细菌核酸提取

因需求，需要购买一台多重食源性致病菌核算系统，很急切，有此宝别藏了，来电15867843562，曹

细菌DNA的提取2006-10-24 17:19这里提供的是由Marmur于1961年建立，经Dale等人简化和发展，此方法略加修改后可用于其他细菌种类。主要原理是：采用去垢剂破碎细菌细胞，酚－氯仿萃取蛋白，使用核糖核酸酶和蛋白酶K进行进一步的纯化，所提取的DNA无RNA和蛋白质污染，可用于限制性内切酶消化，分子克隆。⑴材料①20倍SSC缓冲液：3mol/l NaCl; 0.3mol/l 醋酸钠；pH 7.0(高压灭菌后，4摄氏度保存可长期使用)②酚/氯仿（1：1）：一般市售的酚需要重蒸处理，市售的酚常含有杂质而呈粉色和淡黄色，需要重蒸二次，收集沸点160℃部分，小瓶分装，瓶内空腔充氮气，－20℃密封保存，以免氧化，用前从冰箱中取出，68℃蒸馏水饱和，加入8—羟基喹啉（100g酚加0.1g），酚变为黄色。8—羟基喹啉是抗氧化剂，并能部分抑制核糖核酸酶，含8—羟基喹啉的酚用等体积1.0mol/L pH 8.0Tris 缓冲液抽提，再用0.1mol/L pH 8.0含0.2％β－巯基乙醇的Tris缓冲液抽提数次，酚溶液的pH应大于7.6。此酚溶液在平衡缓冲液覆盖下4℃可保存一个月，纯化和制备酚溶液都要带手套，以免损伤皮肤。③核糖核酸酶：无DNA酶污染，将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/LTris－Cl(pH 7.5)15mmol/L Nacl 溶液中，浓度为10mg/ml.于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装后于－20℃保存。④蛋白酶K ⑤TES缓冲液：10mmol/L Tris-HCl, pH 8.0; 10mmol/L NaCl;1mmol/l EDTA⑵方法①取单菌落接种于5mlLB培养液中，37℃振荡培养过夜。（使用试管）②将上述菌液接种于200mlLB培养液中，37℃振荡培养过夜。（使用500ml或1000ml三角瓶）③离心，收集沉淀（5000r/m,10分钟）④将沉淀悬浮于20ml 20倍SSC缓冲液中，混匀。⑤加入200mg SDS，室温下振荡过夜，使细菌细胞充分裂解，裂解液呈粘稠状⑥加入等体积的酚/氯仿溶液，温和地混匀，细心地回收上层水相（注意不要触及二相之界面），重复萃取三次⑦加入2倍体积无水乙醇，此时可见到絮状DNA沉淀或用玻璃棒绕取收集⑧将DNA溶于15ml 2倍SSC溶液中，加入核糖核酸酶（最终浓度50ug/ml），37℃保温1小时⑨加入蛋白酶K（50ug/ml）,继续保温1小时⑩加入等体积苯酚萃取一次，在回收的水相中加入2.5倍体积的无水乙醇，－20℃静止过夜25000g，4℃，离心15分钟，收集沉淀，用－20℃无水乙醇洗涤一次；将DNA在真空干燥器中抽干，溶于10mlTES缓冲液中，4℃保存备用。⑶说明①本方法可用于其他种类细菌，但是溶菌条件需略加修改，对革兰氏阳性菌（如葡萄球菌），在SDS处理前需要使用溶菌酶裂解细胞壁，对于另外一些细菌（如分枝杆菌），在加入SDS后，将溶液加温至65℃是可取的。②一些种类的细菌含大量核酸酶，去垢剂不能完全抑制其活性，用TES缓冲液代替SSC缓冲液可通过EDTA的作用抑制核酸酶活性，必须注意的是，TES缓冲液离子强度较低，在加入乙醇之前需用醋酸钠调节DNA溶液的离子强度（醋酸钠的最终浓度为0.3mol/L）③DNA溶液中残留少量酚和氯仿，可在乙醇沉淀之前用水饱和乙醚萃取去除④比较纯净的DNA溶液的Ａ260/A280及A260/A235大于1.7

