推荐厂家
暂无
暂无
关于动物免疫,在多抗制备一部分里有一些讲解(点击这里查看),这里只简要讲述一下单抗制备中需要注意的几个问题。在概述部份已经讨论过,用来制备单抗的动物主要有小鼠、大鼠和兔,由于小鼠易饲养、小鼠单抗技术成熟、路线简单,因此是制备单抗使用的主流动物,这里主要以小鼠单抗制备展开讲述。免疫途径和周期:单抗制备中,免疫动物的方式一般第一针采用皮下免疫,后面的加强免疫采用腹腔免疫、腘内免疫、皮下免疫或者脾内直接免疫。首次免疫和加强免疫结束后,在融合前三天一般还要进行一次冲击免疫,以增加脾脏内浆细胞的数量。下面这张表列出了常见的免疫途径和周期:http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/11/A1384840870png_small.jpg 说明:FCA,弗氏完全佐剂;FIA,弗氏不完全佐剂;Quickantibody,北京康碧泉公司研制的佐剂。上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM,存在亲和力弱等缺点,慎用。关于操作的问题,这里只作一下简单的介绍,具体如何进行,需要在有相关经验的实验员指导下进行,也可以在网上找到相关视频进行学习。(1)皮下注射。皮下注射的操作有点像给人接种疫苗,即挑取动物的皮肤,将混好佐剂的抗原直接注射。一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原,每只小鼠注射6-8个点为宜。(有的资料上称这种方法为皮内免疫,造成这种概念上的混淆可能是由于早期工作者们的翻译过程出了问题),皮下操作一般由两人进行,一个协助固定小鼠,另一个进行免疫操作。(2)腹腔注射。腹腔注射比较简单,只需要一人操作,操作者由左手抓住小鼠尾巴和颈部皮肤,将小鼠翻转过来,腹部向上,将抗原直接注射到腹腔。如果抗原混有弗氏佐剂,建议注射在左侧腹腔,如果采用右侧腹腔注射,则在免疫过程中,很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况,造成后期取出脾脏麻烦。(3)尾静脉注射。个人觉得尾静脉注射是技术要求最高的一种注射方式,操作者需要固定小鼠,然后将抗原注射到小鼠尾部静脉(正中间那根血管)。小鼠尾静脉比较细小,一般新手很难操作成功,需要在其它小鼠身上多次尝试才可以进行免疫操作(站长自己尝试了十多次都未成功)。静脉注射抗原对抗原的要求更高,抗原必须不含去垢剂和其它有毒成份,否则极容易引起动物死亡,而且免疫剂量也不宜过大。(4)脾内注射。脾内注射是效果最好的免疫方式,因为这种方式使得脾细胞直接与抗原接触,所以很容易引起免疫应答反应。但是很多人都认为这种方式操作复杂,而且死亡率高,但是参考了一些文献,加上自已实践操作,站长自己总结出了一套比较好的办法,成功率基本上在百分之百。具体操作方法:先用乙醚或戊巴比妥钠进行麻醉,乙醚麻醉过程比较简单,技术含量低,对于初学者比较适用,推荐。事先准备一块棉花,将少量乙醚倒在棉花上,用一烧杯倒扣住,将小鼠也扣在烧杯下,一般在一分钟内小鼠就可以晕到,此时将小鼠取出,用胶带固定在木板或实验台上(腹部向下,背面向上。无需无菌),用手术剪刀剪开背部左侧皮肤(大至就是脾脏所在的位置,不要剪开内膜),剪开小口后,用手将剪口撕大看到腹膜内脾脏即可将用注射器刺穿腹膜,插入脾脏,直接注射抗原,抽出注射器。然后用胶水(推荐AB胶,五金店有卖的)将剪口周围的毛粘好,胶干后在伤口周围涂上抗生素即可,无需要无菌操作。由于需要用到胶水,所以手术前不要用酒精消毒。