自动表检测器

#本文由马尔文帕纳科应用专家冯慧庆供稿# 基因治疗是生物制药行业中一个快速增长的领域，通过基因治疗可实现疾病的治疗或预防。其中，重组腺相关病毒(rAAV)是目前基因治疗领域研究较多的一类病毒载体。腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（Parvoviridae）家族的成员之一，一般，研究中采用的重组腺相关病毒载体（Recombination adeno-associated virus, rAAV）是在非致病的野生型AAV基础上改造而成的基因载体，由于其种类多样、免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广、扩散能力强、体内表达基因时间长等，rAAV被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之一。目前，rAAV的准确定量分析和表征的难度是阻碍基因治疗快速发展的关键因素。我们常常需要对rAAV进行综合全面表征，比如衣壳数量、实心率、颗粒尺寸、聚集体比例等。传统情况，rAAV滴度和病毒载量采用ELISA、ddPCR、AUC和EM等技术进行测量。但这些方法通常费时费力，而且精确度不高。本文通过GPC/SEC和多角度动态光散射（MADLS）两种分析技术分析rAAV5样品，展示了快速、准确和可靠地定量测量AAV的病毒滴度（AAV Titer）和实心率(% full AAV)的方法。 01仪器参数OMNISEC GPC/SEC多检测器系统非常适合于生物医药行业，可用于全面表征rAAV样品。OMNISEC包含一个示差折光检测器(RI)，紫外线全波长阵列检测器(UV-Vis 190-900 nm)和光散射检测器，仅需一次进样，可精确测量绝对分子量、聚集体比例、病毒滴度和实心率。与传统HPLC不同，测量过程不依赖柱保留体积，也不需要一系列标样进行色谱柱校正。图1显示了使用OMNISEC测量的CQA关键质量参数。02检测方法我们采用Empty和Full rAAV5两个样品作为分析案例。Full rAAV5 载有已知分子量为785 kg/mol的PFB-GFP ssDNA。经qPCR和ELISA测量方式可知，该样本的病毒滴度为2.5x1013。采用色谱柱P4000和P3000串联，对rAAV样品的进行色谱分离。由OMNISEC软件采集分析测试结果，其中硬件系统包含OMNISEC RESOLVE(包含泵、自动进样器和柱温箱)和OMNISEC REVEAL（包含示差、UV/PDA和直角90°/小角7°光散射检测器）。样品经过分离洗脱后，使用共聚物分析方法确定样品两种不同组分的浓度和分子量。计算方法如下：其中，ConcCapsid是衣壳浓度(mg/mL)，NA是阿伏伽德罗数，Mwcapsid是衣壳的分子量(g/mol)，ConcDNA是DNA浓度(mg/mL)，MwSeqDNA是来自序列的ssDNA的分子量。因此，通过计算出的颗粒浓度，可以很容易地得出样品实心率的百分比。 03检测结果案例一：图2显示了Empty rAAV5的三检测色谱图。RI信号由红色曲线表示，260 nm紫外信号由紫色曲线表示，直角光散射(RALS)信号由绿色曲线表示。样品包含四个部分：单体峰保留体积(RV)在12.5ml，碎片在16ml ，二聚体在10.5ml ，聚集体在8.5ml 。使用共聚物分析方法，可以得到表1结果。单体的分子量为3.84×106g/mol。衣壳的理论分子量为3.8×106g/mol，证实分析结果与预期相符。MW/Mn为分子量分布，描述了样品的分散性，单体和二聚体的值接近1，而聚集体和片段均显着高于1，表明在同一峰内有多个不同分子量的组分。Fraction of Sample表示样品组分百分含量，单体所占百分比为84.7%。Fraction of Protein显示了样品中衣壳的百分比，单体包含99.8%的衣壳。这证实了样本确实是Empty rAAV5。