在进行细菌肽聚糖提取的 过程中，怎样设置所需的离心机速度，比如在洗SDS时，应设置怎样的速度

乙烯菌核利判定，2763中规定，残留物：乙烯菌核利及其所有含3,5-二氯苯胺部分的代谢产物之和，以乙烯菌核利表示。请问各位，其所有含3,5-二氯苯胺部分的代谢产物是什么？有单独标样吗？检测时得同时走乙烯菌核利和其所有含3,5-二氯苯胺部分的代谢产物两种标样吗？谢谢

问题描述：核酸提取方式主要有哪些？有何差异？解答：[align=left][font=宋体][color=black]目前主流的核酸提取方法有煮沸裂解法、苯酚氯仿抽提法、离心柱法、磁珠法，接下来介绍这几个方法的原理、优劣势及适用场景。[/color][/font][/align][align=left][font=宋体][color=black]（[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]1[/color][/font][font=宋体][color=black]）煮沸裂解法：原理是通过加热使细胞膜破裂，充分暴露核酸，核酸可溶解于上层水溶液中，通过高速离心沉淀变性蛋白质和细胞碎片，上清液即为核酸粗提液。此方法的操作相对简单，成本低，但由于是粗提，成分比较复杂，有时可能带来一定的体系干扰或者裂解不充分的情况，一般用于细菌定性鉴定时使用。[/color][/font][/align][align=left][font=宋体][color=black]（[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]2[/color][/font][font=宋体][color=black]）苯酚氯仿抽提法：原理是苯酚和氯仿抽提除去蛋白和多糖类杂质，获得相对较为纯净的基因组核酸。成本比较低廉。缺点是试剂毒性较大，长时间操作对人员健康有较大影响。试剂需要自行配制，批次间差异显著。提取效率相对较低，不适宜少量或者微量操作。一般用于大量核酸样本的抽提。[/color][/font][/align][align=left][font=宋体][color=black]（[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]3[/color][/font][font=宋体][color=black]）离心柱法：原理是利用裂解液促使细胞破碎，使细胞中的核酸释放出来，利用柱子中的载体吸附提纯核酸。它的优点是比传统的酚氯法提取纯度高、毒性低，有利于[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]RNA[/color][/font][font=宋体][color=black]保护，而且能进行微量操作，价格较低。缺点是不便于高通量、自动化操作，对实验室设备和人员的操作技能要求较高。目前应用广泛，常用于细菌、病毒、动物组织等多种样本的核酸提取[/color][/font][sup][font='Times New Roman','serif'][color=black][13][/color][/font][/sup][font=宋体][color=black]。[/color][/font][/align][align=left][font=宋体][color=black]（[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]4[/color][/font][font=宋体][color=black]）磁珠法：与离心柱的操作原理基本相同，利用交换吸附材料吸附核酸，从而将核酸和蛋白质等细胞中其他物质分离。优点是能够实现自动化、高通量操作，配合核酸自动提取仪使用，操作简单、用时短，核酸纯度高、浓度大，可广泛用应用于血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中的[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]DNA[/color][/font][font=宋体][color=black]和[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]RNA[/color][/font][font=宋体][color=black]分离，但超高通量样本同时进行时，可能存在一定的污染风险。[/color][/font][/align]以上内容来自仪器信息网《PCR实战宝典》

我用MO Bio的soil DNA Isolation Kit提取土壤总DNA，提取的DNA直接跑胶，看不见任何条带，采用细菌16S rDNA通用引物（27F和1492R)进行PCR扩增，也没有结果，有一次我将试剂盒提取的DNA50倍稀释后，进行细菌16S rDNA的PCR扩增，扩增出了目的条带，我所用的酶为Takara的LA Taq，用普通的Taq酶扩增不出来，但隔了一周后再去重复，什么条件都一样，却再也扩不出来了，我重新提取了新的DNA进行PCR,依然没有结果，不知道是什么原因，请大家帮忙分析一下，希望有做过土壤微生物多样性的高手提供点提取土壤DNA以及扩增细菌16S rDNA的实验方法，我将不胜感激！我现在非常着急！希望能尽快得到大家的帮助！

