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引物设计实例分析[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=39451]引物设计实例分析[/url]
设计引物是PCR片段扩增的第一步,而引物设计的好与坏直接决定了实验能否顺利开展,因此,设计引物这一步十分重要。目前,设计引物的方法多种多样,主要可以分为两类,一类是软件设计,最常用的的是PRIMER系列,现在已经有到版本Primer6,这一类只需将软件下载到电脑上并安装好即可离线使用。一般正版的需要付费,但是网上提供多种破译版下载。在安装好的软件上输入目的片段核酸序列,设置好扩增片段要求,引物要求,即可直接生成多对引物。另一类是在线设计,设计引物的网站有许多,一般用的较多的有NCBI,Primer 3,Primer Life,DoPrimer等等,用起来也很方便,操作基本和软件设计一致。下面简单介绍下NCBI设计步骤:1 打开NCBI主界面,选择右边的BLASThttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/08/201508042051_559125_3028166_3.png2 拖到页面下方,选择Primer-BLASThttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/08/201508042051_559126_3028166_3.png3 输入自己序列,进行引物要求设置,点击Get Primer即可获得引物http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/08/201508042051_559127_3028166_3.pnghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/08/201508042051_559128_3028166_3.pnghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/08/201508042051_559124_3028166_3.png 这么多种设计引物的方法,看起来设计引物是一件十分简单的事情,然而这个情况只占大部分。这是什么意思呢?首先,每一个引物设计途径能给出多对引物,并且不同途径给出的引物也不尽相同,那么该选择哪一条引物是适用的呢?其次,片段长度不同,片段结构差异对引物有不同的需求,因此,通常情况下我们通过软件可以获得有效引物,但是仍旧存在引物不可用的情况。 面对这些情况要怎么解决呢?(1)规范操作。在设计引物参数设置时尽可能地规范,按照引物设计原则和自身要求,筛选出最好的引物。(2)汲取经验。询问师兄师姐们,他们常用的引物设计软件是什么,不同实验室不同物种适用的软件会有差别,不能一概听信网上的推荐。(3)多多实践。自己用不同途径设计引物,进行对照,选择最适合自身实验的方法。 引物设计好后,PCR扩增程序设定是影响引物效果的因素之一,比如退火温度过低,可能扩增出多条带或者无带等。实验过程中每一步都很重要,所以做实验的需要有耐心和细心,实验才能顺利进行下去。