蛋白结构分析

生物质谱在糖蛋白结构分析中的应用项目完成人：桑志红 蔡 耘项目完成单位：国家生物医学分析中心 随着人们对糖蛋白参与生命活动机理的日益深入了解，对天然糖蛋白及重组糖蛋白类药物的分析越来越受到重视。重组糖蛋白类药物的质量控制更是直接关系到药物的疗效及至人类的健康。九十年代以来，随着带有反射功能的基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和纳升电喷雾串联质谱（nano-ESI-Q-TOF）等具有软电离方式的现代质谱 技术的发展，质谱以其高灵敏度和强有力的分析混合物的能力，提供了生物大分子的分子量、序列、一级结构信息以及结构转换、修饰等方面的信息，使糖基化分析有了重要的进展。 通常研究糖蛋白的方法是把蛋白链上的寡糖切下来，分别研究蛋白部分和寡糖部分的结构，因此无法研究与两部分共同相关的结构问题，也不能区分不同糖基化位点上切下来的寡糖。自90年代初，国外有人开始用质谱法研究糖蛋白的结构，同时描述了各个位点的不均一性。我们用建立的现代生物质谱技术研究糖蛋白一级结构的方法，将其应用与基因重组糖蛋白的结构分析。为糖蛋白结构分析及基因重组糖蛋白类药物的质量控制提供新的手段。一、 生物质谱研究糖蛋白结构方法的建立实验所用仪器为：1.德国BRUKER 公司的REFLEXIII型基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱仪，N2激光器，波长337nm，线性飞行距离150cm，加速电压2kv。2.英国Micromass 公司Q-TOF型电喷雾串联质谱仪。源温80°C，气体流速40L/h，枪头电压650V，检测频率2.4S，氩气碰撞池压力6*10-5mbar。1. 基质的选择，在MALDI-TOF-MS分析中，基质起着相当重要的作用。不同的基质对不同类的物质响应不同，a-氰基-4-羟基肉桂酸用于测定糖蛋白核糖核酸酶B效果相对较好。2. 糖蛋白分子量的测定，糖蛋白核糖核酸酶B由124个氨基酸组成，在34位Asn处连有一个高甘露糖型N-糖链。由于糖链的微不均一性，与普通蛋白质及核酸不同，其分子离子峰在MALDI-TOF-MS 质谱图上表现为一簇峰，各峰之间约相差一个糖基。正是由于这种微不均一性，使得其分子离子峰变宽，灵敏度降低。糖链分子量越大，峰越宽，灵敏度越低，所以一般只有糖链较短，蛋白的质量不太大的糖蛋白才能测定其平均分子量。用MALDI-TOF可直接测定糖蛋白核糖核酸酶B的平均分子量为 15208.6Da。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/03/201103211511_284179_1604317_3.jpg3. 糖含量的测定，采用O聚糖酶及内糖苷键酶F分别作用于核糖核酸酶 B，只有内糖苷键酶F能够是其分子量发生变化，表明核糖核酸酶B分子中不存在O-连接糖链存在着N-连接糖链。内糖苷键酶F切断N-糖链五糖核心最内侧的GlcNAc-GlcNAc糖苷键，得到含一个GlcNAc的肽链，减去GlcNAc，可以计算出准确的肽链分子量T=13695.6，与糖蛋白平均分子量之差为糖链的平均分子量G=1513.4，平均糖含量为：(糖链大小/糖蛋白分子量)×100%=9.95%。4. 糖基化位点的确定，研究糖基化类型及糖基化位点的策略：采用蛋白酶酶解与糖苷内切酶酶解相结合的方法，通过酶切前后含糖肽片的位移，结合网上数据库检索，可以确定糖基化类型和糖基化位点。以不同类型的糖苷内切酶作用于糖蛋白（N-糖苷键酶或O-糖苷键酶），在MALDITOF-MS 上观察其质量的变化，可以直接确定糖蛋白中是否含有响应类型的糖链，这是我们确定糖蛋白中糖苷键类型的基础。我们采用先将核糖核酸酶B还原烷基化，加Glu-C酶切，产物再用内糖苷肩酶F酶切，可观察到含糖肽段出现位移，将核糖核酸酶B的肽质量指纹图进行数据库检索，证实发生位移的肽段中含有N-糖链特异连接位点，由此确定34位Asn为糖基化位点。另外我们采用内糖苷键酶F及肽-N-聚糖酶F两种酶进行差位酶切法对含糖肽段进行验证，两种酶酶切后分子离子峰的差值除以GlcNAc的质量，结果就是N-糖基化位点的个数5. 质谱测定氨基酸序列， 我们对核糖核酸酶B肽质量指纹谱中的含糖肽段进行了串联质谱测定，首先在一级质谱图中选择离子4972.23，在串联质谱的碰撞活化室以氩气与其碰撞产生碎片，从碎片的质荷比推算出此肽片中的一段氨基酸序列，检索结果为核糖核酸酶B，从而判断其理论序列是否一致。6. 糖链结构的研究，凝集素对糖肽的亲和提取，进一步分析糖肽序列及糖链结构的关键是含糖肽段的提取。核糖核酸酶B中糖链为高甘露糖型，我们选用对其有特异性吸附的伴刀豆球蛋白对其进行提取利用这种简捷的亲和质谱的方法，对糖肽段进行了分析。建立了亲和质谱分析糖肽类物质的方法，为今后糖肽序列分析及糖链结构分析奠定了基础。二、基因重组糖蛋白人促红细胞生成素（rhEPO）的结构分析。 利用以上建立的方法，我们对样品重组人促红细胞生成素进行了分析，断定此样品为非完全糖基化，样品中只存在N-连接的糖链，无O-糖链。应用酶切法用肽-N-聚糖酶处理后，得到两个含糖肽段，进行数据库检索，测得38位及83位为N-糖基化位点，与文献报道相符，结果可靠。因此，该项课

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姓 名：林颢霆时 间：2021/7/8题 目：冰结构蛋白的性质、应用及限量标准[align=center][font='times new roman'][size=18px][color=#000000]冰结构蛋白的性质、应用及限量标准[/color][/size][/font][/align][align=left][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]摘[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]要[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]：[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]冰结构蛋白（ISP）因其能影响冰晶生长规律的特性，被广泛用于食品添加领域中。[/color][/size][/font] [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]本文主要探讨总结冰结构蛋白的分类、抗冻机制、应用、限量、标准及检测方法。[/color][/size][/font][/align][align=left][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]关键词[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]：[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]冰结构蛋白；食品添加剂；抗冻机制[/color][/size][/font][/align][align=left]1、 [/align][align=left]2、 [font='times new roman'][size=16px][color=#000000]冰结构蛋白的性质和应用[/color][/size][/font][/align][align=left]1. [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]冰结构蛋白的基本性质[/color][/size][/font][/align][align=left][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]冰结构蛋白（Ice[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]Structuring[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]proteins，ISP），又称抗冻蛋白或热滞蛋白，是一种能防止冰结晶，控制其生长，改变其生长规律、速度、冰芯和冰晶在冻结或自然生长过程中的形状和大小，抑制重结晶的天然蛋白质。它们可以非依数性（跟其浓度无关）降低溶液的凝固点，而对熔点的影响很小，从而导致溶液的凝固点和熔点之间的差异，此差值称为热滞活度（thermal[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]hysteresis[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]activity，THA）。ISP存在于动物（昆虫、鱼类等）、植物（胡萝卜、冬小麦草、桃树等）、细菌和真菌中，保护生物有机体免受低温冻害。