项目概况2022年细菌试剂耗材及核酸试剂耗材采购项目 招标项目的潜在投标人应在 江西省公共资源交易网 获取招标文件，并于 2022年11月25日 09点00分 （北京时间）前递交投标文件。一、项目基本情况：项目编号：【JXABXZC29202201010】A包第二次项目名称：2022年细菌试剂耗材及核酸试剂耗材采购项目采购方式：公开招标预算金额：700000.00 元最高限价：无采购需求：[table=100%][tr][td]采购条目编号[/td][td]采购条目名称[/td][td]数量[/td][td]单位[/td][td]采购预算（人民币）[/td][td]技术需求或服务要求[/td][/tr][tr][td][font=inherit]吉购2022F000665861[/font][/td][td][font=inherit]基本公共卫生中央补助[/font][/td][td][font=inherit]1[/font][/td][td][font=inherit]批[/font][/td][td][font=inherit]600000.00元[/font][/td][td][font=inherit]详见公告附件[/font][/td][/tr][tr][td][font=inherit]吉购2022F000665871[/font][/td][td][font=inherit]基本公共卫生中央补助[/font][/td][td][font=inherit]1[/font][/td][td][font=inherit]批[/font][/td][td][font=inherit]100000.00元[/font][/td][td][font=inherit]详见公告附件[/font][/td][/tr][/table]合同履行期限：合同签订后8天内完成供货。所供耗材有效使用期限在10个月以上本项目不接受联合体投标。

有没有遇到？甲基对硫磷与乙烯菌核利在-5MS柱子上保留时间重合！

细菌基因组DNA的提取方法综述1 快速微量提取法 A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。 B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37oC水浴1hr。 C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。 D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。 E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4oC保存备用。2 蛋白酶/SDS法制备先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.，第二天4000rpm离心10min收集菌体，用Washing TE（50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌体2次，之后将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50℃放置3h~5h，接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。3 (1) 细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。(2) 细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。(3) 菌体裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS 110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃过夜。（此时菌液应为透明粘稠液体）(4) 抽提：菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）(5) 沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。1 2000rpm离心10min。(6) 洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。(7) 抽（凉）干后，溶于50μl ddH2O中，取2-5μl电泳。作PCR模板用。4 DNA EXTRACTION PROCEDURE - GENERAL 1) Grow cells overnight in 500 ml broth medium. 2) Pellet cells by centrifugation, and resuspend in 5 ml 50 mM Tris (pH 8.0), 50 mM EDTA. 3) Freeze cell suspension at -20C 4) Add 0.5 ml 250 mM Tris (pH 8.0), 10 mg/ml lysozyme to frozen suspension, and let thaw at room temperature. When thawed, place on ice for 45 min. 5) Add 1 ml 0.5% SDS, 50 mM Tris (pH 7.5), 0.4 M EDTA, 1 mg/ml proteinase K. Place in 50C water bath for 60 min. 6) Extract with 6 ml Tris-equilibrated phenol and centrifuge at 10,000X g for 15 min. Transfer top layer to new tube (avoid interface). Re-do this step if necessary. 7) Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting). Spool out DNA and transfer to 5 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA, 200 g/ml RNase. Dissolve overnight by rocking at 4C. 8) Extract with equal volume chloroform (mix by inverting) and centrifuge at 10,000X g for 5 min. Transfer top layer to a new tube. 9) Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting). 10) Spool out DNA and dissolve in 2 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA. 11) Check purity of DNA by electrophoresis and spectrophotometric analysis. 5 1) 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。 2) 加9.5ml TE悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混匀, 37℃保温1小时。 3) 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。 4) 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟。 5) 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。 6) 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。 7) 加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，沉淀DNA。 8) 用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20℃保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。 9) 如要除去其中的RNA, 可以按本章第三节中操作步骤处理。 注：1)CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml。 　　2)氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。

