如ＭＣ1061）不适于此法。下列有３个因素对于获得持续高的转化频率来说是至关重要的：（１）转化缓冲液中试剂的纯度 务必使用所能得到的最高质量的试剂，这些试剂应分装成小份，避光保存于冷处。（２）细胞的生长状态 由于一些不清楚的原因，直接用贮存于-70┴冰冻培养基中的贮存原种搠种而进持培养的细菌，所得到的转化效率最高，不应使用在实验中的贮存原咱接种崦进持培养的细菌，所得到的转效率最高，不应使用在实验室中连续传代，贮存于４℃或贮存于室温的培养物。（３）玻璃和塑料器皿的清洁度 痕量的去污剂或其他化学物质的存在可能大大地降低细菌的论效率，所以最好拨出一批玻璃器皿专用于制备感受态细菌，而不作它用。这些玻璃器皿应用手洗刷，再灌满纯水（Ｍilli-Ｑ级或与其相当的级别），然后高压灭菌，临用前方把水倒掉。细心操作的话，几乎总是可以获得转化效率高的感受态细胞，每微克超螺旋ＤＮＡ可能得到5x107-1x108个转化菌落。然而甚至经验最为丰富的工作者也不可能保证持有必要用标准的螺旋质粒ＤＮＡ制品来检测每一批新的感受态细胞的转化效率。制备感受态细胞前，先制备一大批黧的螺旋质粒ＤＮＡ，分装成许多小份贮存于-70℃。这些标准制品可用来检验每一批新的感受态细胞的转化效率，并检查每一个实验的转化效率。设立这样一个阳性对照后，如果某一次实验得不到转化菌落，就可以根据对照的情况查明宣究竟是感受态细菌方面有庇漏，还是ＤＮＡ制品间有差异。分装的感受态细菌可在-70℃保存几个月而转效率无明显下降。１）用无菌铂丝直接蘸取冻存有大肠杆菌ＤＨl株（或ＤＨ５株、ＭＭ249株原种）（贮存于-70℃的冻培养基上，见附录Ａ），在SOB琼脂平板表面划线， 于37℃培养16小时。将冰冻的细菌融化，铂丝在冻存细菌原种的表面划过时，已带上足量的细菌，因此一管冻存细菌原种可使用多次。２）将４－５个分隔良好的菌落转移到１ml含20mmol/L MgSo４的SOB中，菌落直径为１－２mm。中速振荡使细菌分散，然后在1L锥瓶中用30-100ml含20mmol/LMgSO4的SOB稀释培养物。３）于37℃将细菌培养0.5-3.0小时，为达到高效转化，活细胞数务必少于108细胞/ml，可每隔20-30分钟测定ＯＤ600值来检测培养物的生长情况。在菌株与菌株之间，ＯＤ600值和每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测量特定大肠杆菌菌株的生长培养物在生长周期的不同时相的ＯＤ600值，并将各稀释度的培养物铺于无抗生素的ＬＢ琼脂平皿以计算每时相的活细胞数，从而使分光光度读数得到标化。４）在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管（Falcon 2070）中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至０℃。切记：下述所有步骤均需无菌操作。５）于４℃用Sorvall GS3转头（或与其相当的转头）以4000转/分离心10分钟， 回收细胞。６）倒出培养液，将管倒置１分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。７）用约20ml（每个50ml管）用冰预冷的转化缓冲液（对于TFB''见表1.3；对于FSB，可参见表1，4）轻轻振荡，重悬沉淀（若制备需立即使用的感受态细胞可用TFB:若制备需要贮存于－70℃的感受态细胞则用FSB），将重悬细胞冰浴10分钟。８）于４℃用Sorvall GS3转头或与其相当的转头）以4000转．分离心10分钟，回收细胞。９）倒出培养液，将管倒置１分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。10）用４ml（每个50ml管）用冰预冷的ＴＦＢ或ＦＳＢ轻轻振荡重悬沉淀。按步骤11）a给出的操作程序制备立即使用的感受态细胞，而步骤11）b制德贮存于-70℃留待以后使用的感受态细胞。11）a.新鲜感受态细胞的制备a）将140μl DnD溶液加到每一悬液的中心，立即轻轻旋转以混匀悬液，然后在冰上放置15分钟。DnD溶液二硫苏糖醇（DTT) 1.53gDMSO 9.0ML1mol/L乙酸钾（pH78.5) 100μl水至 10MLDnD溶液作可耐受人机溶剂的Millex SR膜（Millipore）过滤除菌，将DnD溶液分装成160μl小份放入0.5ml的无菌微量离心管中，密封管口，贮存于-20℃。DMSO的氧化产物，据推测可能是二甲硫醚，是转化的掏物。为避免这个问题，应购买质量最好的DMSO。