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α-淀粉酶活性是衡量小麦穗发芽的一个生理指标,为此提出了对小麦α-淀粉酶活性的快速测定方法的研究。α-淀粉酶活性的测定方法有多种,本文仅探讨了常用的3,5-二硝基水杨酸法和凝胶扩散法。结果表明,两种方法的测定结果差异不显著,而且两者呈显著正相关;从变异系数上看,后者的变异程度较低,其精度较高;从误差来源上看,前者引起误差的因素较后者多;后者较为简便快速,准确度较高,重复性较好,可用于大批量样品的分析。关键词: 小麦, α-淀粉酶活性, 3,5-二硝基水杨酸法,凝胶扩散法1 材料和方法1.1 材料和试剂(1)萌芽的小麦:取当年小麦种子,按小麦萌发试验培养,两天后用于测验.(2)1%淀粉溶液.(3)0.4N NaOH.(4)pH5.6的柠檬酸缓冲液:A. 称取柠檬酸20.01克,溶解后稀释至1升;B.称取柠檬酸钠29.41克,溶解后稀释至1升。取A液13.7毫升与B液26.3毫升混匀,即为pH5.6的缓冲液.(5)3,5-二硝基水杨酸: 精确称取3,5-二硝基水杨酸1克溶于20毫升1N氢氧化钠中,加入50毫升蒸馏水,再加入30克酒石酸钾钠,待溶解后,用蒸馏水稀释至100毫升,盖紧瓶塞,勿使二氧化碳进入.(6)麦芽糖标准液:称取麦芽糖0.100克溶于少量蒸馏水中,仔细移入100ml容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度.(7)α_淀粉酶提取缓冲液:20mmol/L醋酸钠(2.7216g/L),1mmol/L氯化钙(0.11099g/L),pH 5.5.(8)%5(V/V)碘—碘化钾溶液:1.95gKI+0.65gI2溶解在100毫升蒸馏水中.(9)α_淀粉酶36.18u/mg (Sigma公司):逐级稀释10, 2.5,0.625 ,0.15625,0.03906, 0.009765mg/mL系列标准液.(10)20%冰乙酸,琼脂糖,可溶性淀粉.1.2 方法1.2.1 3.5一二硝基水杨酸测定法酶液提取从五个培养皿的发芽小麦中,各随机称取1克于研钵中,加少许α_淀粉酶提取缓冲液,研磨至匀浆,倒入离心杯中,于4000rpm离心10分钟,取上清液并并定容至25ml,即为酶提取液,备用。α_淀粉酶活性测定(1)取试管,注明对照管,测定器,每样品三个重复.(2)于每试管中各加酶液1ml,加70℃恒温水浴中加热15分钟,此期间β_淀粉酶受热钝化(3)每管中各加入1毫升pH5.06的柠檬酸缓冲液.(4)对照管中加入4毫升0.4NnaOH.(5)测定管与对照管置40℃水浴中保温10分钟,再向各管加入40℃下预热的淀粉溶液2毫升摇匀,立即放入40℃水浴中准确保温5分钟取出,向各测定管迅速加入4毫升0.4N的氢氧化钠,以终止酶活动.麦芽糖测定取以上各管中酶作用后的溶液及对照管中溶液各2毫升,分别放入25毫升试管中,再加2毫升3,5-二硝基水杨酸,混匀,置水浴中5分钟,冷却后定容至25毫升,混匀,用分光光度计在520nm波长下进行比色记录消光值,取麦芽糖标准液(1ml/mg)0,0.2,0.6 ,1.0,1.4,1.8,2.0ml。按上述同样方法比色后,将测得的消光值与麦芽糖标准液进行直线回归后,代入求得样品的麦芽糖含量,并换算成每克种子α_淀粉酶的活力单位。1.2.2 凝胶扩散测定法凝胶板制备取一长方形优质玻璃,除一宽边外,其余三边边缘各边一条透明胶片,再在上面盖一同等大小玻璃,两块玻璃两侧用夹子固定,放温箱中预热50-60℃,取三角烧杯,加30毫升α-淀粉酶提取缓冲液,0.36克琼脂糖和0.30克可溶性淀粉(作反应底物),在电炉上加热煮沸至透明后,冷却至70℃左右,将预热的玻璃胶片框架斜放在桌面上30℃,用预热的移液管吸取凝胶液,从玻璃架高一端空隙中均匀注入,直至其流遍整个胶片表面为止,不能有气泡。