液相色谱测试

国产与进口液相色谱仪测试比对报告1.比对目的 选取2010年药典二部及美国药典中典型方法及食品添加剂国标方法对某国产品牌上海伍丰EX1600高效液相色谱仪及其他品牌（以waters仪器为主）液相色谱仪的各项性能进行比较，明确国产仪器优化与改进方向。2.比对依据与原理1. JJG705-2002 液相色谱仪计量检定规程2. EX1600高效液相色谱仪及其他品牌高效液相色谱仪使用说明书3. EX1600高效液相色谱仪系统适用性测试方案及综合改善测试方案4. GB/T 19681—2005食品中苏丹红染料的检测方法--高效液相色谱法5. VensuilAA氨基酸分析方法6. 2010年药典二部及美国药典中双氢青蒿素、可可碱与茶碱、维生素A及阿托伐他汀钙等相关物质的测定方法。7. 需比对的性能指标选取原理：与《JJG705-2002 液相色谱仪计量检定规程》要求直接相关；与仪器关键部件的技术指标直接相关；与仪器测定结果重复性，即仪器稳定性直接相关。8. 样品选取原理：测定结果直接反应仪器的稳定性；属于常用或者经典方法，单标、混标体系均有所涉及；等度和梯度方法均有所涉及（反映梯度误差指标）；与检测器的基本波段（低、中、高波段）均相关的项目（反映全波段检测稳定性）。3.比对内容 高效液相色谱仪对样品的分离与测定结果好坏与仪器的稳定性及色谱柱的柱效相关，现使用同样的色谱柱进行EX1600高效液相色谱仪及其他品牌的色谱仪各项性能比对，就需要了解构成液相色谱的各个系统及整机的稳定性情况。就仪器各个系统的稳定性来讲，按照《液相色谱仪计量检定规程》测试方法，对流量准确度与重复性、噪声与漂移的测定结果能够从仪器方面直接反映输液系统及检测器的运行情况，明确指出这两个核心部件的优化与改进方向。而就整机稳定性来讲，还需要配合标准样品的测试，对其检出限、线性范围和梯度误差及定性定量重复性结果进行比较和评价，作为应用测试指标进一步反映仪器的稳定性好坏。将仪器性能指标与应用测试指标相结合，才能全面、客观地对仪器各项性能的稳定性进行评价与改进。现将主要测试内容列在下表：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/11/201311100229_476241_2369266_3.png 根据以上所列比对项目的比对内容，选择苏丹红ⅠⅡⅢⅣ、双氢青蒿素、阿托伐他汀钙、可可碱与茶碱、维生素A、氨基酸作为衡量输液系统、检测器、整机及软件性能综合指标优劣的标准测试样品，其特有的测定条件及测定结果可以综合反映色谱仪的稳定性，现将其优势测定条件与测定结果反映的综合指标列在下表并具体阐述如下：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/11/201311100231_476242_2369266_3.png 据食品国家标准、药典二部及美国药典中的典型方法，我们选取了近年来与食品、药品质量可控性、有效性及安全性密切相关的六类标准样品，依据其测试结果来衡量高效液相色谱仪各项性能稳定性。 苏丹红作为化工试剂，被不法商家非法添加入调味品中，是近年来食品安全领域的热点问题。苏丹红ⅠⅡⅢⅣ易致癌，是我国明文禁止的非食品添加剂。在相关食品国家标准中对其含量有具体的限量值，鉴于其实际测定中响应值低，我们对苏丹红的检测结果可直接体现高效液相色谱仪的噪声、漂移、检出限及线性范围（下限）等指标优劣。同时，苏丹红ⅠⅡⅢⅣ作为四元混标体系，国标方法规定苏丹红Ⅰ检测波长为478nm，苏丹红ⅡⅢⅣ检测波长为520nm，在检测过程中须转换波长，测定结果能够直接反映高波段、波长转换时的噪声与检出限；分离条件为梯度洗脱，可反映输液系统的梯度误差及双泵在梯度洗脱的稳定性。 双氢青蒿素作为单标体系，色谱测定条件为检测波长210nm，测定结果可直接反映检测器在低波段的稳定性及单泵运行情况。 阿伐他汀钙液相色谱检测波长为244nm，位于检测器优势波段的相对低波长处，流动相中含有高比例、洗脱能力较强的试剂四氢呋喃，可直接反映检测器优势波段噪声及单泵稳定性。 氨基酸混标体系共包含17种氨基酸组分，为复杂难分离体系，检测波长为254nm，测定时为梯度洗脱，测定结果可直接体现检测器优势波中段噪声及梯度洗脱时双泵运行稳定性。 可可碱与茶碱的二元混标体系，测定时检测波长为272nm，位于检测器优势波段的相对高波长处，可进行等度分离，测定结果直接反映了检测器优势波段稳定性及双泵在等度洗脱时的稳定性。 维生素A的高效液相色谱测定体系为正相色谱，流动相为正己烷：异丙醇[font=Tim

[color=#444444]对焦油进行液相色谱进行检测，图片是测试结果[/color][color=#444444]液相色谱：焦油溶剂采用异丙醇；色谱柱ods C18（250*4.6微米,5微米），流动相采用乙腈+水；总流速：1ml/min；柱温40摄氏度。梯度洗脱程序：60%乙腈开始，30min；后以2.5%/min的速度，增加至100%，直至全部出峰。波长：210nm[/color][color=#444444]问：如何调整测试条件，溶剂，波长等[/color][img=,absmiddle]http://muchongimg.xmcimg.com/data/emuch_bbs_images/smilies/rolleyes.gif[/img][color=#444444]，才能得到比较好的测试结果？[/color][color=#444444][img=,690,387]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/05/201905201424067555_6494_1676638_3.jpg!w690x387.jpg[/img][/color]

