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今天我们聊一款小众的色谱柱-氨基色谱柱,如果大家在实际使用过程中有遇到,可以参考。在高效液相色谱(HPLC)中,氨基色谱柱(NH2柱)是一种常用于正相和亲水性相互作用液相色谱(HILIC)的色谱柱。它通常用于分离糖类、脂溶性维生素、核苷酸和水溶性维生素等物质。 01.氨基色谱柱的组成 1)色谱柱管:色谱柱管通常是由不锈钢制成管状结构,用于容纳填料。 2)填料:通常由硅胶或聚合物基质组成。在氨基色谱柱中,填料是在硅胶或聚合物基质上键合了氨基(-NH2)官能团的球形颗粒。这些颗粒具有均匀的孔径分布,允许不同大小的分子进入孔隙内部。氨基官能团提供了亲水性相互作用和弱阴离子交换的特性,适合于分离极性化合物。 02.氨基色谱柱的分离机制 1)HILIC模式:在这种模式下,氨基色谱柱用作亲水性相互作用色谱柱,适用于糖类、糖醇等化合物的分析。流动相通常是水和有机溶剂(如乙腈)的混合物,通过调整流动相中水和有机溶剂的比例,可以控制分析物的保留行为。在HILIC模式下,氨基色谱柱的氨基提供了与极性化合物相互作用的位点,通过氢键和偶极-偶极相互作用实现保留 。 2)弱阴离子交换模式:在酸性流动相条件下,填料表面带正电荷,适用于水溶性维生素或核苷酸类的分析。这种模式下,氨基色谱柱的氨基官能团可以作为弱阴离子交换位点,通过离子交换作用保留带负电荷的分析物 。 3)正相模式:氨基色谱柱也可以在正相色谱中使用,分析酸性物质、烃类化合物、维生素A和D等。在正相色谱中,通常使用非极性流动相,氨基柱的氨基官能团可以与分析物形成氢键或其他极性相互作用 。(较少) 03.氨基色谱柱使用的注意事项 1)使用前: a. 检查色谱柱包装和标签:确保色谱柱没有物理损伤,确认色谱柱的规格和填料类型符合实验需求。 b. 阅读说明书:[font=&]仔细阅读色谱柱的使用说明书,了解色谱柱的pH稳定性范围、最大操作压力等参数。 c. 系统冲洗:使用适当的溶剂冲洗色谱系统,确保系统中没有气泡和污染物。 d. 色谱柱平衡:柱子需要用流动相平衡,直到基线稳定。HILIC模式下,通常需要平衡4~5小时。(有些甚至过夜平衡)注:如果上一个试验是无机盐的流动相试验,需要对仪器进行充分的冲洗,怕产生盐析;同理,如果是做了氨基柱的试验换成无机盐试验,也是要充分冲洗。 2)使用中: a. 流动相组成:确保流动相组成适合分析物和色谱柱,严格控制pH值在色谱柱的允许范围内(通常是pH 2-8)。注:如果是是无机盐与有机相的混合流动相,要注意加入的先后顺序,可能会有结晶析出 b. 样品溶解性:样品应在流动相中完全溶解,避免在柱上沉淀。 c. 流速控制:设置合适的流速,以获得最佳分离效果。 d. 样品负载:避免超载,以保持色谱峰形和分辨率。 e. 温度控制:根据需要调整柱温,以优化分离效果。 3)使用后: a. 柱子清洗:分析完成后,使用适当的溶剂冲洗色谱柱,以去除可能的污染物。 注:如果是含有无机盐-有机相的流动相 这个冲洗要先含有较多水的有机相进行冲洗(如95%水-乙腈),除盐→然后再转到高有机相冲洗(如95%乙腈水),除杂→再过渡置换成保存溶液 一般不要使用100%水冲洗色谱柱,氨基会水解。 b. 柱子保存:短期内如果不用,可以用与流动相相同组成的溶剂保存。长期不用,建议用色谱柱出厂时的保存液(如100%异丙醇)保存。 c.记录使用情况:记录色谱柱的使用情况,包括分析的样品、使用条件和色谱柱表现,以便于追踪柱效和寿命。 04.氨基色谱柱使用的局限性 1)pH值限制:氨基色谱柱的氨基官能团对pH值较为敏感,通常推荐的pH值使用范围是2-8。超出这个范围可能会加速氨基官能团的水解,从而缩短色谱柱的使用寿命。 2)溶剂兼容性:在反相条件下使用时,需要注意流动相中水的比例和pH值,因为高比例的水和极端的pH值可能导致官能团水解。 3)样品极性:氨基色谱柱对极性化合物的分离效果较好,但对非极性化合物的分离能力相对较弱。 4)样品负载:样品浓度和负载量不宜过高,以避免超载现象,导致色谱峰形变宽和分辨率下降。 5)温度敏感性:虽然适当的温度升高可以提高某些极性化合物的溶解度和分离效率,但过高的温度可能会加速色谱柱的老化。 6)缓冲盐类:如果流动相中含有缓冲盐,需要特别注意在分析前后使用不含盐的流动相进行适当的过渡,以避免盐类在柱内的析出。 7)保存溶剂:新购买的氨基柱的保存溶剂可能与使用的流动相不互溶(可能出厂保存在正相溶剂中,一般要用异丙醇置换),需要使用适当的溶剂进行过渡。 https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/10/202410081129146844_2050_3203140_3.png!w490x14.jpg 总结一下:氨基色谱柱(NH2柱)在高效液相色谱(HPLC)中的角色有点像个分类专家,它通过分子的极性来区分它们。这种色谱柱是由不锈钢管和特殊填料构成的,填料上的氨基官能团能够与极性分子亲和,帮助我们把不同的分子分开。使用时,得注意几点:首先,pH值要控制在2到8之间,这样氨基官能团才能稳定工作。其次,样品要在流动相中溶解得好,免得在柱子里堵路。流速和温度也要适当调整,以保证分离效果。用完以后,别忘了用合适的溶剂冲洗,短期保存可以用流动相,长期的话最好用出厂时的保存液。氨基色谱柱虽然对极性分子分离有一手,但对非极性分子就不太灵了,而且它的分辨率和灵敏度可能不如其他类型的色谱柱。所以,如果你的样品极性很强,氨基色谱柱是个好选择,但要是分子大小差不多,或者你需要高分辨率和灵敏度,那就可能得考虑其他色谱柱了。总的来说,氨基色谱柱是个实用的工具,特别适合分析那些对环境条件敏感的极性分子。
最近老师要求让我买根氰基色谱柱,不知道是否适合分离生物样品?
求助五羟基色氨酸的紫外光谱图,急用。多谢各位大虾的帮助,先谢了!