苄氨基

生物技术君综合安莎通讯社和俄罗斯通讯社报道，当地时间11月27日，来自意大利罗马耶稣儿童医院的多模式医学实验室公布了全球首张关于新冠病毒变异毒株Omicron(奥密克戎)的图片。　　(图注：上图为德尔塔(左)与奥密克戎(右)毒株的刺突蛋白(S蛋白)对比图，其中变化最大的区域用红色标记。在德尔塔变异毒株中，突变的氨基酸残基数量为18个，而在新毒株奥密克戎中则有43个。这些变异多样化，且大部分位于与人体细胞相互作用的区域。)　　研究人员表示，这并不一定意味着奥密克戎更危险，而是意味着病毒为了更加适应人类物种，产生了另一种突变。进一步的研究将告诉我们这种适应是中性的不那么危险的，还是更危险的。　　截至北京时间上午十点，比利时、英国、德国、意大利和捷克共和国均已确认感染奥密克戎的病例。此外，荷兰从南非飞抵的两趟航班中的85人核酸检测呈阳性，荷兰卫生部称有95%的把握确认其中61人感染了奥密克戎。　　而以色列在前一天发现2例疑似奥密克戎感染者后，刚刚已宣布关闭边境，禁止所有外国旅客入境，成为全球首个因奥密克戎毒株而封锁国境的国家。　　中国香港也已在前一天确认感染奥密克戎病例。　　根据英国卫生安全局的说法，这种新变异毒株的S蛋白与新冠疫苗所基于的原始新冠病毒毒株的完全不同。欧洲疾病预防和控制中心表示，鉴于奥密克戎的免疫逃逸潜力和与德尔塔相比可能增加的传播优势，它在欧洲传播的风险目前是 "高到非常高"。　　世界卫生组织在周五的声明中表示，初步证据表明，与其他令人担忧的变异毒株相比，奥密克戎还具有更高的再感染风险。　　虽然科学家们表示有理由担心这种新变异毒株，但他们强调仍有很多未知的问题，包括该变异株是否确实更具传染性，它是否会导致更严重的疾病，或者它对疫苗效力的影响会如何等。正如世卫组织流行病学家Abdul El-Sayed所指出的：“我认为我们应该慢些下结论，等待有关这方面的科学数据。”　　美国布朗大学公共卫生学院院长Ashish Jha博士说，他认为奥密克戎不会造成“疫苗将变得毫无用处”的情况。他说：“我认为这是极不可能的。疫苗功效是否受到轻微打击，还是受到很大打击?我想我们可能会在接下来的几天内获得一些初步数据。”

步琦SFC系统纯化利多卡因与乙酰氨基酚SFC应用”1简介药物是一种由化学或生物来源制成的产品，用于人类或动物的医疗治疗，这些药物往往以化学合成的形式来生产。化学合成是一种通常伴随着杂质存在的过程，因为产率很少是 100%。这些杂质可能会对最终产品的疗效、安全性和质量产生重大影响。因此，对药物进行纯化以确保合成化合物的纯度和完整性是至关重要的，药物的纯化可以通过色谱法等多种方法进行。最近，超临界流体色谱（SFC）已经作为一种替代反相液相色谱（RP-HPLC）的方法出现。SFC 使用超临界二氧化碳作为流动相的一部分，这是一种清洁且环保的溶剂，很容易从最终产品中去除。此外，SFC 结合了气相色谱和液相色谱的优点，在提供高分辨率的同时也能以更快的速度分离样品。在 SFC 的方法开发过程中，最大的难点在于没有一种通用的固定相。因此需要在不同的固定相上进行筛选，以确定要分离的样品的最佳选择性。CO2 的低极性溶剂特性允许在色谱柱筛选时同时考虑非极性和强极性的固定相。在确定最佳固定相后，就可以进一步放大到制备规格。在本次应用中，我们会例举利多卡因和乙酰氨基酚的合成案例，利用 SFC 系统来高效去除合成过程中的杂质，获取高纯度目标化合物。在这一过程中，需要先进行合适色谱柱的筛选，再放大至制备色谱的规格。2设备BUCHI Sepmatix 8x SFC 8通道平行色谱系统BUCHI Sepiatec SFC-50 超临界制备色谱系统BUCHI PrepPure 硅胶，5um,250×4.6mm BUCHI PrepPure 二醇基，5um,250×4.6mm BUCHI PrepPure 氨基，5um,250×4.6mm BUCHI PrepPure 2-EP，5um,250×4.6mm HILIC柱，5um,250×4.6mm (Dr. Maisch GmbH)BUCHI PrepPure PEI，5um,250×4.6mm BUCHI PrepPure CBD，5um,250×4.6mm 氰基柱，5um,250×10mm ，(Dr. Maisch GmbH)BUCHI PrepPure PEI，5um,250×10mm BUCHI PrepPure 氨基，5um,250×10mm3化学品与样品化学品：二氧化碳 (99.9%)甲醇 (≥99%)甲醇溶液中2M的氨溶液甲酸（99%）去离子水为了安全处理，请注意所有相应的MSDS！