(5)小腿肌肉注射。这是康碧泉公司的Quickantibody佐剂独有的免疫方法,具体操作是:先抓紧小鼠,用无名指固定一只后腿,将小腿部分用酒精消毒,将混好佐剂的抗原(根据佐剂说明书抗原与佐剂等体积混合)直接注入到小腿肌肉,稍稍停顿后拔出注射器即可。完成首次免疫和加强免疫后,可以取出少量血清进行效价检测(参见多抗制备中的血清采集与检测),达到足够高的效价后即可进行冲击免疫,冲击免疫完成后,应在96小时内完成细胞融合,否则相应的B细胞数量会下降到未冲击前的水平。在单抗制备过程中,除了通过免疫动物得到可分泌抗体的B细胞外,还可以将未免疫的小鼠脾脏取出,在体外进行免疫,从而大大加快制备周期,其基本方法是:取出未免疫小鼠的脾脏,处理成为单个细胞,然后在完全培养基中培养,同时加入一定浓度的抗原刺激其产生抗体。需要注意的是,这种方法由于不存在完整的免疫应答路径,所以只能产生出亲和力不成熟的IgM型的抗体,大部分实验中基本不能使用这种抗体(除非是专门研究IgM抗体特性)。
公司建厂时采购了几台上海宝尔纯水设备公司生产的超纯水机,现在想更换里面的滤芯(还是叫渗透膜?),但又不知道滤芯的材质、型号、接口大小等具体参数,设备型号是BRAIT-DOC-Purico-14,知道一个电话是021-64040161,同事打说是家庭座机,担心联系到骗子,大家谁知道哪里有做这个代理或者上海宝尔公司电话的请提供帮助!谢谢!大家如果有更好的解决滤芯的办法请留下您宝贵的墨痕!非常感谢!
从人类发明这个技术开始,单抗制备已经有37年的历史了,这37年以来,主流单抗制备的基本主线几乎没有什么改变,也就是下面这个流程: 抗原制备 动物免疫 细胞融合 克隆筛选 克隆化(亚克隆) Large-scale生产、纯化以及鉴定 但是不同的研究人员从不同的角度和细节对整个流程有了独到的视角,这里我简单地总结一下近十年以来的发展和前人的经验,基本都是站长自己道听途说,加上参阅一些文献总结出来的, 十年以前的技术革新择重点简要提一提。 抗原制备进展 抗原,基本上分三类: 蛋白、多肽和小分子化合物。 一般的制备过程没什么好说的了, 主要说多肽和小分子连载体的事。 多肽和小分子因为免疫原性弱,所以必须连接载体才能诱发免疫应答。 最常用的基本上就是KLH, BSA,OVA和GST, 但是觉得近几年以来,用多肽复合抗原肽(MAP)的比较多。其原理是把多肽或小分子连在多聚赖氨酸的骨架上,而多聚赖氨酸因为其结构具有高度重复性,所以不会像KLH等载体一样使动物产生抗体,这样就不会浪废有限的免疫系统资源。 毛病是这种形式的抗原在制备成本上贵许多,我记得一个MAP的制备报价大约在1500元人民币左右。 从获取方式来看,对于蛋白质类抗原,不仅可以重组表达(原核和真核), 还可以直接从天然组织或细胞中分离。早期的时候人们经常干这种事,那是因为当时没有现在这么普及的分子生物学技术,很难得到重组蛋白。 但是最近20年以来,基本上都用重组蛋白了,重组蛋白生产技术非常成熟,而且生产也简单,容易扩大规模,但是慢慢地很多人意识到重组蛋白和天然的蛋白在结构上有时候有着极大的差异,所以不少人认为确实是天然蛋白免疫得到的抗体是最好的,有兴趣可以看看这篇文章:Generation and Characterization of a Panel of Monoclonal Antibodies Against Distinct Epitopes of Human CD146,一个典型的从天然组织中纯化出蛋白作为抗原制备单抗的例子。 