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β-内酰胺酶是指能催化水解β-内酰胺环酰胺键的灭活酶,可分为青霉素酶、头孢菌素酶、 金属酶和超广谱酶四种。其对青霉素的分解效率非常高,因此,添加在牛奶中确实可以完全水解青霉素, 使之不被检测出来。但是同样其风险也是存在的:第一,β-内酰胺酶的安全性以及是否可以在食品中添加 尚未有定论;第二,在分解β-内酰胺药物后,可能引进其他有害物质;第三,这种做法纵容了奶牛饲养过 程中抗生素的滥用。【反应原理】根据碘量法快速高效重复性好的特点,能快速测定β-内酰胺酶的残留量。根据青霉素经β-内酰胺酶作用而产生的裂解酸与碘结合,可使蓝色的碘淀粉复合物褪色的原理:青霉素+β-内酰胺酶 → 青霉素裂解酸青霉素裂解酸 + 淀粉碘(蓝色)→ 褪色【试剂盒组成】试剂盒组份数量规格试剂A(棕色瓶)16ml试剂B (本色瓶)16ml样品处理液130ml稀释液(本色瓶)125ml样品管(蓝色离心管)24/4848孔板/96孔板1说明书1样品处理管24/48【注意事项】1. 本试剂盒仅供体外诊断用,不要将不同批号的试剂混合用,并请在有效期内使用。2. 如试剂盒不能一次用完,请使用灭菌的移液头进行取样。3. 本试剂盒适用于生乳中β-内酰胺酶检测,线性范围0~10U/ml,如有必要请用稀释液将样 品稀释后在进行试验。4. 含大量脂质或变质的标本可能影响检测结果;如有需要可在实验前对样品进行离心(4000rpm,10min)后取中间清液待测。【试验方法】1. 将试剂盒于室温回温30min 以上。2. 取1000ul 待测样品加入样品管中。
附件牛乳中非法添加β-内酰胺酶检测方法随着国家对食品安全问题的关注和部分乳制品企业2010年无抗奶目标的提出,抗生素残留问题成为影响乳制品安全的重要因素之一。目前,青霉素作为β- 内酰胺类药物是治疗牛乳腺炎的首选药物,是牛奶中最常见的残留抗生素。由于国内多数乳品企业对抗生素残留超标的牛乳采取降价收购的原则,出于经济利益的驱动,一些不法奶站为了谋求自己的经济利益,人为的使用一些生物制剂去降解牛乳中残留的抗生素,生产人造“无抗奶”。2005年至今,已有数家公司公开宣称出售分解牛乳中残留抗生素的解抗剂。迄今为止,还没有针对这种人造“无抗奶”的相应检测方法、检测标准,无法从源头上监测、把控原奶质量。奶制品中三聚氰胺问题出现后,检科院按照国家局科技司的安排,对奶制品中可能的添加物进行了调查。经过前期的调研工作,初步判断市售解抗剂的主要成分是β-内酰胺酶,它是由革兰氏阳性细菌产生和分泌的,可选择性分解牛奶中残留的β- 内酰胺类抗生素。β-内酰胺酶为我国不允许使用的食品添加剂,该酶的使用掩盖了牛奶中实际含有的抗生素。β-内酰胺酶能够使青霉素内酰胺结构破坏而失去活性,导致青霉素、头孢菌素等抗生素类药物耐药性增高,从而大大降低了人们抵抗传染病的能力,给消费者的身体健康带来危害。微生物方法和理化方法均利用β-内酰胺酶能够裂解青霉素的β-内酰胺环形成青霉噻唑酸的原理检测乳制品中是否添加解抗剂。一、理化方法(一)高效液相色谱法1、间接法方法原理:利用β-内酰胺酶能够酶解青霉素的原理,向牛奶中添加一定量的青霉素,如果牛奶中存在一定浓度的β-内酰胺酶,那么青霉素经β-内酰胺酶酶解后浓度会减少,从而判断牛奶中是否存在β-内酰胺酶。实验步骤:称取20 g试样,在4℃、16000rpm条件下离心10 min。取下层清液10 g于50 mL塑料离心管,并将塑料离心管置于37℃水浴锅中振荡孵育30 min。向孵育后的离心管中加入无水乙醇15 mL。振荡提取30 min后离心,将上层清液过滤纸后收集于梨形瓶中。减压浓缩蒸发掉乙醇。向旋蒸后的梨形瓶中加入10 mL磷酸盐缓冲液(pH=8.5),涡旋1 min后调节pH为8.5。