高效液相色谱仪及色谱柱测试 仪器信息网论坛不缺液相色谱方面的高手，不管是维修方面研发方面还是检测方面的。其中仪器及色谱柱检测，大家都有独到之处，科学之举。 在这我介绍种方法，可能也有很多同仁们用过。在这方法能同时检测液相色谱仪和色谱柱，但检测的只是众多检测项目中比较简单的几种。仪器主要检测检出限、线性、重复性等，色谱柱主要检测分离度、理论塔板数、重复性（和仪器检测相同）等。 下面我们就来具体介绍下。用苯、甲苯、萘测试下高效液相色谱仪及C18色谱柱。实验部分【仪器】高效液相色谱仪（紫外检测器+等度泵+柱温箱+自动进样器+在线脱气机等）超声波振动仪溶剂过滤器【试剂】甲醇：色谱纯超纯水苯、甲苯、萘标准品溶液【色谱条件】检测器：紫外检测器色谱柱：Promosil C18 ( 250 mm X 4.6mm，5μm )流动相：甲醇：水=80:20（V:V）检测波长：254nm流速：1.0mL/min柱温：30℃进样量：20ul【色谱图】 先来张浓度大的，苯、甲苯、萘含量均为1.0 × 10-4g/ml的色谱图：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/09/201509121050_565838_2536753_3.png 效果不错吧，各指标一看就应该能看个差不多吧。浓度大如果看不出好坏，那简单，咱们换个浓度小的，这样各种效果一目了然了。 下面这个是苯、甲苯、萘含量均为5.0 × 10-7g/ml的色谱图：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/09/201509121050_565839_2536753_3.png 再来张重复性（重叠模式）对比的色谱图：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/09/201509121050_565840_2536753_3.png 再来张上下交错模式重复性对比色谱图：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/09/201509121050_565841_2536753_3.png 再来张上下左右交错模式重复性对比色谱图：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/09/201509121051_565842_2536753_3.png 当然浓度大的，重复性色谱图看着效果更好，不信您就来看，这张就是苯、甲苯、萘含量均为1.0 × 10-4g/ml的重复性色谱图：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/09/201509121058_565843_2536753_3.png 这下看明白了吧，效果确实不错吧，各项指标都较理想吧。 下面再来张检出限的色谱图，这个各成分的浓度分别是5.0 × 10-8g/ml：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/09/201509121050_565837_2536753_3.png【结论】 经计算以上各成分的检出限（按2倍噪声计算）大约分别是7.0× 10-9g/ml、4.5× 10-9g/ml、2.5 × 10-9g/ml，线性系数均在0.9999以上，定性重复性均小于0.3%，定量重复性均小于0.5%，分离度也均大于5，色谱柱理论塔板数也均在1万以上，色谱峰较对称，峰形较好。 这就说明该色谱条件适合高效液相色谱仪及常规C18( 250 mm X 4.6mm，5μm )色谱柱测试，测试效果较好。另外可以确定该仪器和该色谱柱测试的这几项内容都没问题，指标都不错。 国标中单用萘标液测试仪器或色谱柱，这样一般也基本能测出仪器及色谱柱的基本性能指标，但却测不出液相重要指标分离度。以上这种方法在国标的基础上又增加了两种成分，分离度指标也可以一块测试。当然也可能有人还会选萘、蒽、茵、菲、芘、苯、甲苯、二甲苯等标准品测试以上项目，也可能会有不错的效果。 以上测试方法我们经常用，效果不错，大家如有这方面测试不防试试。