1.各位大虾，鄙人试图将乙烯菌核利与（10种有机氯+5种菊酯）进行多残留检测，但是乙烯菌核利和β-BHC总是分不开，峰呈M型，温度条件也变换多次，该怎么做呢？2.还有，假如A和B两种药可以同时检测，在配A/B的混标时，是不是还要考虑A和B原来标样的介质（如甲醇和石油醚等）的互溶情况？？为了进行混合，可不可以改变原来的各自的介质？？

有这样一个问题，是男人的手干净还是女人的手干净，你会不会认为“那还用说，当然是女人的手干净了”？一则女人在条件允许的情况下通常更讲卫生，二则女人做粗活的也比男人少。实际情况又是如何呢？一项最新研究发现，女性跟男性比，手上细菌种类更多。据美联社报道，在美国国家卫生研究院与美国国家科学基金会资助的一项研究中，研究人员取得了重要发现。他们从五十一名大学生的一百零二只手提取了样本，通过最新的高精密度的系统检测细菌的脱氧核糖核酸（DNA），看到四千七百四十二种细菌，每只手上都存在的仅仅为百分之五，平均每只手有一百五十种细菌。美国科罗拉多大学生物化学助理教授罗布奈特说：“让人感到吃惊的是，人不同，细菌种类就这么不同，而且一个人两只手上的细菌也很不相同。”该校生态学与进化生物学助理教授诺厄法伊尔说：“受试者手上细菌种类的数量多得惊人，女人手上细菌的多样性同样让人惊叹不已。”女性手上为什么会藏有如此之多的细菌呢？研究人员还没有准确的结论。尽管如此，法伊尔依然表示，这很可能与皮肤的酸碱性有关系。用奈特的话说就是，男性皮肤的酸性要比女性的大。还有就是男女在出汗与油脂分泌、润肤霜和化妆品的使用次数、皮肤厚度与激素分泌等方面有差别。还有一种可能不能忽视，那就是女性身上的一些细菌生活在皮肤下面，那种地方看不到，因而无法洗掉。不过，奈特强调说，“我们身上的大多数细菌无害也无益，病菌仅仅是一小部分。”另一个有意思的现象就是前面提到的，左右手之间“藏污纳垢”能力也不相同，研究人员称，两手相同的细菌种类占人手上细菌种类总数的百分之十七。有人干什么都用“正手”，有人则是左撇子。两手之间细菌种类差别那么大，原因很可能是环境条件不同造成的，比如油脂分泌、盐分、水分以及每个人一只手接触物体表面的多少。手上为什么会有这么多细菌呢？研究人员给出的答案就是，要么就是手刚刚洗完，细菌王国就迅速重新建立了起来，要么就是根本没洗掉，一些参与试验的学生就是这种情况。由此看来，洗手不仅要经、认真，还要注意保持洗手效果。尽管试验得出了结果，可是研究人员并不认为这一试验具有普遍性。这是因为不同地区的人两手的作用不太相同，“任务”各异。也正是这个原因，研究人员希望在其他国家开展他们的试验。这些试验也许能知道有多少种细菌出现在手上，可是每一只手上有多少细菌却数也数不过来。好在多数细菌无海也无益，否则我们每天别的都不用干了，就为手上的细菌忙活得了。吓着您了，对不起。