以1 mL/min的速度将提取液通过经过预处理的Oasis HLB固相萃取柱,用2 mL磷酸缓冲液(pH=8.5)淋洗萃取柱,再用2 mL水淋洗。最后用3 mL乙腈洗脱。将洗脱液在40℃下氮气吹干,用0.025 M磷酸盐缓冲液(pH=7.0)定容残渣至1 mL,待上机测定。色谱条件:色谱柱 Agilent Zorbax SB C18,4.6mm×150mm×5μm;流动相 甲醇/0.004 M磷酸二氢钾(pH=4.5)=40/60;检测波长 268 nm讨论:该方法只能给出定性结论即牛奶中是否含有β-内酰胺酶,而无法给出确切定量结果即牛奶中含有β-内酰胺酶的量(U/ml);前处理方法相对复杂、费时。2、直接法方法原理:牛乳中的青霉素钾在β-内酰胺酶的作用下,主要生成青霉噻唑酸钾,并伴随生成少量的青霉胺、青霉醛等物质。经去脂肪、蛋白等前处理后,可以将青霉噻唑酸钾提取出来,经高效液相色谱仪检测确认其是否存在,从而判定该牛乳是否为人造“无抗奶”。实验步骤:称取20 g试样,在4 ℃、16000 rpm条件下离心10 min。取下层清液10 g于50 mL塑料离心管,加入无水乙醇15 mL,振荡提取30 min后离心,取清液经0.45 μm的滤膜过滤,用高效液相色谱仪检测。标准溶液配制:称取0.01 g(精确至0.001 g)青霉素钾于100 ml容量瓶中,加入1ml市售抗生素分解剂,室温放置2h使青霉素钾酶解完全后用去离子水定容,得到青霉噻唑酸钾标准溶液,浓度100 μg/mL。根据实际情况稀释后使用。色谱条件:色谱柱 Agilent Zorbax SB C18,4.6mm×150mm×5μm;流动相 甲醇/0.004 M磷酸二氢钾(pH=4.5)=40/60;检测波长 230 nm讨论:该方法通过检测酶解产物青霉噻唑酸,只能给出定性结论即牛奶中是否含有β-内酰胺酶,而无法给出确切定量结果即牛奶中含有β-内酰胺酶的量(U/ml);青霉噻唑酸钾稳定性尚需进一步考察;实验成本较生物学方法高。
[b]β-内酰胺酶[i][/i](金玉兰酶制剂)[/b][list][*][size=15px][b]常规用途:[/b]可以水解碳青霉烯类等抗生素。[/size][*][size=15px][b]可能添加的主要食品类别:[/b]乳与乳制品[/size][*][size=15px][b]可能的主要作用:[/b]掩蔽抗生素[/size][*][size=15px][b]危害:[/b]金玉兰酶制剂能导致青霉素、头孢菌素等抗生素类药物耐药性增高,从而大大降低人们抵抗传染病的能力,给消费者的身体健康带来危害。[/size][/list][size=15px][/size][list][*][size=15px][b]掺假手段:[/b]β-内酰胺类抗生素[i][/i]是在牛乳生产中应用最广泛的抗生素,用于治疗牛乳腺炎和其他细菌感染性疾病。按照国家规定,使用抗生素药物后一定时间内的乳汁,不得作为供人食用的原料。同时,国家在《生鲜牛乳收购标准》中规定,生鲜乳中不得检出抗生素。然而就中国奶牛饲养环境而言,牛奶的绝对“无抗”较难达到,针对这种情况,市场上出现了“抗生素分解剂”,该分解剂可选择性分解牛奶中残留的β-内酰胺抗生素,其成分就是β-内酰胺酶。[/size][/list][size=15px][/size][list][*][size=15px][b]鉴别:[/b][/size][size=15px]牛奶中β-内酰胺酶的检测,目前可行方法有[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]法。对普通消费者而言,尽量不要购买宣传的所谓“无抗奶”。[/size][/list]