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通过白头翁检测说事 该药材为毛莨科植物白头翁干燥根。其外表皮呈黄棕色或棕褐色,根头部有不规则纵皱纹或纵沟,近根头部有白色绒毛,故而得名。主要药用成分为白头翁素、白头翁皂苷等。该药材具有清热解毒,凉血止痢,镇静镇痛,抗真菌之功效,还可用于治疗肝癌等疑难病症。通过它的药理作用和药名我们也可以想到伟大的国际医师白求恩大夫。 下面我们就介绍下高效液相色谱法检测白头翁药材中白头翁皂苷B4含量的内容吧。实验原理 精密称取适量粉末样品,加甲醇溶解并超声提取,经进样器进入高效液相色谱系统,经色谱柱分离,紫外检测器检测,保留时间定性,峰面积定量计算(外标法)。仪器及试剂 仪器:高效液相色谱仪(紫外检测器+等度泵+柱温箱),溶剂过滤器,超声波清洗仪,三号筛(药典筛)等。 试剂:甲醇(色谱纯),超纯水等样品溶液制备 对照品溶液制备:精密称取5.0mg白头翁皂苷B4对照品于50ml容量瓶中,加甲醇至刻度,配制成每0.1mg/ml的白头翁皂苷B4对照品溶液,备用。 供试品溶液制备:取本品适量粉碎后过三号筛(药典筛),精密称取过筛粉末0.2g置于具塞锥形瓶中,加甲醇10ml,密封,超声处理 30分钟,放冷后[/
白头翁是毛茛科白头翁属的多年生草本植物。它还有两个有趣的别名,一个叫“毛姑朵花”,一个叫“老公花”。白头翁有个特点:即全株密披白色的长柔毛。特别是它的花,花萼长得像花瓣一样,蓝紫色的花萼上也披上了白色的柔毛。每逢四五月间,它便开出药黄色的小花朵来。白头翁在我国华北、东北以及江浙等地的野外都有生长,等待着人们去挖掘和利用。它有什么可用之处呢?原来,白头翁的根可以入药,有清热解毒的功效。说起来这里面还有一个故事呢。从前,在大湖边上有座牛头山。山下有个村庄,村里有个小伙子叫阿宝。阿宝性情开朗,心地善良,又乐于助人,大伙儿都很喜欢他。可是有一天,阿宝突然闹肚子疼,那痛非比一般,痛得阿宝头上直冒冷汗,连手脚都发凉了。当时恰巧左邻右舍的人上山的上山,下地的下地,都干活儿去了,没人帮助。阿宝疼得实在忍受不住了,只好捂着肚子自己挣扎着去找邻村的郎中看一看。他强忍疼痛刚走出村口,就实在支持不住了,一头便倒在路边的草地上。不知过了多久,阿宝突然醒来,看见一位白发苍苍的老爷爷拄着拐棍站在他身边。老爷爷问阿宝怎么会躺在路边上,阿宝无力地回答说:“肚子疼得利害,实在走不动了。”老爷爷说:“那就找点药吃吧。”阿宝说:“让我上哪儿去找呢?”老爷爷用拐棍指着阿宝身边的草地,草地上有一棵顶头上长着绒绒白毛的绿草,说:“这草的根就是药,你挖一些回去熬汤,连喝几次就会好的。”阿宝心想:这草倒是常常见,山坡野地到处都是,果真能治病吗?老爷爷不等阿宝开口,仿佛早就看穿了阿宝心里的疑问,他捋着胡须说:“我已是满头白发的老人了,还会用瞎话骗你吗?”说完就缓缓转身离去了。阿宝决心试一试,他忍住痛挖了一些那种顶头上长白毛的绿草,回到家把草根熬水喝了,这一宿肚子就不怎么疼了。一连喝了三天,病就全好了。邻舍们来看望阿宝,也就知道阿宝的病是吃了一种草根治好的。 阿宝病好了,又上山砍柴。这一天,阿宝在去砍柴的山路上又碰上了上次的那位白发苍苍的老爷爷,老爷爷拄着拐棍挺有精神地站在那儿,远远看去,白胡子飘飘的,活像一位山里的神仙。阿宝急忙走上前去说:“谢谢你,老爷爷,你让我吃的药真好,我喝了几回,病就好利索了。”白发老爷爷笑呵呵他说:“小伙子,我正想告诉你,那是我家祖传的秘方。我见你心地善良又肯帮助村里的人,我是想借你的嘴帮我传给世人呢。”阿宝点头答应了。白发老爷爷又突然不见了。从那以后,村里的人不管是谁,要是犯了肚子疼痛的毛病,阿宝都会不分白天黑夜地扛上一把锹,到野地里去挖那种顶头上长白绒毛的绿草,回来就用草根煎水送给病人喝。喝过之后,肚疼毛病就都治好了。有人好奇地向阿宝打听,这是什么药,阿宝什么时候学会用草药治病的,阿宝是厚道人,他就一五一十地把他如何肚疼,如何遇见白发老爷爷等等,都告诉了大伙儿。人们又追问老爷爷上哪儿去了,问得阿宝直后悔:是呀,怎么就没问问白发老爷爷的住处呢?第二天,阿宝就跑到第二次碰上老爷爷的地方,想再谢谢老爷爷,再说以后有什么事也好再当面请教。可是,阿宝等了一天又一天,一连等了半个月,也没见白发老爷爷再出现。
[size=14px] [/size] [size=14px]白头翁皂苷B4(Anemoside B4,AB4)是一种来自白头翁 ( Pulsatilla chinensis)的三萜皂苷,具有显著的抗炎活性,可用于治疗炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)。然而,由于其高分子量和明显的水溶性,其应用受到限制。通过合成AB4衍生物发现治疗IBD的新的有效药物是一种可行的策略。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]1、AB4 C-3 连接的寡糖是其抗炎活性的重要基团[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]在合成两种AB4衍生分子探针的过程中,作者发现AB4-生物素(AB4-Biotin)和AB4-香豆素(AB4-coumarin)与AB4相似,具有抗炎活性。