应将所购试剂分装成10ml小份，放入无菌试管，密封管口，贮存于-70℃。每小份只用１次，用后弃去。１mol/L乙酸钾（pH7.5）的配法。b）每管再加140μlDnD溶液，轻轻旋转混匀之，将悬液置于冰上，再放15分钟。c）将小份悬液分装到冷却的无菌聚丙烯管（Falcon 2059''17x100mm）中，将管置于冰上。就大多数克隆方面的用途来说，50μl感受细胞悬液已绰绰有余。然而，如需要更大量的转化菌落（如构建cDNA文库），每小份感受态细胞的量可能需要加大些．加入ＤＮＡ后，于42℃短暂加热感受态细胞，这是一个关键步骤，务必以正确的升温速度使细胞加温到正确的温度。下面给出的所有时间和温度是用Falcon 2059型管获得的数据，其他类型的管未必可产生相同的结果。b.冻存的感受态细胞的制备a）每４ml重悬细胞加140 μl DMSO，轻轻旋转混匀之，将悬液置冰上15分钟。b）每份悬液再加140μl DMSO，轻轻旋转混匀之，重新放入冰浴中。c）迅速将悬液分装到冷却的无菌的微时离心管中，封紧管口，没入液氮中快速冰冻感受态细胞。贮存于-70℃备用。就大多数克隆方面的用途来说，50μl感受态细胞悬液已绰绰有余。然而，如需要更大量的转化菌落（如构建cDNA文库），每小份感受态细胞的量可能需要加大些。d）需要时，从-70℃冰箱中取出一管感受态细胞，把管握于手民主，融化细胞。细胞一经融化，立即把管转移至冰浴中，在冰上放置10分钟。e）用一冷却的无菌吸头把感受态细胞转移到冷却的无菌聚丙烯管中（Falcon2059''17x100mm）中，放置在冰浴上。加入ＤＮＡ后，于42℃短暂加热感受态细胞，这是一个关链步骤，务必以正确的升温速度使细胞如温到正确的温度。下面给出的所有时间和温度是用Falcon 2059试管获者的数据，其他类型的管未必可产生相同的结果。12）将ＤＮＡ加入到感受态细胞中，轻轻旋转几认混匀内容物。在冰上放置30分钟。为得到最佳结果，ＤＮＡ溶液的体积不应超过感受态细胞体积的５％。转化体的数量相对于所加入的ＤＮＡ量近妣例地增加，直至系统达到饱和，尽管感受态细胞在不同批次之间有一些差异，50μl感受态细胞通常可被约lng超粒ＤＮＡ所饱和。虽然再加ＤＮＡ也不影响转化体的总产量，但使用过多的ＤＮＡ将降低系统的效率（以每微克ＤＮＡ所获转化体的数量来衡量）。当所转化的ＤＮＡ很难得时（如用从相对难得的样品中提取mRNA而合成的cDNA），这就显得格外重要。为最大限度地提高转化菌落的数目，可把现有ＤＮＡ分置于几小份感受态细胞中，以期系统不致饱和。试验中一定包括下面的对照：a.加入已知量的标准超螺旋质粒ＤＮＡ制品的感受态细胞。b.完全不加质粒ＤＮＡ的感受态细菌。13）将管放入预加温到42℃的循环水浴中放好的试管加架上，恰恰放置90秒，不要摇动试管。14）快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却１－２分钟。15）每管加800μl ＳＯＣ培养基（见附录Ａ）。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育43分钏使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。为最大限度地提高转化效率，复苏期中应温放地摇动细胞（转速225转/分）。16）将适当体积（每个90m平板达200μl）已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO4和相应抗生素的ＳＯＢ琼脂培养基上。如培养物体积太小（〈10μl），可再加肉汤培养基，用一无菌的弯头玻棒轻轻地将转化的细胞涂到琼脂平表面。如在一个90mm平板上铺200μl以上的感受态细胞，应离心浓缩细胞（于室温用Sorvall SS34转头（或与其相当的转头）以4000转/分离心10分钟），然后用适量SOC轻轻重悬细胞。如用四环素抗性作为选择标记，全部的转化混合物可以铺在一个单独的平皿上（或铺在软琼脂中）。然而如选用氨苄青霉素抗性，则只能将一部分培养物（根据实验决定）铺在单独的平皿上，氨苄青霉素抗性菌落数的曾加与平皿上所加细菌数的增加并无线性比例关系，这可能是因为被抗生素杀死的细胞可释放生长抑制物质的缘故。\par 17）将平板置于室温直至液体被吸收。18）倒置平皿，于37℃培养，12-16小时后可出现菌落。如检查氨苄青霉素抗性，用转化细胞铺平板时密度应较低（每个90mm平板不超过104菌落），于37℃培养平板时不应超过20小时。氨苄青霉素抗性的转化体可将β－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围区域中的抗生素。这样，铺平板时懊度太高或培养时间太长都会导致出现对氨苄青霉敏感的卫星菌落。在造