求硫丹、乙烯菌核利的检测方法！原来一直用761的方法检测这两种农药（ECD），现在业务部要求我们用20769来检测（LCMSMS），求指教！

核酸提取(核酸的分离与纯化)主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开,但在分离核酸时,应保证核酸分子一级结构的完整性,并排除其他分子污染。核酸提取方法一般包括细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤,而每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。操作过程中首先通过物理、化学或酶解作用裂解细胞,使核酸释放出来,并去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂肪类等生物大分子的过程。在此基础上,沉淀核酸、去除盐类和有机试剂等杂质,从而得到纯化的核酸。核酸提取仪是应用配套的核酸提取试剂来自动完成样本核酸的提取工作的仪器。在传统的手工核酸提取过程中通常采用离心澄清的方法，操作时费时费力。近年来,出现了磁珠分离技术，利用磁珠在一定条件下对核酸具有很强亲和力的特点，吸附核酸。当条件改变时，磁珠又可以与其吸附的核酸分离,从而得到纯化的核酸。这种方法简便、高效、易于操作，是目前核酸提取仪采用的主要方法。具体来说，磁珠法提取核酸是通过细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的核酸分子被特异的吸附到磁性颗粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。反应一定时间之后，再在磁场作用下，使磁性颗粒与液体分开，回收颗粒（即磁珠-DNA 混合物），再用洗脱液洗脱即可以得到纯净的DNA。磁珠法不需要离心、不需要加入多种试剂，操作简单，符合核酸自动化提取要求，是未来核酸纯化方法发展的一个重要方向。

作为科研生产中最重要的基础性资源—菌毒种,其收集、保藏及相关的研究工作在我国正处于整理、整合以及全方面逐步正规化阶段.2003年7月23日,科技部在北京召开了“国家科技基础条件平台建设”部际联席会和专家顾问组成立大会,正式启动了国家科技基础条件平台建设工作.国家自然科技资源共享平台建设作为其中的一个重要组成部分同步启动.作为该项8的一个重要组成部分,微生物菌种资源整理、整合工作同期启动,在此项工作中,中国兽医药品监察所承担了兽医微生物资源整理、整合工作.本所在行业内发展了数家加盟单位,在整理、整合菌种资源的过程中遇到了一些实验室细菌鉴定结果出现偏差的问题.经分析调查,多是由于实验室人员结构以及实验室的硬件水平差别较大等原因,造成实验室间鉴定能力的参差不齐,致使鉴定项目完成情况不尽相同,细菌鉴定结果出现偏差. 细菌鉴定是指将分离培养获得的病原菌,通过纯化培养使其达到不含有其他微生物的纯培养程度,继而进行系统鉴定.而菌种保藏机构在收集一些已经冻干的菌种时,应在开启后经过两代的适应性培养方可进行复核性的系统鉴定.系统鉴定是通过细菌的形态结构、生长特性、抗原性、病原性以及目前流行的核酸测定方法等检测,并用已知标准免疫血清确定分离细菌的属、种和型(群).目前菌种保藏机构通常使用的细菌鉴定方法大致有以下几种:

【关键词】中检所对照品目录 药检所标准物质 标准物质网站 中华标准物质网 内容摘要：双链DNA片段与感受态受体菌的细胞表面特定位点结合，并激活临近的核酸酶。DNA双链中的一条单链逐步降解，同时另一条单链逐步进入细胞。 一、革兰氏阳性细菌，转化过程的几个阶段： 1.细菌感受态的形成 由于分泌一种称为感受态因子的小蛋白而导致细菌感受态的形成。 2.转化因子的吸收 双链DNA片段与感受态受体菌的细胞表面特定位点结合，并激活临近的核酸酶。DNA双链中的一条单链逐步降解，同时另一条单链逐步进入细胞。 3.整合复合物前体的形成 一种特殊蛋白与单链DNA结合，有效保护单链DNA免遭核酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色体DNA处。 4.单链DNA转化因子的整合 转化DNA单链可以通过同源重组，置换受体细胞染色体DNA的同源区，形成异源杂合双链DNA结构。 5.转化子的形成 受体菌染色体组进行复制，杂合区段亦半保留复制，当细胞分裂后，此染色体发生分离，于是新形成一个转化子。 二、影响转化的因素 1.DNA能否进入细胞； 2.DNA进入细胞后的稳定性； 3.质粒DNA的大小，大质粒的转化效率低于小质粒，到目前，大于30kb的质粒，转化效率仍很低； 4.DNA的浓度、纯度和形状； 5.诱导感受态细菌所用的离子的种类和浓度； 6.热休克时间的长短及平板培养条件等。 本文参考了 国家标准物质网

