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对于微生物培养,大家常用的是恒温培养箱、霉菌培养箱、震荡培养箱、恒温水浴箱、发酵罐等,满足了日常工作需要;当然,这都是针对好氧菌而言。 而对于厌氧菌和兼性好氧菌,则需要考虑选用合适的厌氧、微好氧/低氧培养装置(如厌氧培养盒/袋、厌氧罐以及专业的厌氧培养箱、厌氧工作站、微好氧/低氧培养箱、厌氧发酵罐/反应池等)。 常规的动物细胞培养,一般选用CO2培养箱、滚瓶培养装置、悬浮培养装置、生物反应器/细胞培养罐等。为更接近或模拟体内微环境,三气培养箱(即CO2培养箱加配O2传感器)逐渐为人们所熟知!当然,更专业的Biospherix 系列O2/CO2控制器加培养盒、H35微好氧/低氧细胞培养箱、X vivo 一体化细胞工作站等三气培养装置也给大家提供了更多的选择!
[size=2][font=宋体][color=#f10b00]维权声明:本文为wangna1986123 原创作品,本作者与仪器信息网是该作品合法使用者,该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为,我们将追究法律责任。[/color] 在针对土壤的研究阶段,导师给了[/font][/size][size=3][font=Times New Roman]3[/font][/size][size=3][font=宋体]字真言[/font][/size][b][font=宋体]‘土壤’“碳”[/font][/b][size=3][font=宋体],于是开始了碳的研究。本科阶段学的是园林专业,对于土壤的了解甚微。经过查阅资料,发现土壤有机碳矿化值得研究。于是进行了实验的展开。[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=宋体]查阅资料看到土壤矿化实验采用的是[/font][/size][b][font=宋体]室内培养法[/font][/b][size=3][font=宋体],查到的示意图如下图:[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/07/201007211628_231885_1634750_3.gif[/img][/font][/size][size=3][font=宋体]于是产生装置图概念如下:[b]磨口三角瓶[/b](底部平铺土样)、[b]吊线[/b]、[b]内置小瓶[/b](放氢氧化钠)。[/font][/size][size=3][/size][size=3][font=宋体]实验室具备条件:[/font][/size][b][size=3][font=Times New Roman]250ml[/font][/size][size=3][font=宋体]磨口广口瓶[/font][/size][/b][size=3][font=宋体]若干,其余自己想办法。[/font][/size][size=3][/size][size=3][font=宋体]鉴于实验室设备简陋,还有实验的特殊性,培养[/font][/size][size=3][font=Times New Roman]28[/font][/size][size=3][font=宋体]天,制定实验方案是培养后[/font][/size][size=3][font=Times New Roman]1d[/font][/size][size=3][font=宋体],[/font][/size][size=3][font=Times New Roman]4d[/font][/size][size=3][font=宋体],[/font][/size][size=3][font=Times New Roman]7d[/font][/size][size=3][font=宋体],[/font][/size][size=3][font=Times New Roman]14d[/font][/size][size=3][font=宋体],[/font][/size][size=3][font=Times New Roman]21d[/font][/size][size=3][font=宋体],[/font][/size][size=3][font=Times New Roman]28d[/font][/size][size=3][font=宋体]进行测定。测量土样共[/font][/size][size=3][font=Times New Roman]128[/font][/size][size=3][font=宋体]个,如此大批的土样,培养一个月,课业比较紧张,考虑到绝不能分批做,实验装置的制备就很重要。[/font][/size][size=3][/size][size=3][font=宋体]待解决问题如下:[/font][/size][size=3][/size][b][size=3][font=Times New Roman]1. [/font][/size][size=3][font=宋体]内置小瓶子的选择问题[/font][/size][size=3][/size][size=3][font=Times New Roman]2. [/font][/size][size=3][font=宋体]内置小瓶子与广口瓶的连接问题[/font][/size][size=3][/size][/b][size=3][font=宋体]某天看到组培一老师在用医用青霉素小药瓶在培养东西,于是想到了可以用来做内置小瓶子。