白头翁苷D(pulsatilloside D)没有抗炎作用,白头翁苷D的结构与AB4极其相似,仅与苷元C-3连接的糖链略有不同,这表明糖链可能在其抗炎活性中发挥着至关重要的作用。与AB4相比,两种分子探针仅在苷元的C-28处具有不同的取代基,表明这些基团可以被替换以制备更多的AB4衍生物。然后,通过活性筛选,有可能获得抗炎活性更强、理化性质更好的化合物。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]图片[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]图1 化学结构(A)AB4,(B)Pulsatilloside D,(C)AB4-Biotin,(D)AB4-coumarin[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]2、AA3对DSS诱导的结肠炎小鼠没有治疗作用[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]在作者之前的研究中,使用NaOH去除C-28连接的寡糖,得到白头翁苷A3(AA3),从理化性能来看,AA3较AB4有显著的改进。之前研究发现,AA3可通过抑制PGE2-EP4的激活和Th17细胞分化来减轻EAE小鼠的炎症损伤,同时,AA3还抑制TLR4/NF-κB/MAPK信号通路,诱导M1巨噬细胞极化,因此作者评估了AA3对IBD的潜在治疗作用。不幸的是,通过疾病活动指数评分、体重和结肠长度等指标的评估发现AA3对DSS诱导的小鼠结肠炎没有治疗作用。作者在本研究中以AA3为起始原料,设计并合成了一系列AB4衍生物。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]图片[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]图2 AA3对DSS诱导的结肠炎小鼠没有治疗作用[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]3、AB4 衍生物的体外抗炎作用[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]作者首先合成了28种AB4衍生物,其中化合物A3?4、A3?19、A3?27和A3?29表现出较强的细胞毒性,而其余化合物对THP-1细胞的活力影响不大。前期作者发现丙酮酸羧化酶(PC)是AB4治疗IBD的分子靶点,作者本研究发现A3-6、A3-7、A3-10、A3-16、A3-24、A3-26和A3-28抑制PC酶活性与AB4相当。为了探索上述7种AB4衍生物的抗炎活性,作者研究了这七种化合物对NF-κB信号通路激活的影响,因为它已被证明是炎症性疾病的关键信号通路。Western blotting分析结果显示,A3?6和A3?24比AB4更能有效抑制p-IκBα蛋白水平(NF-κB 激活由IκBα的磷酸化介导),并表现出更好的抗炎活性。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]图片[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]图3 蛋白质印迹检测IκBα[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]作者进一步证实 A3?6 的抗炎活性,发现A3?6能够以浓度依赖性方式抑制LPS诱导的p-p65和p-IκBα增加,激活的NF-κB通路促进多种促炎基因的表达,且与AB4 相比表现出优异的抗炎活性。此外,A3?6而不是AB4能够更显著抑制NLRP3炎症小体的激活来减轻炎症反应。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]图片[/size] [size=14px] [/size][size=14px]图4 A3?6通过抑制NF-κB和NLRP3炎症小体途径发挥抗炎作用[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]4、A3?6 改善DSS诱发的结肠炎[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]为了评估A3?6对溃疡性结肠炎小鼠的治疗效果,作者使用DSS诱导的实验性结肠炎模型来评估A3?6的体内抗炎作用,发现A3?6减少了DSS引起的结肠炎小鼠体重减轻,降低疾病活动指数,改善结肠缩短。此外,治疗后体重和器官指数没有明显变化,表明 A3?6 对小鼠的毒性较低。这些结果表明A3?6改善了DSS诱导的实验性结肠炎,且不会对小鼠产生毒性。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]图片[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]图5 A3?6 改善DSS诱发的结肠炎[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]5、A3?6 与丙酮酸羧化酶(PC)结合[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]作者之前的研究通过蛋白质组学发现AB4显著改变了TNBS诱导的大鼠中的丙酮酸代谢和三羧酸(TCA)循环中的蛋白。