[/color][/size][/font][/align][align=left]2. [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]冰结构蛋白的分类[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000][1][/color][/size][/font][/align][align=left][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]从20世纪70年代首次从鱼类的血液中提取出冰结构蛋白以来，经过几十年的研究发展，人们相继从植物，昆虫，细菌，真菌中发现了具有同样功能的蛋白质，它们在组成和结构上各不相同，并在基因序列上也没有同源性，从而造就了冰结构蛋白的多样性和复杂性。鱼类中冰结构蛋白主要分为6大类，分别是ISGP（Ice Structuring Glycoprotein）、ISPⅠ、ISPⅡ、ISPⅢ、ISPⅣ、Hyperactive-ISP。目前研究最多的昆虫ISP基本都是从黄粉虫（[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]Tenebrio Molitor[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]）、毛虫（[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]Dendroides Canadensis[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]）、枞色卷蛾（[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]Choristoneura Fumiferana[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]）、美洲脊胸长椿（[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]Oncopeitus Fasciatus[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]）等4种昆虫中分离纯化的。昆虫ISP是目前已知热滞活性最高的ISP，可达5℃～10℃。植物中冰结构蛋白的研究比较晚，但是其来源广泛易得，如胡萝卜，女真叶，冬小麦等都可提取冰结构蛋白，并且植物性的冰结构蛋白在应用中也容易为人们所接受，因此对植物性冰结构蛋白的研究越来越多，如江南大学的黄卫宁等主要就是研究植物性冰结构蛋白的提取以及在冷冻面食中的应用。植物的冰结构蛋白的抗冻活性不高，热滞活性略低于极地鱼类的冰结构蛋白活性。[/color][/size][/font][/align][align=left][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]从细菌中分离提纯得到的纯冰结构蛋白研究很少。从南极洲的细菌中有6种细菌可分离出ISP，从菌株[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]Moraxella[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]分离出的ISP为脂蛋白，是第一次报道的冰结构脂蛋白；[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]E.coli[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]的ISP分子量大约为7.4ku，称为CS74，含大量的亲水基团；研究者还在加拿大北极地区的一种根瘤菌（[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]Pseudomonasputida [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]GR 12－2）中发现了一种冰结构蛋白。真菌中冰结构蛋白的研究也非常少，有报道称冬菇（[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]Flammulinavelupites[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]）和牡蛎菇（[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]Pleurotusostreatus[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]）中存在冰结构蛋白。[/color][/size][/font][/align][table][tr][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]种类[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]来源[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]分子量（kD）[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]特点[/color][/size][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]ISGP[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]鱼类[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]2.6-33.7[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]糖基是主要作用基团[/color][/size][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]ISPI[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]鱼类[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]3.3-4.5[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]只能在细胞中作用[/color][/size][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]ISPII[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]鱼类[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]11-24[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]可能需要Ca[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]2+[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]稳定[/color][/size][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]ISPIII[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]鱼类[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]6.5-14[/color][/size][/font][/align][/td][td][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]ISPIV[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]鱼类[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]~12.3[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]富含谷氨酸[/color][/size][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]Hyperactive-ISP[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]鱼类[/color][/size][/font][/align][/td][td][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]活性远强于