然后就是怎么把小药瓶与广口瓶连接起来。试想下,要自己动手做[/font][/size][size=3][font=Times New Roman]100[/font][/size][size=3][font=宋体]多个实验装置,就这个准备工作工作量就很大。鉴于我们都有十字绣的功底,对线倒是不陌生,在对着小药瓶和广口瓶发愣了一会后,发现小药瓶和广口瓶的瓶口处可用线连接起来,具体如下:[b][color=red]将线裁成段,每段对折,在对折后形成的线头端,绑到小药瓶瓶颈,打活结,便于调整大小,将连有小药瓶的线绳绕广口瓶一圈,从线对折处将小药瓶掏出即可。测定的时候将广口瓶盖取出即能取出小药瓶。[/color][/b][/font][/size][b][color=red][size=3][/size][/color][/b][img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/07/201007211630_231889_1634750_3.jpg[/img][size=3][font=宋体]注意事项:[/font][/size][size=3][font=Times New Roman]1..[/font][/size][size=3][font=宋体]线绳长度不一,绑到小药瓶后,根据长度选择合适广口瓶绑定。[/font][/size][size=3] [size=3][font=Times New Roman] 2..[/font][/size][size=3][font=宋体]因广口瓶与小药瓶用线连接,密闭性受影响,涂大量凡士林进行密封。[/font][/size][size=3][/size][/size][size=3][font=宋体]优点:装置便于制作,且测定时易于拿取小药瓶,便于测量。[/font][/size][size=3][/size][size=3][font=宋体]缺点:密闭性较差。[/font][/size][size=3][/size]
作者: 陈文庆 王建超 刘华杰 高飞 张韧 (北京清大天一科技有限公司 102200 ) (《中国兽药杂志》 2010.44 ( 10 ): 37-41 )【摘要】 采用反应器全悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒与微载体悬浮培养Vero细胞生产狂犬病毒分别与相应的转瓶培养工艺生产案例对比分析,比较悬浮培养工艺与转瓶培养工艺的生产效益。分析显示,与转瓶培养工艺相比,反应器悬浮培养工艺获得的细胞密度、病毒效价、产品的产量和质量明显提高,生产时的能耗和劳动力需求明显降低。结果表明悬浮培养工艺的生产效益明显高于转瓶培养工艺,适宜于国内生物制品工业化生产的升级换代。【关键词 】 细胞培养;生物反应器;悬浮培养;微载体细胞悬浮培养技术是指细胞在生物反应器中自由悬浮于培养液内生长增殖的一种培养方法。根据细胞是否贴壁,又分为全悬浮细胞培养和贴壁细胞微载体培养。国际上该项技术发展较快,已趋向成熟,是疫苗、抗体等生物制品生产的普遍生产工艺模式。与转瓶培养技术相比,该工艺具有操作简单、产率高、容易放大等优点,本文结合口蹄疫病毒和狂犬病毒的生产,分别对细胞悬浮培养工艺与转瓶培养工艺的经济效益等进行了分析和分析。1. 全悬浮培养口蹄疫病毒与转瓶培养案例对比高效、安全的病毒性疫苗是防止口蹄疫情发生的最有效方法。BHK21细胞是繁殖FMDV的理想宿主,早在1962年Capstick PB等就实现FMDV的悬浮培养。1965年Telling, R.C.等实现在不锈钢发酵罐中悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗。目前国外(Intervet公司、Merial公司)普遍已经采用2000~5000L反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫苗。本文就本公司自主研发的650L生物反应器和无血清培养基进行悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗与转瓶培养工艺进行比较和分析。1.1主要材料细胞株:BHK21贴壁细胞株(中国兽医药品监察所)毒 株:FMDV-O型(某兽用疫苗企业)培养基:低血清MEM培养基(产品代号MD611)、BHK21细胞无血清培养基(北京清大天一科技有限公司)血 清:特级新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)仪 器:5 L反应器(德国贝朗),120L和650LCLAVORUS ® 生物反应器(北京清大天一科技有限公司)1.2实验方法1.2.1转瓶培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒将复苏的BHK21细胞在T75培养瓶中使用低血清培养基(含5%牛血清)培养,连续传代扩增接种15L转瓶,37 ℃培养48小时,传代比例为1:8-1:10,按常规方法接种病毒及维持液,细胞病变90%左右收获病毒液。