核酸提取仪有两种分类分类方式，一种是按用途进行分类，另一种是按照应用试剂的不同进行分类。（1）按照用途分类：一类是自动液体工作站，自动液体工作站是功能非常强大的设备，液体分液、吸液等自动完成，甚至可以整合扩展、检测等仪器设备，实现标本提取、扩增、检测全自动化。提取核酸只是其功能的一个应用，不太适合常规实验室提取核酸，一般都应用在单一类标本并且一次提取标本量非常大（至少96个，一般几百个）的实验需求上。自动工作站的平台建立及平台的运作，需要比较大的资金。另一类是小型的自动化仪器，小型的自动化仪器是通过运行结构的特殊设计来达到自动提取核酸的目的，可以在任何实验室得到应用，最近几年有很多机型陆续投放市场。（2）根据应用的试剂不同分类：一类是应用磁珠法试剂的仪器，另一类是应用离心柱法试剂的仪器。应用磁珠法的自动核酸提取仪操作简便，容易自动化，是目前市场上的主流，如QAGEN、Lab-Aid 820等仪器。与传统的手工操作相比核酸提取仪的优势：核酸提取仪一般具有以下的特点：(1) 无交叉污染：仪器部件未接触到生物学样本；(2) 自动化系统：每次提取工作，操作者只需要做好安装工作，布置好孔板（提供提取所需要的试剂）.提取整个过程都不需要人为的帮助，仪器自动完成；(3)提取控制：在提取过程中，如果操作者需要，该系统允许您对提取过程进行控制。

细菌工程菌胞内表达主要分为两种形式，一种是在强启动子条件下的高效表达，由于蛋白的过度表达，使蛋白不能及时有效折叠而发生无规则卷曲，以固体颗粒的形式堆积于胞间质中，这就是所说的包涵体，另外一种是间质内的可溶性表达，即可以发生正常折叠，具有生物活性。一般情况下，细菌只要被正常破壁就可以通过离心的形式将包涵体和可溶性表达的蛋白分离开。超声破碎的条件一般是300 w，10 s/10 s，20分钟，具体条件可根据自身情况而定。 超声前菌体的准备：菌液离心后，先用PBS将菌沉淀洗2-3遍，然后按原菌液体积的1/5-1/10加入裂解液重悬菌体，裂解液的成分：50 mMTris-HCl, pH8.0, 2 mM EDTA，100 mM NaCl，加溶菌酶至100 ug/ml，0.1%Triton X-100。切记冰浴超声！ 如何判断是否超声完全：根据网友的经验，一般有以下几个方面： 1. 外观判断：超声前菌悬液是浑浊的，超声完全后变的透明、清澈。2. 液体的粘滞性：超声后菌液从枪头滴下不粘连。3. 高速离心：有用高速离心检测超声破碎程度的（一般用6,000 g 10 min, 比一般离心收集菌体的转速高一点）。 沉淀是未破碎或破碎不完全的菌体。 4. 染色：破碎后的菌液涂片，革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟，镜检。超声后加入核酸酶消除核酸对蛋白的污染。一些需要注意的问题： 1. 蛋白以包涵体形式表达，追求的是高破碎率，要求细胞碎片很小，而另一种蛋白是可溶形式表达，所以细胞碎片不能很小，两种情况要求不同但目的相同，都是便于后期的固液分离。2. 如果超声时出现黑色沉淀，说明超声功率太强。3. 超声时间太长、功率太高对蛋白活性肯定有影响。4. 尽量防止泡沫的产生。

香港中文大学生命科学学院的11名学生，成功利用大肠杆菌的质粒基因，储存一句文字，证明细菌可以储存数据。据香港《经济日报》11月25日报道，中文大学学生研究发现，细菌可以象USB记忆棒一样储存资料。每1克细菌存量达90万GB，而且数据资料可以存于基因细胞内，变成生物标记条码。该项研究日前夺得美国麻省理工学院基因机器设计金奖。据报道，该存储方法先将数据分成小份，再将各小份排序，输入细菌的基因细胞里储存。不同的排序方式可演绎成不同数据。这些数据可以利用基因测试仪器提取出来。