最后Empty rAAV5样品总滴度为5.91x1013Vp/ml。 案例二：第二个样品Full rAAV5的三检测器色谱图如图3所示。图中显示了与Empty rAAV5截然不同的色谱峰。分析色谱图可以看出，只包含两个不同的组分，其中单体峰，大概12.5ml RV处，包含Full 和Empty rAAV5的混合物，而聚集体出现在8ml RV处。测试结果见表2。对于主体的单体峰，计算出其混合物分子量为4.49×106g/mol，其中86%为衣壳。rAAV5的蛋白质组分的分子量为3.89×106g/mol，这与表1中Empty rAAV5 的数据一致。单体是总体的93.2%，样本的总滴度为7.48x1013VP/ml。其中单体包含78% Full rAAV5，22% Empty rAAV5。需要注意的是，这种分析方法假设样品要么是Full ，要么是Empty ，忽略部分装载或过度装载情况。Zetasizer Ultra纳米粒度及电位仪可以使用MADLS方式快速确定病毒滴度。从OMNISEC获得的数据与Zetasizer Ultra的粒子滴度进行了比较，两种技术之间有很好的相关性，见图4。另外，本文将Full rAAV5和Empty rAAV5以确定比例混合，来对Full rAAV5样品进行分析。表3显示了每个样品的预期值和实际值Full rAAV百分比。图5显示了期望值和实际值之间有很强的相关性，证实了OMNISEC确定样品实心率结果的可靠性。为了进一步评估OMNISEC对rAAV样品准确表征能力，我们进行了rAAV5样品的热应力稳定性研究，同时，基于ZS Ultra对聚集体的极高灵敏度，我们利用了ZS Ultra表征rAAV5聚集体的微小变化。测试条件是将rAAV5样品置于25oC到80oC之间进行测试。在不断加热过程中，在每个温度下测量rAAV5样品的粒径。在25oC和35oC之间，没有观察到粒径的变化。从35oC开始，可以观察到粒径开始增大，这表明样品开始发生变化(图6A)。30oC和45oC下的数据比较清楚地显示了这些样品之间的大小差异(图6B)。我们选择45oC条件，对OMNISEC进行进一步稳定性研究。将rAAV5样品在稳定在45oC，分别在2min 、5min、10min和15min后，取样品到OMNISEC上测试。图7色谱叠加图显示样品发生了明显的变化，聚集体百分含量增加，单体浓度含量降低。表4显示MW在此潜伏期内保持稳定，单体峰中的AAV百分比也保持稳定。结论：在这项研究中，我们展示了OMNISEC和Zetasizer Ultra在综合分析表征rAAV5样品的能力，以及将两者联合使用的应用价值。 OMNISEC多检测SEC系统将示差折光检测器、紫外全波长检测器、光散射检测器集成一体化设计，具有更高的灵敏度和准确度，通过一次进样分析，可提供各种血清型AAV样品的绝对分子量、衣壳大小、滴度、实心率、聚集体、片段和样品稳定性等关键质量属性。虽然这些参数中很多都可以使用传统的生物化学方法来确定，但OMNISEC提供了更为简单、可靠的方法，正逐渐成为一种表征分析AAV通用的技术工具。

基本信息 关键内容： 吹扫捕集,零气发生器,液相色谱仪,色谱检测器,自动进样器 开标时间： 2021-09-24 09:30 采购金额： 150.00万元 采购单位： 江苏省盐城环境监测中心 采购联系人： 曹磊 采购联系方式： 立即查看 招标代理机构： 江苏瑞杰项目管理顾问有限公司 代理联系人： 郑娟 代理联系方式： 立即查看 详细信息 2021年省级环境监测仪器设备标准化建设项目采购公告 江苏省-盐城市-盐都区 状态：公告 更新时间： 2021-09-02 2021年省级环境监测仪器设备标准化建设项目招标公告 项目概况 2021年省级环境监测仪器设备标准化建设项目招标项目的潜在投标人应在江苏瑞杰项目管理顾问有限公司（地址：江苏省盐城市盐都区北大科技园408室）获取招标文件，并于2021年9月24日9点30分（北京时间）前递交投标文件。 