ISPI[/color][/size][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]黄粉虫ISP[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]昆虫[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]8.4[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]热滞活性远高于鱼类ISP（10-100倍）[/color][/size][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]毛虫ISP[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=14px][color=#000000]昆虫[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=14px][color=#000000]8.7[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]耐高温（＞100℃）[/color][/size][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]枞色卷蛾ISP[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=14px][color=#000000]昆虫[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=14px][color=#000000]9.0[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]抗冻活性高[/color][/size][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]胡萝卜ISP[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=14px][color=#000000]植物[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=14px][color=#000000]36.8[/color][/size][/font][/align][/td][td][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]黑麦草ISP[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]植物[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]13[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]耐高温（＞100℃）[/color][/size][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]沙东青ISP[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]植物[/color][/size][/font][/align][/td][td][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]形式多样、协同作用[/color][/size][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]PCA60[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]植物[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]50[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]强冰晶修饰能力[/color][/size][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]细菌ISP[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]细菌[/color][/size][/font][/align][/td][td][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]研究很少[/color][/size][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]真菌ISP[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]真菌[/color][/size][/font][/align][/td][td][/td][td][align=center][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]研究很少[/color][/size][/font][/align][/td][/tr][/table][align=left]3. [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]冰结构蛋白的抗冻机制[/color][/size][/font][/align][align=left][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]冰结构蛋白主要通过热滞效应、重结晶抑制效应来发挥它的抗冻活性。热滞效应是指冰结构蛋白可以非依数性的降低溶液的冰点，而对其熔点基本没有影响，从而使冰点与熔点之间出现一差值，这个差值的大小就反映了冰结构蛋白的热滞活性，差值越大活性越高。重结晶抑制效应是指冰结构蛋白可以抑制冰晶重结晶，而重结晶是指由于温度波动，已形成的冰晶颗粒进行重新分配，大的冰晶越来越大，小的越小。[/color][/size][/font][/align][align=left][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]冰结构蛋白的抗冻机制主要分为吸附抑制模型、结构互补模型（受体-配体模型）、晶格匹配模型、偶极子-偶极子模型、晶格占有模型。冰结构蛋白种类繁多、同源性小且分子量差异大，故实际抗冻机制是复杂且多样的。[/color][/size][/font][/align][align=left][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]吸附抑制模型[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000][2][/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]指出，冰结构蛋白可以吸附到特定的冰晶c轴表面，通过Kelvin效应抑制冰晶在α方向的生长，从而减缓冰晶生长速率，以修饰冰晶形态。吸附抑制模型尚不能完整解释冰结构蛋白抑制冰晶生长的机理，即冰结构蛋白和冰晶间不仅有相互作用关系。结构互补模型指出[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000][3][/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]，冰结构蛋白和冰晶表面通过不可逆的疏水作用和范德华力结合，从而法绘抗冻活性。[/color][/size][/font][/align][align=left]4. [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]冰结构蛋白的安全性研究[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000][4][5][/color][/size][/font][/align][align=left]（1） [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]氨基酸序列分析[/color][/size][/font][/align][align=left][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]BLAST（局部序列比对基本检索工具）和PIR-NREF（蛋白质信息库）测序结果表明，冰结构蛋白与抑制过敏原无同源性。