最近因为测试新柱的柱效引发了柱效测试的思考，与售后工程师进行了相应的交流，结合一些资料和自己的感悟写下此篇文章，希望能给大家在实际工作提供一些有益的东西。 1941年，马丁与詹姆斯提出了塔板理论。 1950年，诺贝尔化学奖颁发给他们两位以表彰他们在气液分离过程理论方面的突出贡献。当然，我们现在也知道塔板理论也是适用于液液分离机理阐述的。 自从有了塔板理论，以理论塔板数为代表的色谱柱柱效评估就引起了人们的关注。我们知道在色谱柱柱长一定的情况下，色谱柱的理论塔板数与理论塔板高度成反比。组分在一个塔板高度内完成一个分配平衡过程（或者吸附平衡），这种平衡是动态的，但是不断的平衡过程导致组分之间差异得到体现，最终引起了不同性质组分之间的分离。 必须指出的是，虽然组分间存在差异，但是差异需要多次的平衡才能最终达到我们想要的分离效果，平衡的次数的多少就由理论塔板数来体现。 1956年，荷兰人范得梅特对塔板理论做出了修正，提出了速率理论。速率理论的公式如下： [img=,414,97]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/12/201712112037_01_3332275_3.jpg!w414x97.jpg[/img] 其中，A项为涡流扩散项，B项为纵向分子扩散项，C项为传质阻力项。它们每一项都会对色谱柱的理论塔板高度，乃至进一步对色谱柱的理论塔板数产生影响。在这里，我们重点关注一下A项，即涡流扩散项，也可以表述为多路径效应。A项的产生源于填充色谱柱内的填料粒径大小及其分布所引起相同组分不同分子在色谱柱内产生了不同的分离路径导致的平衡延缓。A项的存在是导致填充柱与毛细管柱柱效差别的主要原因之一。对于填充柱来说，如何改善A项呢？粒径越小，分布越均匀的色谱柱，其A项的值也越小。在其它条件相同的前提下，对应的色谱柱理论塔板高度越低，理论塔板数越高。所以我们可以看到的是，这些年随着工艺水平的提升，色谱柱的粒径已经能够做到越来越小，粒径普遍在2μm以下的超高效液相色谱UPLC（Ultra Performance Liquid Chromatography）已经越来越多的取代了粒径普遍在5μm左右的高效液相色谱HPLC（High Performance Liquid Chromatography）系统进入各类大型的制药食品类企业及它们的上游包装厂家或者第三方检测实验室中。 我们必须意识到的是，随着色谱柱填料的粒径越来越小，在更短的色谱柱上就可以达到以前较长的色谱柱才能达到的色谱柱柱效，但是伴随而生是柱外效应的影响变得愈发重要。各类管路接头、色谱柱阀切换部件、扩充定量环等等的使用虽然方便了实验的运行，使得液相操作人员的操作更加简单，但是一定程度上影响到我们测试的色谱柱柱效。 色谱柱厂家测试色谱柱柱效往往在十分理想的情况下，各种柱外可能的展宽因素都降到了最低，而对于一个特定的检测室特定的液相仪器而言，是无法达到此种理想情况，因此即使是新柱，可能首次测试的色谱柱柱效也较出厂报告的中色谱柱柱效报告相差较大。以W家2.5μm粒径的实心核颗粒柱为例，利用二氢苊丙酮溶液进行色谱柱柱效测试，即使完全按照色谱柱出厂测试条件进行柱效测试，一般能有出厂报告柱效的70%就是比较好的情况了，而我们实验室的Arc仪器上面实测新柱只有出厂报告的55%。这一方面是由于我们的仪器上加装了许多的部件，色谱柱阀、扩充定量环以及因此增加的接口，这些是否都有意无意的增加了柱外展宽可能的诱因，导致实测的色谱柱柱效偏低；另一方面，实验室的除色谱柱外仪器的当时状态是否也有一些诱导实测柱效较低的因素存在呢，这都是我们可以深刻考虑的。 当然，最终要说的是，即使我们的实测柱效较出厂报告相差较多，如果可以分离我们想要分离的组分，并且对称性优良，仍旧不失为一个好的色谱柱。我们需要记录第一次测试的柱效报告上面的参数，这里面包含理论塔板数、保留时间、拖尾因子等，然后留待以后出现分离问题时利用相同浓度的色谱柱测试标准液进行柱效测试并与首次测试的值相对比。 一切都是为了实验，从实验出发，回到实验中去。 作者写本文是为了更好的理解色谱柱的柱效以及更好的指导工作，写作过程受认知的限制可能存在一些纰漏或者错误，望大家能够批评指正。

[b][font='Times New Roman'][font=宋体]解答：[/font][/font][/b][font='Times New Roman']JJG 705-2014[font=宋体]《液相色谱仪检定规程》中规定了液相色谱柱柱效的测试方法，具体测试方法如下：[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font]1[font=宋体]）[/font][/font][font='Times New Roman'][font=宋体]测试用标准溶液：反相色谱柱测试用的标准溶液为[/font]1×10[/font][sup][font='Times New Roman']-4[/font][/sup][font='Times New Roman']g/mL[font=宋体]尿嘧啶、 [/font][font=Times New Roman]1×10[/font][/font][sup][font='Times New Roman']-5[/font][/sup][font='Times New Roman']g/mL[font=宋体]联苯和蒽[/font][/font][font=宋体]（[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]荼[/font][/font][font=宋体]）[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]的甲醇溶液；正相色谱柱测试用的标准溶液为[/font]1×10[/font][sup][font='Times New Roman']-2[/font][/sup][font='Times New Roman']mL/mL[font=宋体]甲苯和[/font][font=Times New Roman]1×10[/font][/font][sup][font='Times New Roman']-4[/font][/sup][font='Times New Roman'] mL/mL[font=宋体]硝基苯的正己烷溶液。