样品：乙酰氨基酚合成产物利多卡因合成产物4程序设定BUCHI Sepmatix 8x SFC平行色谱系统流动相：A= 二氧化碳；B= 甲醇柱尺寸：250×4.6mm流速：3mL/min（每根色谱柱）检测：DAD 紫外扫描 200 nm - 600 nm流动相条件：0&minus 0.5min5%B0.5 – 8.0 min5 – 50 % B8.0 – 9.4 min50 % B9.4 – 9.5 min50 – 5 % B9.5 – 10 min5 % B筛选过程完全自动运行，流速设置为 3mL/min 每通道，使用流控单元，平衡每一根色谱柱。样品自动注入（V = 5 μL），并开始平行筛选（运行时间 =10min）。背压调节器设置为 150 bar，柱子加热至 32℃，可按需往改性剂中加入添加剂改善峰型。BUCHI Sepiatec SFC-50超临界制备色谱系统流动相：A= 二氧化碳；B= 甲醇柱尺寸：250×10mm流动相条件：等度运行条件检测：紫外所有 10mm ID 色谱柱都在预设流速下平衡 3 分钟，使用自动进样器上样，并开始运行。背压调节器设置为 150 bar，柱子加热至 40℃，可按需往改性剂中加入添加剂改善峰型。5结果5.1 乙酰氨基酚乙酰氨基酚（下称 AA），也常被称为对乙酰氨基酚，是一种镇痛剂、解热剂和手性药物。它属于非阿片类镇痛剂这一类。在化学上，它可以通过对氨基苯酚（下称 AP）与乙酸酐的反应来合成，在此过程中发生 N-乙酰化（见图1）。为了确定乙酰氨基酚合成产物的最佳纯化分离固定相，首先进行了柱筛选（见图1）。▲ 图 1：顶部：乙酰氨基酚合成的反应方程式，底部：Sepmatix 8x SFC 仪器色谱柱筛选结果；从左到右：硅胶，氨基，二醇基，氰基，2-EP，HILIC，PEI和CBD；运行时间 = 10分钟。图1显示，二醇基和 2-EP 相并未表现出分离度，硅胶相、CBD 相、氰基相和氨基相未显示出理想的分离度，因为它们无法实现基线分离。HILIC 和 PEI 相具有良好的选择性和分辨率，且分辨率始终远高于 1.5（见表1）。1.5 的分辨率意味着可以很好地分离 2 个峰。表1 还显示了洗脱顺序，氰基相显示出相反的洗脱趋势，对氨基苯酚先洗脱，然后是对乙酰氨基酚。筛选结果表明，反应并非百分之百完全，因为产物中仍含有大量对氨基苯酚。▲ 表1：样品在不同固定相色谱柱条件下的分辨率值和洗脱顺序选择 PEI 相色谱柱放大至制备规格，因为它具有最高的分辨率（见图2）。根据筛选时的色谱图，我们可以确定 AA 和 AP 在甲醇为 35&minus 40% 之间洗脱。图2（顶部）显示了在 40% 甲醇等度条件下，在10 x 250mm 的PEI 色谱柱上对 AA 进行纯化的情况，结果显示 AA 和 AP 可以非常良好地分离。因此在相同的条件下，可以实施一个堆叠注射方法，用于自动纯化并收集 AA （见图2，底部）。▲ 图2：单次注射（顶部）和堆叠注射（底部）用于AA的纯化；运行条件：流速=30 mL/min， 甲醇= 40 %，温度 = 40 ℃，压力BPR = 150 bar，注射 = 250 µ L，UV波长 = 254 nm；堆叠注射条件：注射次数 = 10，堆叠时间 = 1.8 min，Fractions = 1（基于时间的）。5.2 利多卡因利多卡因（下称 L），化学名为 2-二乙基氨基 -N-(2,6-二甲基苯)乙酰胺，是一种用作局部麻醉剂和抗心律失常药物的药物，它作为钠通道阻断剂起作用。利多卡因可以通过两步合成过程生产（见图3）。第一步中，2,6-二甲基苯胺（下称 X）的氨基组团被酰化 。第二步中，中间产物（下称 IP）通过与二甲胺的亲核取代反应转化为利多卡因。因此，需要进行两步纯化过程。色谱柱筛选的结果如图3所示，筛选过程中，在改性剂甲醇中始终添加 20 毫摩尔氨水作为碱性添加剂。▲ 图 3：顶部：利多卡因合成的反应方程式，底部：Sepmatix 8x SFC 仪器色谱柱筛选IP与利多卡因结果；从左到右：硅胶，氨基，二醇基，氰基，2-EP，HILIC，PEI 和 CBD；运行时间 = 10分钟。从结果来看，所有色谱柱都可用于中间体 IP 的第一步纯化分离，因为都具有基线分离的效果。其中氨基相具有最高的分辨率，且在甲醇比例较低时就能出峰（见图3）。