[/color][/size][/font][/align][align=left]（2） [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]IgE和组织胺含量测定[/color][/size][/font][/align][align=left][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]人体中的免疫球蛋白E（IgE）的含量一般很低，且嗜碱性粒细胞一般不会释放组织胺。而过敏性物质可以导致IgE和组织胺的含量增加。因此，通过测定IgE和组织胺的浓度变化，可以检验待测物质是否是过敏原。放射免疫吸附法（RAST）表明添加冰结构蛋白后不会造成IgE含量的上升和组织胺的释放，因此冰结构蛋白不会引起明显的过敏反应。[/color][/size][/font][/align][align=left]5. [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]冰结构蛋白在食品中的应用[/color][/size][/font][/align][align=left]（1） [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]冰结构蛋白在冰淇淋生产中的应用[/color][/size][/font][/align][align=left][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]所有冰淇淋行业仍然面临如何减少冷冻过程中的冰晶的生长和重结晶的问题，尤其对于中低端冰淇淋。冰结构蛋白的研究让人们看到希望。ISP可以结合冰晶表面，防止冰晶形成，控制其生长，改变生长规律，生长速度和形状和大小，并能抑制重结晶，从而避免产生大冰晶而影响口感，并能提高其稳定性。2006年，我国首次在国家食品安全标准GB2760中表明，可以冰结构蛋白作为新型食品添加剂添加到冷冻食品中。国际上，目前只有联合利华将冰结构蛋白应用到冰淇淋中。[/color][/size][/font][/align][align=left]（2） [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]冰结构蛋白在冷冻面团生产中的应用[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000][6][/color][/size][/font][/align][align=left][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]冷冻面团技术是一门新的烘焙食品加工技术，面团经过长时间的冷藏，面团的品质会下降，如醒发时间延长，比容减小等。添加0.5%ISP的面团可以有效的缩短面团的醒发时间，增大面包比容而减小面包硬度。扫描电镜结果表明，添加ISP的面团经长时间冻藏后，仍能保持其面筋网络结构。[/color][/size][/font][/align][align=left]（3） [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]冰结构蛋白在肉制品生产中的应用[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000][7][/color][/size][/font][/align][align=left][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]肉制品经过反复冷冻，由于冰晶不断集聚变大，会对肉制品的组织产生破坏，从而使汁液外漏，营养流失。而加了ISP的肉制品或者在宰杀前24h将0.01mg/mL的ISP注射入待宰羔羊体内，均可有效地减少渗水和冰晶的形成，从而保持其原有的组织结构，减少营养流失。这可能是因为ISP使部分融化的冰晶缓慢地渗入到细胞内，在蛋白质颗粒周围重新形成水化层，使汁液流失减少，保持解冻食品的营养成分和原有风味。[/color][/size][/font][/align][align=left]（4） [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]冰结构蛋白在农产品生产中的应用[/color][/size][/font][/align][align=left][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]随着各种ISP的基因测序的进行，研究者可通过基因工程技术将ISP的基因导入植物体内，并在体内表达，使植物获得抗冻活性，选育出转基因的抗冻植物，从而扩大植物的种植范围。[/color][/size][/font][/align][align=left]3、 [font='times new roman'][size=16px][color=#000000]冰结构蛋白的限量、检测和标准[/color][/size][/font][/align][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]根据食品安全国家标准制（修）订项目委托协议书（2013年）（spaq-2013-06），将冰结构蛋白的限量、标准及检测方法总结至下表。[/color][/size][/font][table][tr][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]项目[/color][/size][/font][/td][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]标准[/color][/size][/font][/td][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]检测[/color][/size][/font][/td][/tr][tr][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]感官[/color][/size][/font][/td][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]浅棕色液体[/color][/size][/font][/td][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]-[/color][/size][/font][/td][/tr][tr][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]ISP含量（g/L）[/color][/size][/font][/td][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]≥5[/color][/size][/font][/td][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]HPLC或MS[/color][/size][/font][/td][/tr][tr][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]灰分（%）[/color][/size][/font][/td][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]≤2[/color][/size][/font][/td][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]GB5009.4[/color][/size][/font][/td][/tr][tr][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]pH[/color][/size][/font][/td][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]2.5-3.5[/color][/size][/font][/td][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]pH计[/color][/size][/font][/td][/tr][tr][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]铅（mg/L）[/color][/size][/font][/td][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]≤2[/color][/size][/font][/td][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]GB5009.75[/color][/size][/font][/td][/tr][tr][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