PC是TCA的关键酶,有报道其参与影响炎症反应,且作者最近的研究表明AB4作为一种新型PC抑制剂,可以与PC结合,抑制 LPS 驱动的炎症和氧化应激。基于以上发现,作者推测PC可能是AB4衍生物A3?6的直接目标。于是通过分子对接预测了两者的结合及结合位点,通过SPR、CETSA、DARTS证实了A3?6 与PC直接结合。免疫荧光分析显示A3?6的类似物A3?10(AB4-香豆素)可以进入THP-1细胞并与线粒体中的PC共定位,进一步证实了A3?6直接与PC结合。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]图片[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]图6 A3?6 与丙酮酸羧化酶(PC)结合[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]6、A3?6的体外抗炎作用依赖于PC[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]A3?6可以特异性结合PC,但尚不清楚A3?6如何调节PC。作者用蛋白质印迹发现A3?6不影响PC 的蛋白质水平,进而酶活检测发现A3?6显著降低 LPS 诱导的 PC 活性。进一步研究发现A3?6 的抗炎作用与PC活性相关。这些结果表明PC在A3?6的抗炎作用中发挥着至关重要的作用。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]图片[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]图7 A3?6的体外抗炎作用依赖于PC[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]7、PC 在体内介导A3?6的抗结肠炎作用[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]为了研究A3?6对DSS诱导的结肠炎的治疗效果是否依赖于体内PC,作者研究了DADA(一种PC激动剂,用于提高PC活性)对A3?6治疗小鼠的作用。发现A3?6 有效缓解了DAI评分的增加和结肠长度的缩短,然而,DADA的存在逆转了A3?6对结肠炎的作用。更重要的是,最低剂量的A3?6的治疗效果并不弱于AB4。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]图片[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]图8体内评估A3?6的抗结肠炎作用[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]接着作者检测了促炎细胞因子IL-6水平,发现A3?6 对 IL-6 的释放表现出浓度依赖性抑制作用,DADA 显著逆转了A3?6 治疗小鼠的结肠促炎细胞因子 IL-6 水平,PC催化丙酮酸羧化为草酰乙酸,草酰乙酸是TCA循环中不可或缺的代谢物。作者发现A3?6也能影响体内 PC 活性和丙酮酸代谢,此外,A3?6抑制小鼠结肠组织中DSS诱导的IκBα降解和P65磷酸化,并且DADA有效逆转了A3?6的作用,这些结果进一步证实A3?6通过抑制PC/PA/NF-κB通路发挥抗炎作用。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]图片[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]图9 PC在体内介导A3?6的抗结肠炎作用[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]总结[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]该研究通过结构修饰制备衍生物来增强AB4的抗炎活性和口服适用性,通过去除某些糖单元,所得AB4衍生物表现出降低的分子量和改善的水溶性。这种修饰有助于更容易地渗透细胞膜和线粒体内膜,增强其与位于线粒体基质中的PC(靶蛋白)的结合。此外,AB4衍生物的理化性质得到改善,可实现更好的吸收和更长的消除半衰期,可能导致治疗IBD所需的口服剂量减少。在这些衍生物中,A3?6被发现具有最高的抗炎功效。此外,在体外和体内研究了A3?6的抗炎机制和下调信号通路,发现A3?6是一种新型PC抑制剂,特异性地与PC结合,抑制PC活性,从而通过PC/NF-κB/NLRP3炎症小体轴减轻结肠炎。这些结果表明A3?6 是一种有前途的抗炎剂,能够通过靶向PC来减轻DSS诱导的结肠炎症。同时,PC已被确定为直接抗炎靶点,并可能作为治疗结肠炎的理想靶点。[/size]