卡宾化学印记法结合质谱技术揭示抗体药物结合表位
大家好,本周为大家分享一篇最近发表在Analytical Chemistry上的文章,Residue-Level Characterization of Antibody Binding Epitopes Using Carbene Chemical Footprinting 1。该文章的通讯作者是美国百时美施贵宝的Jason M. Hogan研究员。抗体药物结合表位的测定是药物开发的重要环节。抗体的结合位点决定了它的药理学和药代动力学特性。本文采用化学印迹法结合质谱技术对MICA蛋白上的抗体结合表位进行了测定,单残基水平的分辨率能够展现更精细的结构信息。作者选择了两种包含有双吖丙啶基团的光催化标记试剂TDBA和3-azibutanol(如图1AB中的化学结构式)。在紫外光照射下,双吖丙啶基团会形成较高反应活性的卡宾中间体插入到氨基酸的X-H键中(X=C, O, N, S)中,进而实现较高水平的标记序列覆盖和结构分辨率。值得注意的是,TDBA和3-azibutanol在分子尺寸、极性以及对不同氨基酸的反应活性上都存在差异,因此两种试剂获得标记结果往往能展现一些互补的结构信息。作者首先对MICA与Fab-1的互作表位进行了测定。由于同一条肽段存在多个标记位点,每个位点的标记比例变化也不一样,所以肽段水平的标记往往反映是该肽段连带区域结构平均化的结果。图1AB为MICA与Fab-1结合后标记比例的变化。在MICA α3结构域中,共有34个残基被TDBA试剂修饰(图1A)。在这些残基中,发现18个位点的标记量在与Fab-1形成复合物后显著性地下降,3个位点的标记量显示出增加。如果按照肽段标记水平的变化来看,其中5个位点的结构变化信息则会被掩盖。相较于肽段标记量变化,计算单个残基的标记量变化能将抗体结合表位锁定到更精确的位置。将标记量下降的残基映射到MICA蛋白晶体结构上(图1C),可以观测到大多数受保护的残基在α3结构域上形成了一个连续的表面。其中一个残基Q278显示出标记量增加,并且靠近TDBA定位的表位,表明它可能位于表位边缘或附近。其余差异标记残基位于远离表位的区域,可能是Fab-1结合时蛋白质结构构象变化导致的结果。在3-azibutanol的实验中,复合物形成后仅显示5个标记量显著性下降的残基和2个增加的残基(图1B)。四个标记量下降的残基R279、Y283、E285和H290在TDBA标记实验也观察到。两种标记试剂的测定结果可以相互验证,同时互相补充。3-azibutanol定位的表位覆盖了TDBA表位中的两个不连续区域(图1D)。整合两种标记试剂定位的表位区(图1E),对比X-射线晶体学测定的表位(图1F)发现大多数通过卡宾化学标记鉴定的表位残基被晶体结构证实,其余残基则位于晶体学表位外围的8Å范围内。以上结果均说明卡宾化学印记法在测定抗体结合表位上具有较高的准确性。图1 MICA与Fab-1的互作表位测定:A)TDBA, B) 3-azibutanol实验标记量的变化;使用C) TDBA, D) 3-azibutanol 定位的表位;E)整合标记试剂测定的表位;F) X-射线晶体学测定的表位。鉴于此,作者将卡宾化学印记法应用到了其他候选Fab与MICA结合表位的测定上。在实验开始之前,作者首先用生物膜层干涉(BLI)技术对几个Fab在MICA上的竞争结合关系进行了考察。如图2A所示,Fab3、Fab4、Fab5存在着竞争结合,表明它们结合的表位一致或表位之间存在重叠。而Fab1、Fab2与MICA结合相对独立,不受其他Fab的干扰,说明Fab1和Fab2都具有各自单独的结合表位。尽管生物膜干涉能够展现各个Fab结合表位的位置关系,但却无法实现更高分辨的定位。表面标记法则能很好地解决此问题。如图2B-G,通过卡宾化学印迹法的测定6个Fab的结合表位都实现了准确定位,位置接近或重叠的表位则会产生竞争结合,因此更精准地解释了Fab间的竞争关系。此外,作者还将卡宾化学印记法应用到了完整抗体Ipilimumab与CTLA-4结合表位的测定(图3),卡宾化学印迹法依旧展现出较高的分辨率,准确描绘出了Ipilimumab与CTLA-4结合表位轮廓。图2 A)通过生物膜层干涉测定6个Fab的竞争结合关系;B-G)卡宾化学印记法测定6个Fab的表位图3 卡宾化学印记法测定全长抗体Ipilimumab与CTLA-4互作表位总之,使用卡宾化学印迹可以快速定位抗体结合表位,以支持抗体药物的开发。两种标记试剂的使用增加了蛋白复合物表面标记残基的覆盖率,可提供互补结构信息。残基水平的标记细化了相互作用表面并且能够区分与结合表位不相关的远端调控。撰稿:刘蕊洁编辑:李惠琳原文:Residue-Level Characterization of Antibody Binding Epitopes Using Carbene Chemical Footprinting参考文献1. Hogan JM, Lee PS, Wong SC, et al. Residue-Level Characterization of Antibody Binding Epitopes Using Carbene Chemical Footprinting. Anal Chem. 2023 95(8):3922-3931.