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font]2[font=宋体]）[/font][/font][font='Times New Roman'][font=宋体]将被测试的色谱柱接到检定合格的液相色谱仪器上，反相柱用甲醇[/font]+[font=宋体]水[/font][/font][font=宋体]（[/font][font='Times New Roman']85%+15%[/font][font=宋体]）[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]为流动相，正相柱用正己烷[/font]+[font=宋体]异丙醇[/font][/font][font=宋体]（[/font][font='Times New Roman']99.5%+0.5%[/font][font=宋体]）[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]为流动相，流速为[/font]1mm/s [/font][font=宋体]（[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]内径为[/font]4.6 mm[font=宋体]色谱柱，流量为[/font][font=Times New Roman]1.0mL/min[/font][/font][font=宋体]）[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]，紫外检测器波长为[/font]254 nm[font=宋体]，灵敏度选择适中。仪器稳定后，从进样口注入[/font][font=Times New Roman]10μL[/font][font=宋体]对应的色谱柱测试标准溶液，记录色谱图。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font]3[font=宋体]）[/font][/font][font='Times New Roman'][font=宋体]柱效（理论塔板数）和色谱峰对称性的计算[/font][/font][font='Times New Roman'][font=宋体]由式[/font] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font]2-1[font=宋体]）[/font][/font][font='Times New Roman'][font=宋体]计算液相色谱柱柱效理论塔板数，重复测量[/font]3[font=宋体]次，取平均值。[/font][/font][font=宋体][img=,321,93]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/03/202103182240263364_1649_3389662_3.jpg!w321x93.jpg[/img] [/font][font=宋体]（[/font][font=宋体]2-1[/font][font=宋体]）[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]式中[/font][/font][font=宋体]，[/font][i][font='Times New Roman']n[/font][/i][font=宋体]为[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]理论塔板数[/font][/font][font=宋体]；[/font][i][font='Times New Roman']t[/font][/i][sub][font=宋体]R[/font][/sub][font=宋体]为[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]色谱峰的保留时间，时间测量需精确到[/font]0.02min[/font][font=宋体]；[/font][font=宋体][img=,43,47]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/03/202103182241049856_7500_3389662_3.jpg!w43x47.jpg[/img]为[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]色谱峰半高峰宽[/font][/font][font=宋体]；[/font][i][font=宋体]L[/font][/i][font=宋体]为[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]色谱柱长[/font][/font][font=宋体]。