一、项目基本情况 项目编号：JSZC-320000-JSRJ-G2021-0001 项目名称：2021年省级环境监测仪器设备标准化建设项目 预算金额：150万元 最高限价：150万元 采购需求：详见招标文件 供货期：合同签订之日起60日内供货至采购人指定地点。(具体实施时间以甲方通知为准) 二、申请人的资格要求： 1.满足《中华人民共和国政府采购法》第二十二条规定，并提供下列材料； (1)法人或者其他组织的营业执照等证明文件，自然人的身份证明； (2)上一年度的财务报表（成立不满一年不需提供）； (3)依法缴纳税收和社会保障资金的相关材料； (4)具备履行合同所必需的设备和专业技术能力的书面声明； (5)参加政府采购活动前3年内在经营活动中没有重大违法记录的书面声明； 2.落实政府采购政策需满足的资格要求：无 3.本项目的特定资格要求： （1）单位负责人为同一人或者存在直接控股、管理关系的不同供应商，不得参加同一合同项下的政府采购活动。 （2）未被“信用中国”网站（www.creditchina.gov.cn）列入失信被执行人、重大税收违法案件当事人名单、政府采购严重失信行为记录名单。 （3）本项目不接受联合体投标。 （4）本项目中吹扫捕集分析仪、臭氧传递仪、液相色谱自动进样器、液相色谱荧光检测器、高纯零气发生器（含空压机）、手持式臭氧测定仪、三维自动取样器（双针）、双道背景扣除数字光度计接受进口产品投标。 三、获取招标文件 时间：自本公告发布之日起5个工作日 地点：江苏瑞杰项目管理顾问有限公司（江苏省盐城市盐都区北大科技园408室） 方式：各投标人须在2021年9月3日―2021年9月9日（仅工作日），上午08:30-11:30，下午14:00-17:30携带营业执照（副本）复印件、单位介绍信或授权委托书（注明联系方式、邮箱号码）复印件、经办人身份证复印件（加盖单位公章）至江苏瑞杰项目管理顾问有限公司（江苏省盐城市盐都区北大科技园408室）报名；或通过微信添加朋友的方式（微信号：ruijiezixun666）来完成项目的报名及招标文件的购买，将报名材料以扫描件的形式发送至微信，须致电告知报名联系人（报名联系人电话：17306251137），招标文件工本费陆佰元，无论中标与否均不予退还。 四、提交投标文件截止时间、开标时间和地点 提交投标文件截止时间：2021年9月24日9点30分（北京时间） 开标时间：2021年9月24日9点30分（北京时间） 地点：江苏省盐城市盐都区潘黄街道北大科技园406会议室 五、公告期限 自本公告发布之日起5个工作日。 六、其他补充事宜 投标文件正本 1 份，副本 4 份。 七、对本次招标提出询问，请按以下方式联系。 1.采购人信息 名 称：江苏省盐城环境监测中心 地 址：江苏省盐城市文港北路7号 联 系 人： 曹磊 联系电话：15950208899 2.采购代理机构信息 名 称：江苏瑞杰项目管理顾问有限公司 地 址：江苏省盐城市盐都区北大科技园4楼 联 系 人： 郑娟 联系电话：13815572226 3.项目联系方式 项目联系人：曹磊 电 话：15950208899 × 扫码打开掌上仪信通App 查看联系方式 基本信息 关键内容：吹扫捕集,零气发生器,液相色谱仪,色谱检测器,自动进样器 开标时间：2021-09-24 09:30 预算金额：150.00万元 采购单位：江苏省盐城环境监测中心 采购联系人：点击查看 采购联系方式：点击查看 招标代理机构：江苏瑞杰项目管理顾问有限公司 代理联系人：点击查看 代理联系方式：点击查看 详细信息 2021年省级环境监测仪器设备标准化建设项目采购公告 江苏省-盐城市-盐都区 状态：公告 更新时间： 2021-09-02 2021年省级环境监测仪器设备标准化建设项目招标公告 项目概况 2021年省级环境监测仪器设备标准化建设项目招标项目的潜在投标人应在江苏瑞杰项目管理顾问有限公司（地址：江苏省盐城市盐都区北大科技园408室）获取招标文件，并于2021年9月24日9点30分（北京时间）前递交投标文件。 