[size=5][font=宋体]实验室确定细菌生长密度和生长期，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。[/font][font=Arial]OD600[/font][font=宋体]是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。以未加菌液的培养液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。为了保证正确操作，必须针对每种微生物和每台仪器用显微镜进行细胞计数，做出校正曲线。实验中偶尔会出现菌液的[/font][font=Arial]OD[/font][font=宋体]值出现负值，原因是采用了显色的培养基，即细菌培养一段时间后，与培养基反应，发生变色反应。另外，需要注意的是，测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状态。[/font][font=Arial][/font][font=Arial][/font][font=Arial] [/font][font=宋体]分光光度计的重要配件[/font][font=Arial] —— [/font][font=宋体]比色杯[/font][font=Arial][/font][font=Arial] [/font][/size][size=5][font=宋体]比色杯按照材质大致分为石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根据不同的测量体积，有比色杯和毛细比色杯等。一般测试核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不适合比色法测定。因为反应中的染料（如考马斯亮兰）能让石英和玻璃着色，所以必须采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不适合用于在紫外范围内测试样品。[/font][font=Arial][font=宋体]由于另外测试的样品量不同，所以一般分光光度计厂家提供不同容积的比色杯以满足用户不同的需求。目前市场已经存在一种既可用于核酸、紫外蛋白质定量，亦可用于蛋白比色法测定的塑料杯，样品用量仅需50μl，比色杯单个无菌包装，可以回收样品。如Eppendorf UVette?塑料比色杯，是目前比色杯市场上一个革新。随着生命科学以及相关学科发展，对此类科学的实验研究提出更高的要求，分光光度计将是分子生物学实验室不可缺少的仪器，也成为微生物、食品、制药等相关实验室的必备设备之一。[/font][/font][/size]

[align=left]众所周知，高压蒸汽灭菌器可以杀灭细菌等微生物，但是究竟起到杀菌作用的是锅内的高压还是锅内的高温？对此很多人并不清楚。其实真正发挥杀菌作用的是高温而不是高压。[/align][align=left]锅内高压不能灭菌可以举个简单的例子加以说明：空气压缩机可以产生很高的空气压力，但不能把内部的微生物杀灭。而家用饭锅虽没有压力，在蒸煮中却可以杀死大部分微生物。其实人们采用高压锅灭菌的真正原因，是利用锅内的高压提高锅内的温度（在饱和蒸汽里压力与温度呈线性对应关系），在高温下提高灭菌的效率和效果。压力只是个助手，高温才是真正的杀手。那么高温是如何杀菌的呢？[/align][align=left]微生物是由蛋白质构成的，破坏了微生物的蛋白质就可以杀灭微生物。压力锅的高温会使蛋白质间分子内氢键发生断裂,破坏蛋白质分子的空间构型,从而导致微生物的死亡，达到了灭菌的目的。[/align][align=left]同时，蒸汽灭菌时使用饱和蒸汽是至关重要的。细菌孢子，尤其是芽孢杆菌和梭状芽孢具有耐热性，耐热孢子的破裂取决于在湿热条件下孢子的水合作用以及核酸及蛋白质的变性，饱和蒸汽的穿透性比干热空气及过热蒸汽的穿透性要强得多，蒸汽冷凝时放出的潜热传给待灭菌物品，使之升温并使待灭菌物品所带的微生物尤其是表面的微生物发生水合作用，从而加速了它们的死亡。[/align]