]菌落总数（CFU/mL）[/color][/size][/font][/td][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]≤3000[/color][/size][/font][/td][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]GB4789.2[/color][/size][/font][/td][/tr][tr][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]大肠菌群（CFU/mL）[/color][/size][/font][/td][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]≤10[/color][/size][/font][/td][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]GB4789.3[/color][/size][/font][/td][/tr][tr][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]霉菌和酵母菌（CFU/mL）[/color][/size][/font][/td][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]≤100[/color][/size][/font][/td][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]GB4789.15[/color][/size][/font][/td][/tr][tr][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]沙门氏菌（25mL）[/color][/size][/font][/td][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]不得检出[/color][/size][/font][/td][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]GB4789.4[/color][/size][/font][/td][/tr][tr][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]单核细胞增生李斯特氏菌（25mL）[/color][/size][/font][/td][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]不得检出[/color][/size][/font][/td][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]GB4789.30[/color][/size][/font][/td][/tr][tr][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]蜡样芽孢杆菌（CFU/mL）[/color][/size][/font][/td][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]≤100[/color][/size][/font][/td][td][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]GB4789.14[/color][/size][/font][/td][/tr][/table]1. [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]ISP含量测定[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]在参考色谱条件和质谱条件下，与标准系列的峰面积比对以测定其含量。在相同仪器条件下，应保证ISP的HPLC流出峰位置（14.84min）与质谱分布基本一致。其标准LC图和MS图可见图1和图2。[/color][/size][/font][align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/07/202107251425059525_8272_1608728_3.png[/img][/align][align=center][font='times new roman'][color=#000000]图1. ISP参考液相色谱曲线[/color][/font][/align][align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/07/202107251425063031_1973_1608728_3.png[/img][/align][align=center][font='times new roman'][color=#000000]图2. ISP参考质谱图[/color][/font][/align]2. [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]灰分测定（GB5009.4）[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]灰分是食品经灼烧后残余的无机物质。灰分数值用灼烧、称重后计算得出。总灰分的基本测定步骤包括：坩埚预处理、加热灰化、冷却干燥、称量至Δm≤0.5mg。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]预处理方法为：取大小适宜的石英坩埚或瓷坩埚置高温炉中，在550℃±25℃下灼烧30min，冷却至200℃左右，取出，放入干燥器中冷却30min，准确称量。重复灼烧至前后两次称量相差不超过0.5mg为恒重。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]测定方法为：称取试样后，加入1.00mL乙酸镁溶液（240g/L）或3.00mL乙酸镁溶液（80g/L），使试样完全润湿。放置10min后，在水浴上将水分蒸干，在电热板上以小火加热使试样充分炭化至无烟，然后置于高温炉中，在550℃±25℃灼烧4h。冷却至200℃左右，取出，放入干燥器中冷却30min，称量前如发现灼烧残渣有炭粒时，应向试样中滴入少许水湿润，使结块松散，蒸干水分再次灼烧至无炭粒即表示灰化完全，方可称量。重复灼烧至前后两次称量相差不超过0.5mg为恒重。[/color][/size][/font]3. [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]铅含量测定（GB5009.75）[/color][/size][/font]（1） [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]双硫腙比色法：试样加入柠檬酸氢二铵、氰化钾和盐酸羟胺消除铁、铜、锌离子的干扰，在pH8.5-9.0时，铅离子与双硫腙形成红色络合物，三氯甲烷萃取后比色测定。[/color][/size][/font]（2） [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]石墨炉[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Wp][color=#3333ff]原子吸收光谱[/color][/url]法（GFAAS）：试样灰化或消解后，测定GFAAS下的283.3nm共振线，与标准系列比对以确定铅含量。[/color][/size][/font]（3） [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]火焰[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Wp][color=#3333ff]原子吸收光谱[/color][/url]法[/color][/size][/font]（4） [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]电感耦合等离子质谱法（[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICP-MS[/color][/url]）[/color][/size][/font]4. [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]菌落总数的测定（GB4789.2）[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]样品稀释后平板培养，计数各平板培养结果的平均值。