【序号】：6【作者】： 林凯桑1范丽君1王思妤【题名】：温敏水凝胶负载脂源性干细胞对糖尿病大鼠皮肤创面血管新生影响的观察【期刊】：中国糖尿病杂志. 【年、卷、期、起止页码】：2017,25(05)【全文链接】：[url]https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CJFD&dbname=CJFDLAST2017&filename=ZGTL201705016&uniplatform=NZKPT&v=EA0CPV8r76bbb--4Qj1qW8mJCho712c0S7Rn_S1GBICG9z5E1xkrKRZnX-sKhVIn[/url]

【序号】：2【作者】： 贺译贤陈朗周国富【题名】：自体脂肪源性干细胞基质凝胶治疗慢性难愈性创面的临床疗效观察及炎症调节机制研究【期刊】：四川医学. 【年、卷、期、起止页码】：2021,42(10)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CJFD&dbname=CJFDLAST2021&filename=SCYX202110003&uniplatform=NZKPT&v=Es9rYcCUNnG-j1KYphaJAWZJThEhNp8aOg4UwG5RyKOqkdTgFtgXQhqKeePdqqjL

需要准备的器材：酒精喷壶、PBS缓冲液、胰酶、培养基、巴氏吸管、水浴锅、[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]、离心管、超净台、CO2培养箱、离心机等。然后我们要把我们准备的器材放入超净台，打开紫外杀菌灯灭菌，需要注意的是若培养的细胞对温度比较敏感，将培养基瓶子放入37℃的水浴锅中，使得培养基温度在37℃，再转移到超净台紫外灭菌，当然一般的细胞对培养基的温度不是很敏感，不用对培养基加温也是可以的。细胞培养间也需要紫外照射半小时左右。接下来小编就开始来操作了，全程严格无菌操作！ 1、紫外照射灭菌后，穿好灭菌服，戴好灭菌手套和口罩。 2、从CO2培养箱中取出细胞培养瓶，用酒精喷壶在培养瓶表面喷洒75%酒精消毒，转移培养瓶到超净台。 3、打开盖子，轻轻吸出旧的培养液，用巴氏吸管加入适量PBS缓冲液洗涤1-2次，弃去PBS缓冲液。 4、可用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]加入2-3ml胰酶，“十字”晃动，使胰酶充分接触细胞。 5、将加入胰酶的细胞培养瓶转移到倒置显微镜载物台，镜下观察细胞消化情况，当细胞变圆且大量脱落时，准备终止消化，用75%的酒精喷洒培养瓶表面，转移到超净台 6、用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]加入等量含血清培养基，终止消化。[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]充分吹打，使细胞能够完全脱落。 7、将培养瓶中混合液体转移至离心管中，配平，离心5分钟左右。 8、离心好后，用酒精喷壶喷洒离心管表面，转移进超净台，打开盖子，将上清液倒入废液缸。 9、加入适量体积含血清培养基，用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]或巴氏吸管轻轻吹打，制成细胞悬液。 10、将细胞悬液分装进3个洁净灭菌培养瓶，加入适量培养基，盖好盖子 11、将分装好的培养瓶置于倒置显微镜载物台，观察细胞情况，细胞应保证一定数量，数量太少会影响生长情况。 12、在培养瓶上做记号，注明传代时间，细胞种类，操作人员等信息。在放入CO2培养箱之前应再次用酒精喷一喷培养瓶表面，然后整理操作台，用75%酒精擦拭超净台台面，清理废液和垃圾。