你们在对样本中的核酸提取时，都使用的什么仪器去进行的提取？

（一）温度 　　各种细菌都需在最适生长温度的范围内生长。当外界温度明显高于最适生长温度，细菌被杀死；如果在低于细菌的最低生长温度时，细菌代谢活动受抑制，则出现抑菌作用。 　　1.高温：细菌蛋白质、核酸、细胞壁和细胞膜及酶类因热力作用发生变性或凝固，活性消失，代谢发生障碍导致细菌死亡。大多数无芽胞细菌55℃～60℃加热30～60min即被杀死；加热100℃立即死亡，有芽胞的破伤风芽胞梭菌需煮沸3h才被杀死。热力灭菌分湿热和干热两种。在同一温度下，前者的效力大于后者 　　（1）湿热：常用的方法有 　　1）巴氏消毒法：方法有两种：一是61.1℃～62.8℃30min；另一是71.7℃l5～30s，目前主要用于牛乳消毒。 　　2）煮沸法：煮沸100℃（1个大气压状态下）。5min中可杀死细菌繁殖体，如于水中加入2％碳酸钠，则可提高其沸点至105℃，既杀死芽胞，又防止金属器皿生锈。 　　3）流通蒸气灭菌法：常用阿诺（Arnold）流通蒸气灭菌器或蒸笼。利用一个大气压下100℃水蒸气进行消毒。经10～30min细菌繁殖体被杀死，但对芽胞的作用不大。 　　4）间歇灭菌法：采用间歇加热方式达到灭菌目的。方法是将待灭菌物品置于Arnold灭菌器内，经l00℃加热15～30min，每日一次，连续3次。每次灭菌后，取出再置37℃孵箱过夜，使残存的芽胞发育成繁殖体，次日再通过流通蒸气加热使之被杀死。这样可达到杀死芽胞又使不耐100℃的物质保存下来。 　　5）加压蒸汽灭菌法：利用密闭的耐高压的高压蒸汽灭菌器，在蒸汽不外溢的条件下，使锅内压力增高，蒸汽的温度也随之增高，大大加强其杀菌效力。通常在103.4kPa的压力下达121.3℃，维持15～20min可杀灭所有细菌芽胞和繁殖体。本法适用于耐高温、耐湿物品的灭菌，如普通培养基、生理盐水、手术敷料等。 　　（2）干热 　　1）烧灼：是常用的干热灭菌法。微生物实验室使用的接种环、接种针、瓶口和试管口常在火焰上烧灼灭菌。 　　2）干烤：在密闭干烤箱内加温至160℃～170℃维持2h是对一般玻璃器皿、注射器、瓷器的灭菌方法，适用于高温下不变质、不损坏、不蒸发的物品医学教.育网搜集整理。 　　2.低温：一般细菌耐低温，在低温条件下，细菌代谢活动降低不再繁殖，能较长时间维持生命，故常用于保存菌种。为避免解冻时对细菌的损伤，可在低温状态下真空抽干，去尽水分，此法称冷冻真空干燥法，可保存细菌数年至数十年，是目前保存菌种的最好方法。

用化学方法对环境样品提取液分析费时费钱，现在用于环境样品毒性分析的快速方法－－发光细菌法，已经用于水质检测领域，美国的microtox方法就是非常成熟的发光细菌检测法，但是它有很多确定和局限性。那么如何将现有的方法结合起来呢？

想买个核酸提取仪，做动植物组织DNA荧光定量PCR检测，有什么好的仪器，国产进口都可以，请用过的推荐下。谢谢

单位计划采购自动核酸提取仪，听几个进口厂家推介了，得出来的观点相悖，特求助高人指点一二。到底是滤膜法好还是磁珠法好？是否为真正的全自动怎样去区分？高通量与否怎样鉴定？

http://img.ycwb.com/news/attachement/jpg/site2/20101030/90fba60187190e35b72d07.jpg 济南市中心医院病原微生物学实验室培养皿中的细菌济南市中心医院是卫生部确定的全国19个超级细菌监测哨点医院之一。其病原微生物学实验室肩负着监测超级细菌的重任。检测超级细菌需要经过四道程序：工作人员首先将从临床患者感染部位提取的样本放在培养基上接种，然后再送入二氧化碳培养柜中进行18-24个小时的培养。培养出细菌后，进行细菌鉴定和药物敏感性试验，如果发现疑似耐药性反应，就会将其送到“临床基因扩增检验实验室”做基因分析，最快两三天就可以确认是否是超级细菌。

本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 本试验操作过程应防止微生物和内毒素的污染。 细菌内毒素的量用内毒素单位（EU ）表示，1EU 与1 个内毒素国际单位（IU ）相当。 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的赏试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.O15EU／ml（用于凝胶法）或0.005EU / ml （用于光度侧定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃ 、30 分钟以上 ) 去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。