[/color][/size][/font]5. [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]大肠菌群总数的测定（GB4789.3）[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]大肠菌群是一定条件下能发酵产生乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢菌。一般采用MPN法和平板计数法进行菌群的定量。最可能数法（MPN）是根据大肠菌群未生长的最低稀释度和可生长的最高稀释度推算MPN的方法。平板计数法的原理则是大肠菌群产酸可与指示剂产生显色反应。因不同菌群总数的测定方法类似，下仅以大肠菌群为例，说明菌群总数测定的方法。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]MPN法的检验程序如下（流程图可见图3）：[/color][/size][/font]（1） [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]样品稀释[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min~10000r/min均质1min~2min，或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min~2min，制成1∶10的样品匀液。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇，充分混匀，制成1∶10的样品匀液。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]样品匀液的pH应在6.5~7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]用1mL无菌吸管或微量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]吸取1∶10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。[/color][/size][/font]（2） [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]初发酵试验[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验（证实试验），如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。[/color][/size][/font]（3） [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]复发酵试验[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。[/color][/size][/font]（4） [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]MPN报告[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]平板计数法的检验程序如下（流程图可见图4）：[/color][/size][/font]（1） [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]样品稀释（同MPN法）[/color][/size][/font]（2） [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]平板计数[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]选取2个~3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。及时将15mL~20mL融化并恒温至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL~4mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±1℃培养18h~24h。[/color][/size][/font]（3） [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]平板菌落数的选择[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]选取菌落数在15CFU~150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落（如菌落直径较典型菌落小）。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大，最低稀释度平板低于15CFU的记录具体菌落数。[/color][/size][/font]（4） [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]证实试验[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分别移种于BGLB肉汤管内，36℃±1℃培养24h~48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。[/color][/size][/font][align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/07/202107251425064507_2971_1608728_3.png[/img][/align][align=center][font='times new roman']图3. 大肠菌群MPN计数法检验程序[/font][/align][align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/07/202107251425068255_3471_1608728_3.png[/img][/align][align=center][font='times new roman']图4. 大肠菌群平板计数法检验程序[/font][/align]6. [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]霉菌和酵母菌总数的测定（GB4789.15）[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]霉菌和酵母菌总数的检验程序如图5。主要步骤包括稀释、培养和平板计数。[/color][/size][/font][align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/07/202107251425069095_1844_1608728_3.png[/img][/align][align=center][font='times new roman'][color=#000000]图5. 霉菌和酵母菌总数检验程序[/color][/font][/align]7. [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]沙门氏菌总数的测定（GB4789.4）[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]沙门氏菌定性检验程序见图6。主要步骤分为预增菌、增菌、分离、生化试验、血清学鉴定、血清学分型。[/color][/size][/font][align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/07/202107251425069945_2459_1608728_3.png[/img][/align][align=center][font='times new roman'][color=#000000]图6. 沙门氏菌总数检验程序[/color][/font][/align]8. [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]单核细胞增生李斯特氏菌总数的测定（GB4789.30）[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]单核细胞增生李斯特氏菌总数的检验程序如图7-9，分别为其定性检验程序、平板计数程序和MPN法测量程序。主要步骤可分为增菌、分离、初筛、鉴定（染色、动力试验、生化鉴定、溶血鉴定）。