用量约25毫升冷却后形成凝胶板,贮存在4℃冰箱备用。α_淀粉酶活性测定取出预制冷藏的凝胶板,揭开上面一块玻璃,用塑料打孔器在凝胶板上每隔一定距离打一个1.33毫米的孔,用微量移释管向每孔内注入提取液。上述1.2.1制得的酶液于70℃水浴加热15分钟后钝化β-淀粉酶后备用。同时,在每块凝胶板孔中加入淀粉酶系列标准液(重复两次)。将凝胶板置10℃恒温箱中反应24小时后,取出,将胶板浸入I-KI溶液中染色5min,加入冰乙酸酸化终止反应。用蒸馏水淋洗3min,洗净染色液,由于加α_淀粉酶孔周围淀粉被分解,因而染色后出现未能染色的圆。未与α-淀粉酶反应的呈蓝色,用直径测量仪测圆直径。用α_淀粉酶标准液浓度对数与褪色圈直径直线回归,计算每克样品含α-淀粉酶活力单位数。2 结果和分析2.1 两种方法标准曲线2.1.1 麦芽糖标准曲线麦芽糖标准液含量越高,比色后记录的OD值越大,麦芽糖标准液比色后,测得的OD值(x)与麦芽糖浓度(y)进行直线回归,结果为:y=1.0240x+0.0897,r=0.9998,相关系数极显著,表明麦芽糖标准液含量与消光值呈直线关系,通过此直线方程可进一步测得酶活性;即将各样品的消光值代入回归方程,求得样品麦芽糖含量,然后计算可得每克种子的α_淀粉酶活力。2.1.2 α-淀粉酶标准曲线α_淀粉酶标准液浓度越高,其褪色圈直径越大,5个样品的褪色圈直径也有明显差异。将α-淀粉酶标样所测得褪色圈直径(x)与α-淀粉酶浓度对数(y)进行直线回归。结果为:y=2.4659x-3.8994, r=0.9860,相关系数极显著,表明褪色圈直径与淀粉酶标准液的浓度对数呈直线关系,通过此直线方程可进一步测得酶活性,即将各样品的褪色圈直径代入回归方程,求得各样品的α_淀粉酶浓度,然后换算成每克种子中α_淀粉酶的活力单位。2.2 两种方法测定结果比较对5个样品的淀粉酶活性,用两种方法测定,并记录了测定结果(表1)。表1 3,5-二硝基水杨酸法和凝胶扩散法结果 样品 3,5-二硝基水杨酸法 凝胶扩散法 消光值 酶活性 (u/g) 直径 酶活性(cm) (u/g) 1 0.1010 2.191.20 4.03 2 0.1580 6.701.35 6.72 3 0.1460 5.241.27 5.06 4 0.1667 6.961.45 7.14 5 0.1477 5.481.28 5.86对两组样本进行t测验,测定结果为:t=1.2855, t0.05=2.0776,|t|r0.05,表明两种结果相关系数显著,即两种方法从其中之一测定结果可以推算出另一方法的测定结果。2.3 两种方法的精度比较表2 两种方法变异数分析结果 方法 平均数(u/g) 标准差(u/g) 变异系数CV(%) 3,5-二硝基水杨酸法 5.314 [
药典胰淀粉酶的测定中2000年版的和2005年版的标准检测所用的碘液浓度分别是0.1mol/L和0.05mol/L,为什么变化这么大呢,检测出来的结果差距也很大,用2000版的测得10万单位的酶活用2005年版才测得5万,而且我发现用2005年版的话空白减样很难控制在2.0-4.0mL之间,谁知道现在测胰酶最新版是哪个版吗,用的碘浓度是0.1的还是0.05的?
在不溶性膳食纤维的测定中,会用到的α-淀粉酶的性状,有人知道不?正常的α-淀粉酶是不是有一股臭脚丫的味道?知道的请回个贴吧,谢谢![em0808]