1677年荷兰Antonie van Leeuwenhoek （1632－1723）显微镜学家、微生物学，用简单显微镜观察到动物的“精虫”（细胞）。1665年英国Hooke Robert（1635-1703）博物学家提出细胞和细胞结构的概念。1827年贝尔发现哺乳类的卵子，对细胞本身进行认真的观察。1838年描施莱登述了细胞是在一种粘液状的母质中，经过一种像是结晶样的过程产生的，并且把植物看作细胞的共同体。在他的启发下施万坚信动、植物都是由细胞构成的，并指出二者在结构和生长中的一致性。1845年德国动物学家西博尔德（1804-1885）断定原生动物都是单细胞的。1852年德国病理学家菲尔肖（1821-1902）在研究结缔组织的基础上提出“一切细胞来自细胞”的名言，并且创立了细胞病理学。1867年德国植物学家霍夫迈斯特对植物，分别比较详细地叙述了间接分裂。1873年施奈德对动物，分别比较详细地叙述了间接分裂。1875年德国植物学家施特拉斯布格首先叙述了植物细胞中的着色物体，而且断定同种植物各自有一定数目的着色物体；1880年巴拉涅茨基描述了着色物体的螺旋状结构，翌年普菲茨纳发现了染色粒。1882年德国细胞学家弗勒明在发现了染色体的纵分裂之后提出了有丝分裂这一名称以代替间接分裂。施特拉斯布格把有丝分裂划分为直到现在还通用的前期、中期、后期、末期；他和其他学者还在植物中观察到减数分裂，经过进一步研究终于区别出单倍体和双倍体染色体数目。1882年捷克动物生理学家浦肯野提出原生质的概念。1888年瓦尔代尔才把核中的着色物体正式命名为染色体。1891年德国学者亨金在昆虫 的精细胞中观察到 X染色体。1902年史蒂文斯、威尔逊等发观了 Y染色体。1900年重新发现孟德尔的研究成就后，遗传学研究有力地推动了细胞学的进展美国遗传学家和胚胎学家摩尔根（1866—1945）研究果蝇 的遗传，发现偶尔出现的白眼个体总是雄性；结合已有的、关于性染色体的知识，解释了白眼雄性的出现，开始从细胞解释遗传现象，遗传因子可能位于染色体上。细胞学和遗传学联系起来，从遗传学得到定量的和生理的概念，从细胞学得到定性的、物质的和叙述的概念，逐步产生出细胞遗传学。此外，发现了辐射现象、温度能够引起果蝇突变之后，因突变的频率很高更有利于染色体的实验研究。辐射之后引起的各种突变，包括基因的移位、倒位及缺失等都司在染色体中找到依据。利用突变型与野生型杂交，并且对其后代进行统计处理可以推算出染色体的基因排列图。广泛开展的性染色体形态的研究，也为雌雄性别的决定找到细胞学的基础。20世纪40年代后，电子显微镜得到广泛使用，标本的包埋、切片一套技术逐渐完善，才有了很大改变。开始逐渐开展了从生化方面研究细胞各部分的功能的工作，产生了生化细胞学。

注意事项： 1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。2.安装蔡式滤器时通常使用孔径 0.45 微米 和 0.22 微米滤膜各一张，放置位置为 0.45 的位于 0.22 微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。 3.配制 RPMI1640 培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液 PH 值最终为 7.2 ，可在配制时调 PH 至 7.4 。 细胞培养的一般过程 一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。R 理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置 4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。 三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的 PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和 CO2浓度也要定时检查。一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。四、冻存及复苏为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度?－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入 37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

利用活细胞成像工作站进行细胞和基因的功能研究，是生物医学研究的最新趋势。固定细胞观察仅能提供固定瞬间细胞的静态信息，无法反映细胞在正常生理生化条件下的状态活细胞观察，对处于正常生理状况下的细胞进行全程扫描和记录，获得其连续、全面、动态过程。由于其显示的正常细胞动态的活动过程，很容易发现和确定细胞间相互作用和信号传导的过程，以及在活细胞水平上的生物分子间的相互作用，不仅可以解决长期以来悬而未解的问题，更为未来的研究提出新的问题，指出新的方向。