一、项目基本情况 项目编号：JSZC-320000-JSRJ-G2021-0001 项目名称：2021年省级环境监测仪器设备标准化建设项目 预算金额：150万元 最高限价：150万元 采购需求：详见招标文件 供货期：合同签订之日起60日内供货至采购人指定地点。(具体实施时间以甲方通知为准) 二、申请人的资格要求： 1.满足《中华人民共和国政府采购法》第二十二条规定，并提供下列材料； (1)法人或者其他组织的营业执照等证明文件，自然人的身份证明； (2)上一年度的财务报表（成立不满一年不需提供）； (3)依法缴纳税收和社会保障资金的相关材料； (4)具备履行合同所必需的设备和专业技术能力的书面声明； (5)参加政府采购活动前3年内在经营活动中没有重大违法记录的书面声明； 2.落实政府采购政策需满足的资格要求：无 3.本项目的特定资格要求： （1）单位负责人为同一人或者存在直接控股、管理关系的不同供应商，不得参加同一合同项下的政府采购活动。 （2）未被“信用中国”网站（www.creditchina.gov.cn）列入失信被执行人、重大税收违法案件当事人名单、政府采购严重失信行为记录名单。 （3）本项目不接受联合体投标。 （4）本项目中吹扫捕集分析仪、臭氧传递仪、液相色谱自动进样器、液相色谱荧光检测器、高纯零气发生器（含空压机）、手持式臭氧测定仪、三维自动取样器（双针）、双道背景扣除数字光度计接受进口产品投标。 三、获取招标文件 时间：自本公告发布之日起5个工作日 地点：江苏瑞杰项目管理顾问有限公司（江苏省盐城市盐都区北大科技园408室） 方式：各投标人须在2021年9月3日―2021年9月9日（仅工作日），上午08:30-11:30，下午14:00-17:30携带营业执照（副本）复印件、单位介绍信或授权委托书（注明联系方式、邮箱号码）复印件、经办人身份证复印件（加盖单位公章）至江苏瑞杰项目管理顾问有限公司（江苏省盐城市盐都区北大科技园408室）报名；或通过微信添加朋友的方式（微信号：ruijiezixun666）来完成项目的报名及招标文件的购买，将报名材料以扫描件的形式发送至微信，须致电告知报名联系人（报名联系人电话：17306251137），招标文件工本费陆佰元，无论中标与否均不予退还。 四、提交投标文件截止时间、开标时间和地点 提交投标文件截止时间：2021年9月24日9点30分（北京时间） 开标时间：2021年9月24日9点30分（北京时间） 地点：江苏省盐城市盐都区潘黄街道北大科技园406会议室 五、公告期限 自本公告发布之日起5个工作日。 六、其他补充事宜 投标文件正本 1 份，副本 4 份。 七、对本次招标提出询问，请按以下方式联系。 1.采购人信息 名 称：江苏省盐城环境监测中心 地 址：江苏省盐城市文港北路7号 联 系 人： 曹磊 联系电话：15950208899 2.采购代理机构信息 名 称：江苏瑞杰项目管理顾问有限公司 地 址：江苏省盐城市盐都区北大科技园4楼 联 系 人： 郑娟 联系电话：13815572226 3.项目联系方式 项目联系人：曹磊 电 话：15950208899

液相色谱检测器种类较多，如何选择合适的检测器？以及为什么这样选择？之前的推文中我们陆续盘点了UV、DAD、ELSD等检测器，今天再跟大家聊一聊示差检测器。盘点那些年我们用过的液相检测器（一）一、RI 示差折光检测器原理简介关注我们RID是一种偏转式或者斯涅尔式折射率检测器。斯涅尔定律指出，平行光束沿着一个大于零的入射角通过一个将两种具有不同折射率的介质分开的电介质界面时，其折射率将与两种介质的折射率差幅成函数关系。二、示差检测器结构关注我们示差折光检测器结构示意图1、钨灯 2、聚光透镜 3、狭缝 4、准直镜 5、狭缝 6、检测池 7、反光镜 8、零位玻璃 9、光敏接收元件低功率、长寿命的钨灯发射出的光线经过准直透镜和狭缝后，通过参比池（参照池）和样品池（样本池），经平面镜反射回来后，再次通过光学单元，最后通过透镜聚焦到一对光传感二极管上（光传感器）。在测试期间，参比池和样品池中充满流动相。