对于第二步利多卡因的纯化，氰基和CBD相无法实现基线分离，而氨基再次表现出最佳的分离度（见表2）。在洗脱顺序上，第一步中间体的纯化出峰顺序都是先 X 再 IP，而第二步的利多卡因的纯化除了硅胶相之外都是先 L 再 IP（见表2）。▲ 表2：样品在不同固定相色谱柱条件下的分辨率值和洗脱顺序最终选择 10 x 250mm 的氨基色谱柱进行制备纯化，因为它的分辨率总是最高的（见表2）。氨基柱筛选结果显示，X 和 IP 出峰时的甲醇比例约为 10 - 19%，L 和 IP 出峰时的甲醇比例约为 11 - 19%。图 4 a) 显示的是甲醇比例为 16% 等度条件下的 IP 的单次纯化分离图谱，图 4 b) 显示的是甲醇比例为 20% 等度条件下的 L 的单次纯化分离图谱。在相同的条件下，可以进行叠层进样分离，分别自动纯化 IP 和 L，并进行馏分收集（见图 4 c) 和 d)）。▲ 图4：中间体 IP 的单次进样（a）和叠加进样（c）；运行条件：流速 = 20 mL/min，改性剂 = 甲醇 + 20 mM 氨水，改性剂 % = 16 %，温度 = 40 °C，压力 BPR = 150 bar，进样量 = 170 μL，紫外波长 = 254 nm；叠加进样条件：进样次数 = 15，叠加时间 = 0. 75 min, Fractions = 1 (基于时间) 利多卡因L的单次进样 (b) 和叠加进样 (d) 运行条件：流速 =20 mL/min, 改性剂 = 甲醇 + 20mM 氨水, 改性剂 % = 20 %, 温度 = 40 °C 和压力 BPR = 150 bar, 进样 = 170 μL, 紫外波长 = 254 nm 叠加进样条件：进样次数 = 20, 叠加时间 = 0.65 min, Fractions = 1 (基于时间)。6结论在进行有机合成后，由于副反应或转化率未达到 100%，通常仍会存在杂质，这些杂质必须去除，尤其是在药品生产中。在药物合成研发领域，时间与效率至关重要。BUCHI 的 SFC 色谱解决方案为研发人员提供了强大的工具，通过 Sepmatix 8x SFC 色谱柱筛选系统与 Sepiatec SFC-50 制备色谱系统相结合，可快速筛选出合适的色谱柱并线性放大至制备规格。SFC-50 的叠层进样功能，不仅能实现无人值守自动分离，还可显著提高分离效率，从而加快药物合成研发的速度。7参考文献Medikamente & Medizinprodukte (admin.ch) (Status 23.11.2023).https://doi.org/10.1016/j.chroma.2011.09.029https://doi.org/10.1016/j.chroma.2012.06.029https://doi.org/10.1016/j.chroma.2005.03.073https://doi.org/10.1016/j.jpba.2007.08.013.PRACTICAL APPLICATION OF SUPERCRITICAL FLUID CHROMATOGRAPHY FOR PHARMACEUTICAL RESEARCH AND DEVELOPMENT, Vol. 14, M. Hicks and P. Ferguson, 2022 Elsevier Inc.Th. Eicher und H. J. Roth Synthese, Gewinnung und Charakterisierung von Arzneistoffen, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (1986).The synthesis of Lidocaine (University of San Diego).Winterfeld, K. – Praktikum der organisch-prä parativen Pharmazeutischen Chemie, 6. Auflage, Steinkopff Verl., Darmstadt (1965).Axel Kleemann, Jürgen Engel, Bernd Kutscher und Dietmar Reichert: Pharmaceutical Substances, 4. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (2000).