1.2.2反应器全悬浮无血清培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒(1)贴壁细胞悬浮驯化培养:用BHK21细胞无血清培养基在恒温摇床或者方瓶中无血清驯化贴壁BHK21细胞,可采用直接驯化或者逐级降低血清驯化等方法,每代观察细胞数量和细胞活率,直至BHK21细胞在无血清培养基中的生长增殖速率正常,细胞活率达95%以上,并可连续稳定传代,说明细胞已适应无血清悬浮培养。(2)反应器用种子细胞扩增:采用反应器罐倒罐逐级放大技术,细胞从摇瓶→5 L反应器→120 L反应器→650 L反应器进行逐级放大培养。细胞培养方式为批培养,控制反应器各参数在正常范围:温度37.0 ℃、pH7.2~7.4、溶氧(DO)20~70%、搅拌转速50~150 r/min。(3)反应器培养口蹄疫病毒:待650 L反应器中细胞达到一定密度,提高培养pH至7.5左右,按一定比例直接接种口蹄疫病毒进行病毒维持培养,控制温度、pH、DO、搅拌转速等参数在合适范围,在线无菌间隔取样判断细胞病变情况并检测病毒毒价(LD50,TCID50),确定收获的最佳时间。1.3 细胞培养结果对比分别对低血清培养基15 L转瓶培养的贴壁BHK21细胞进行观察和细胞计数,反应器全悬浮培养的BHK21细胞取样进行数量和活率检测。培养条件和结果对比见表1。表1 转瓶培养和反应器全悬浮培养BHK21细胞对比http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/10/A1380442105_small.jpg http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/10/A1380442106_small.jpg http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/10/A1380442107_small.jpg 图1 转瓶BHK21细胞低血清培养48 hr,100X 图2 反应器全悬浮无血清培养48 hr,100X 结果显示,转瓶培养的BHK21细胞,培养48小时显微镜观察成致密单层,见图1,96小时细胞开始出现脱落死亡;反应器无血清全悬浮培养BHK21细胞48小时的细胞显微镜观察状态如图2,生长至96小时细胞密度可达5.4x106 cells/ml,活率维持在94%左右。从细胞数量比较,650L反应器培养一批的细胞数量相当于500~700个15 L转瓶培养的细胞总量。1.4 病毒培养效果对比两种不同培养工艺,细胞在满足活力要求的基础上,以同等条件分别接种FMDV病毒,取样测定病毒毒价,结果见表2。 表2 转瓶和反应器全悬浮培养BHK21细胞病毒毒价对比http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/10/A1380442112_small.jpg结果表明,无血清悬浮培养的口蹄疫病毒毒价(TCID50和LD50)检测不低于转瓶培养工艺。根据反应器低血清悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫完整病毒粒子(146S)检测较转瓶高10倍左右的情况,应用无血清悬浮培养工艺,杂蛋白含量更少,口蹄疫完整病毒粒子和口蹄疫疫苗质量均提高。1.5 反应器和转瓶经济效益估算对比依据培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒工艺过程要求,从细胞密度、病毒毒价、产品效力、资源环境、劳动力等方面进行简单对比,借以一窥二者的经济效益差别(见表3)。 表3 反应器无血清悬浮培养与转瓶培养BHK21细胞经济效益对比http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/10/A1380442114_small.jpg*按照反应器无血清悬浮培养一条生产线(5L-120L-650L)、转瓶体积15 L进行对比按照目前培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒质量要求,对悬浮无血清培养工艺的产能进行预估,一条5L-120L-650L的反应器生产线年生产病毒量约为2.1亿毫升,生产疫苗量约为4.2亿毫升。2. 人狂犬病毒微载体培养与转瓶培养的对比我国是受狂犬病危害最为严重的国家之一,近年报告狂犬病死亡人数均在2400人/年以上,一直位居我国各类传染病报告死亡数的前三位,根据有关国家成功控制狂犬病的经验,世界卫生组织提出倡议,到2020年消除人狂犬病。我国距此倡议目标还有大量工作要做,国内也对人用和兽用狂犬病疫苗的生产做了大量研究工作。下面就120L反应器微载体培养Vero细胞生产狂犬病毒效果与转瓶培养工艺和培养效果比较分析。2.1主要材料细胞株:Vero细胞株毒 株:aG株(细胞株和毒株均来自某人用疫苗企业)培养基:低血清199培养基(产品代号MD504)、 Vero细胞反应器培养用培养基(产品代号MD505), 均来自北京清大天一科技有限公司仪 器:5 L反应器(德国贝朗)、120LCLAVORUS ® 生物反应器(北京清大天一科技有限公司)血 清:特级新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)微载体:Cytodex 1 (美国GE