[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]按照上述条件测得的色谱图中，按式[/font][/font][font=宋体]2-2[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]计算色谱峰的不对称因子[/font][/font][i][font='Times New Roman']A[/font][sub][font='Times New Roman']s[/font][/sub][/i][font=宋体]。[/font][i][font='Times New Roman']A[/font][sub][font='Times New Roman']s[/font][/sub][/i][font='Times New Roman'] =[/font][i][font='Times New Roman']b/α[/font][/i][font='Times New Roman'] [/font][font=宋体] [font=宋体]（[/font]2-[/font][font='Times New Roman']2[/font][font=宋体]）[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]式中[/font][/font][font=宋体]，[/font][i][font=宋体]a[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]，[/font]b[/font][/i][font='Times New Roman'][font=宋体]分别为通过[img=,34,58]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/03/202103182241458314_1702_3389662_3.jpg!w34x58.jpg[/img][/font][/font][font='Times New Roman'][font=宋体]峰高处、平行于峰底的直线被峰两侧及峰高截取的两线段的长度[/font][/font][font=宋体]。[/font][font=宋体][font=宋体]（[/font]4[font=宋体]）[/font][/font][font='Times New Roman'][font=宋体]液相色谱柱性能要求[/font][/font][font='Times New Roman'][font=宋体]柱效：反相色谱柱的理论塔板数一般在[/font]3~4[/font][font='Times New Roman']×10[/font][sup][font='Times New Roman']4[/font][/sup][font='Times New Roman']m[/font][sup][font='Times New Roman']-1[/font][/sup][font='Times New Roman'][font=宋体]范围内，正相色谱柱的理论塔板数在[/font]4~5[/font][font='Times New Roman']×10[/font][sup][font='Times New Roman']4[/font][/sup][font='Times New Roman']m[/font][sup][font='Times New Roman']-1[/font][/sup][font='Times New Roman'][font=宋体]范围内。[/font][/font][font='Times New Roman'][font=宋体]色谱峰对称性：被测峰[/font][/font][font=宋体]（[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]蒽[/font][/font][font=宋体]）[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]的不对称因子[/font][/font][i][font='Times New Roman']A[/font][sub][font='Times New Roman']s[/font][/sub][/i][font='Times New Roman'][font=宋体]一般在[/font][/font][font=宋体]0.8[/font][font='Times New Roman']~1.6[font=宋体]范围内。[/font][/font][font=微软雅黑][font=微软雅黑]领取更多《实战宝典》请进：[/font][/font][url=http://instrument-vip.mikecrm.com/2bbmrpI][u][font=微软雅黑][color=#0000ff]http://instrument-vip.mikecrm.com/2bbmrpI[/color][/font][/u][/url][font=微软雅黑] [/font]