参比池随后与流路隔开，流动相仅流过样品池。如果两个池中介质的折射率没有差异，光线在通过它们时将不会发生折射。1 光束2 样本池3 参照池4 光轴（NsNr）5 光轴（Ns=Nr）6（4）和（5）在光传感器处的间距7 光传感器Ns：样本池中流动相的折射率Nr：参照池中流动相的折射率光线照射到一对光电二极管上，其中每个光电二极管都将给出一个电信号。随后这些信号会被放大，从而测得两个信号之间的差异。如果是零折射，这些信号之间的差异应该为零伏。借助一个电控机械联动装置，用户可以通过光路中的折射透镜来优化光电二极管的零偏转输出。还可以通过额外电路轻松地将信号输出校正为电子零点。1 光传感器A2 光传感器B3 光束当流动相的折射率发生变化时，通过样品池和参比池之间界面的光将被折射，从而使一个光电二极管上的光强增大，另一个电二极管上的光强减小。这种差异产生具有振幅和极性的信号，此信号被放大后，可以驱动图表记录仪。三、应用举例关注我们示差折光检测器是一种通用型检测器，只要被测组分与洗脱液的折光指数有差别就可使用。生命科学中常遇到各类糖类化合物，没有紫外吸收，一般常用示差折光检测器，她的通用性比UVD广，但灵敏度要低，对温度变化敏感，并与梯度洗脱不相容，因而限制了它的使用。应用一：麦芽糖、果糖、葡萄糖、异麦芽糖、麦芽三糖色谱条件色谱柱：月旭Xtimate NH2（4.6×300，5μm）。流动相：乙腈:水=75：25；检测器：RID；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；进样量：50μL。色谱图应用二：磷酸果糖二钠、蔗糖、葡萄糖、果糖色谱条件色谱柱：月旭Xtimate sugar-Ca（7.8×300mm，8μm）。流动相：纯水；检测器：RID；温度：柱温75℃，检测器40℃；流速：0.2mL/min；进样量：10μL。色谱图四、示差检测器维护关注我们要想获得良好的实验结果，使用RID的三大法宝：第一、脱气；第二、平衡好流动相；第三、保持恒温恒压。在实际工作中我们会遇到很多典型的问题，接下来我们一起来分析一下这些问题如何破。五、使用注意事项关注我们1、正确放置溶剂瓶和废液瓶。要把溶剂瓶放在比示差监测器和溶剂泵还要高的位置，检测器出口留足够长的废液管通到下方的废液瓶，这样可以使样品池有一定背压，有利于检测信号的稳定。2、循环使用流动相。建议循环使用流动相。在没有进行分析时，打开循环阀，让流动相进行循环，这样泵就可以连续运行不必停止，一直到进行下一个分析。这样操作不仅可以节省流动相，而且检测器可以连续稳定的运行，随时进行样品分析。3、示差折光检测器不能用做梯度洗脱。由于介质的改变和压力的波动都会影响基线的稳定性，所以使用示差折光检测器时不能进行梯度洗脱。4、保证检测器的温度恒定。光学系统和流动相的温度对基线的稳定性影响很大。示差折光检测器可在比室温高5℃到55℃的范围内控温。建议将温度设为比室温高5℃，并确保柱温箱的温度与检测器保持一致。温度不宜过高，因为介质的折光指数随温度升高而降低，温度过高会使灵敏度降低。5、不可让流通池承受过大的压力。示差折光检测器流通池的反压约为1000psi，如果还要在系统里连接其他检测器。即示差折光检测器在流路系统里必须放在最后，以防压力增大时损坏流通池。6、某些溶剂随长时间存放而改变会造成基线的漂移。例如乙腈/水的混合物中乙腈的含量会降低，四氢呋喃会变成过氧化物，在吸湿性有机溶剂中的水量会增加，而保存在参比流通池中的溶剂如四氢呋喃会产生气体。因此，流动相最好做到临用现配或在有效期内使用。对于含有有机溶剂的流动相一般有效期3天，对于不含有机溶剂的流动相如纯盐或者纯水则根据室温情况，可临用现配或是配置好4℃冷藏，取用前先放置至室温。7、避免流动相和特定的色谱柱反应。某些流动相和特定的色谱柱反应，会产生长时间的噪声，例如乙腈/水流动相和氨丙基键合固定相在一起会出现这一现象。要判断长时间的噪声是否是由流动相/色谱柱的反应而产生，应该使用限流毛细管代替色谱柱，考查示差折光检测器的性能。