[/color][/size][/font][align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/07/202107251425070794_5318_1608728_3.png[/img][/align][align=center][font='times new roman'][color=#000000]图7. 单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序[/color][/font][/align][align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/07/202107251425071595_9945_1608728_3.png[/img][/align][align=center][font='times new roman']图8. 单核细胞增生李斯特氏菌平板计数程序[/font][/align][align=center][/align][align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/07/202107251425072416_9057_1608728_3.png[/img][/align][align=center][font='times new roman']图9. 单核细胞增生李斯特氏菌MPN计数程序[/font][/align]9. [font='times new roman'][size=13px][color=#000000]蜡样芽孢杆菌总数的测定（GB4789.14）[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]蜡样芽孢杆菌总数的检验程序见图10。[/color][/size][/font][align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/07/202107251425073081_3186_1608728_3.png[/img][/align][align=center][font='times new roman'][color=#000000]图10. 蜡样芽孢杆菌总数检验程序[/color][/font][/align][align=left][/align][align=left][/align][align=left][/align][align=left][/align][align=center][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]参考文献[/color][/size][/font][/align][align=left][/align][table][tr][td][align=left][font='times new roman'][size=13px][color=#000000][1][/color][/size][/font][/align][/td][td][align=left][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]樊凯凯，刘爱国，陈东等.冰结构蛋白及其应用研究[J].食品研究与开发，2012（09）:221-225.[/color][/size][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=left][font='times new roman'][size=13px][color=#000000][2][/color][/size][/font][/align][/td][td][align=left][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]RAYMOND JA, DEVRIESA L. Adsorption inhibition as amechanism of freezing resistance in polar fishes[J].Proc Natl Acad Sci,1977,74(6): 2589-2593[/color][/size][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=left][font='times new roman'][size=13px][color=#000000][3][/color][/size][/font][/align][/td][td][align=left][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]Jia Z,Davies P L.Antifreeze proteins:an unusual receptor-ligand interaction[J].Trends Biochem Sci,2002,27(2):101-106[/color][/size][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=left][font='times new roman'][size=13px][color=#000000][4][/color][/size][/font][/align][/td][td][align=left][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]Baderschneider B, Crevel R W R, Earl L K, et al.Sequence analysis and resistance to pepsin hydrolysis as part of an assessment of the potential allergenicity of Ice Structuring Protein Type III HPLC 12 [J]. Food and chemical toxicology,2002,40:965-978[/color][/size][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=left][font='times new roman'][size=13px][color=#000000][5][/color][/size][/font][/align][/td][td][align=left][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]C Bindslev -Jensen, E Sten, L K Earl,et al. Assessment of the potential allergenicity of ice structuring protein type III HPLC 12 using the FAO/WHO 2001 decision tree for novel foods[J]. Food and chemical toxicology,2003,41:81-87[/color][/size][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=left][font='times new roman'][size=13px][color=#000000][6][/color][/size][/font][/align][/td][td][align=left][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]黄卫宁，邹奇波，潘振兴，等.冰结构蛋白对长期冻藏冷冻面团抗冻发酵特性与超微结构的影响[J].食品科学，2008，29（08）:39-42[/color][/size][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=left][font='times new roman'][size=13px][color=#000000][7][/color][/size][/font][/align][/td][td][align=left][font='times new roman'][size=13px][color=#000000]Warren C J,Mueller G M,McKown RL.Ice Crystal Growth Suppression Polypeptides and Methods of Preparation [P].US Patent 5,1992,118: 792-794[/color][/size][/font][/align][/td][/tr][tr][td][/td][td][/td][/tr][/table][align=left][/align][align=left][/align][align=left][/align][align=left][/align][align=left][/align]