蛋白质是构成生物体的主要成分，同时也是生命活动的主要承担者。具有生物学功能的蛋白质往往具有特定的空间结构，而蛋白质结构在多个层级上被定义，其中一级结构，即氨基酸的种类和排列，最为重要，它可以决定蛋白质的高级结构。但一直以来，想要直接读取蛋白质的一级结构是十分困难的，在大多数情况下，科学家们会根据基因序列和氨基酸密码子表来“破译”蛋白质的氨基酸序列。然而，由于转录后修饰和翻译后修饰的存在，破译结果并非完全正确，甚至与真实的氨基酸序列有很大差异。2021年11月4日，荷兰代尔夫特理工大学的研究人员在 Science 期刊上发表了题为：Multiple rereads of single proteins at single–amino acid resolution using nanopores（利用纳米孔在单氨基酸分辨率下对单蛋白质进行多次重读）的研究论文。该研究利用纳米孔测序技术成功扫描并读取单个蛋白质的氨基酸序列：线性化的DNA-肽复合物缓慢通过一个微小的纳米孔，根据电流的变化和强度，研究人员就能读取相关的蛋白质信息内容，直接对蛋白质的氨基酸序列进行测序。蛋白质是生命活动的主要承担者。事实上，所有生物的蛋白质都是由大约20种不同的氨基酸组成的长肽链，就像项链上有不同种类的珠子一样。遗憾的是，目前的蛋白质测序方法价格昂贵，而且不能检测许多稀有蛋白质。近年来发展起来的纳米孔测序技术，已经能够直接扫描和排序单个DNA分子。如今，这篇发表在Science 上的研究表明，我们完全可以以类似于DNA纳米孔测序的方式直接读取蛋白质的氨基酸序列。本研究的通讯作者 Cees Dekker 教授表示：在过去的30年里，基于纳米孔的DNA测序已经从一个想法发展成为一个实际的工作设备，并成功开发了商业化的便携式纳米孔测序仪，服务于价值数十亿美元的基因组测序市场。在我们的论文中，我们将纳米孔的概念扩展到单个蛋白质的读取。这可能会对基础蛋白质研究和医学诊断产生重大影响。牛津纳米孔开发的纳米孔基因测序仪直接读取氨基酸序列对于如何利用纳米孔读取肽链中的单个氨基酸的特征，这篇论文的第一作者 Henry Brinkerhoff 博士打了一个形象的比喻：“想象一下，一个肽链中的氨基酸链就像一条项链，上面有不同大小的珠子。然后，你打开水龙头，慢慢地把项链送入下水道，也就是纳米孔。如果在某个时间点是一颗大珠子，它会堵塞下水道，那里面的水也就成了涓涓细流。相反，如果是一颗小珠子，那么下水道剩余的空隙就会比较大，水流也更大。”用纳米孔肽阅读器直接读取氨基酸序列因此，通过这项技术，研究人员可以非常精确地测量纳米孔的电流大小，并以此推测相应的氨基酸种类。更关键的是，这个过程并不会影响肽链的完整性，因此我们能够一次又一次地读取单个肽链，然后对所有数据进行拟合，从而以基本上100%的准确率获得肽链的序列组成。解旋酶（红色）拖动连接了多肽（紫色）的 DNA 分子（黄色），使其缓慢通过纳米孔（绿色），从而通过读取电信号（橙色高亮）表征多肽的氨基酸序列。条形码般的识别精度为了进一步验证这项技术的准确性，研究人员改变了肽链的某个氨基酸，然后能够检测到显著差异的电信号，表明该技术是极其灵敏的。事实上，这项新技术在识别单个蛋白质和绘制它们之间的细微变化方面非常强大，打个形象的比方——就像超市的收银员通过扫描条形码来识别每个产品一样。这也可能为未来的蛋白质从头测序提供新的途径。纳米孔肽阅读器可以区分单氨基酸替代的单肽Henry Brinkerhoff 博士表示：这项方法可能为未来蛋白质测序奠定基础，但就目前来说，蛋白的从头测序仍然是一个巨大的挑战。我们仍然需要大量描述来自不同序列的电信号，以便创建一个对应电信号和蛋白质序列的“密码表”。但即便如此，该研究已经能够成功分辨蛋白质序列中的单个氨基酸的改变，这无疑是一项重大进步，也将产生许多直接应用。看见生物学的“暗物质”https://www.science.org/doi/10.1126/science.abl4381