在抗原的形式上,也是各式各样,根据自己的需要有不同的喜好,大部份人都推荐接近天然构象的蛋白,即使是重组蛋白,buffer 也尽量gentle, 另一些人则喜欢跑胶然后切胶打动物,还有的转膜后剪膜免疫动物(这一个通常和从天然组织中纯化的方法联用)。 还有人喜欢用过表达的细胞或转化的细菌作为免疫原(当然也有全细胞或者细胞组份裂解液作为免疫原的,此乃后话)。对于做免疫组化用的单抗制备,则还有更特殊的处理手段。 另一些人则认为,用DNA直接免疫也许更好。其方法是把cDNA连到真核表达载体中,然后直接注射动物,在佐剂的作用下载体就带着cDNA进入动物细胞,然后在动物细胞就有目的蛋白表达出来,这些蛋白从细胞释放出来后就可以引起免疫应答(整个理论还没有建立完整,一切都在YY中), 这种方法免疫中,现在缺少有效的佐剂,所以免疫效果很难保证,不过在比较低的效价下,很多人也可以得到阳性克隆。 说了这么多,还是很沮丧,虽然看起来选择很多,但是能真正用到工作中的选择并不多,有时候是条件问题,有时候则是成本和精力问题。第一个话题就写这么多吧。 动物免疫 动物免疫故事比较多,简单点说。 实验动物的选择: 做单抗的动物最开始是小鼠,后来又有像epitomics这样的公司用兔子的,还有一些人用大鼠神马的,当然其它的动物的也有,据不完全统计,现在能用传统方法制备单抗的动物已经有二三十种了。 但是最主流的还是小鼠和兔子了。兔子不讨论,epitomics对其有特殊的专利,这个基本上和咱们没关系。小鼠,用得最多的还是Balb/C了,因为大多数骨髓瘤细胞(SP2/0, X63, Ag8.653,FO和NSO)都来自于Balb/C小鼠,为了使hybridomas稳定,所以实验小鼠基本上还是Balb/C。 不过有文献提到了用NZB/W小鼠制备高同源性单抗的,原因是NZB/W小鼠是一种容易发生自身免疫疾病的小鼠模型,一般在5个月以下时基本不会发病,但是对自身的蛋白仍然有潜在的排斥反应。 免疫佐剂: 这一个方向在近十几年以来倒是发展得很快。 最开始的时候Sigma的弗氏完全佐剂和不完全佐剂一直是黄金组合(铝盐佐剂也用得比较多),但是后来人们发现CFA/IFA毛病很多,诸如不利于动物健康、刺激免疫应答周期过长等等,于是各种新式佐剂层出不穷,几乎每家试剂公司都有自己独特的佐剂。而且有效成份也多种多样,如脂质体,CpG,细胞因子,分子伴侣,特殊化学药物(如左旋咪唑), 细菌或病毒的全部组份或部份(如LPS,肽聚糖),甚至还有一些是中草药提取物(如蜂胶、皂甙,当归多糖)…… 在形式上,大部份还是延用了CFA/IFA的油乳性质,但是这两年来免乳化佐剂在国内发展比较快,如我们现在使用的Quickantibody就是,武汉这边还有另一个产品叫赛弗诺的也与其类似,同时这些新型的佐剂对抗原的使用量要求很低,而且免疫周期也短,所以比较受欢迎,毛病是商家对机理保密,用户无法获知其可能潜在缺点。 总之最后就变成了一种根据个人喜好而选择的产品。 当然另外还有人说佐剂不是必须的,不加佐剂也可以免疫得不错,站长自己没尝试过。 免疫部位:这个没什么好说的了,也基本上是根据喜好来的,皮下、腹腔、脾内、肌肉、腋下、脚垫、静脉,各种地方免疫都说得过去,而且大家都能成功,所以这个就没什么好选择的了,不过大部份人还是认为皮下是最有效的,因为皮下含有大量的DC细胞,而DC细胞是重要的APC。 这里需要提出的是有一种叫作RIMMS的免疫方式极少人用到,但是据说效果不错。 RIMMS即多位点重复免疫(repetitive immunizations multiple sites),意思是在相同的地方低剂量短间隔重复免疫,一般是在小鼠背上皮下选择四五个点,每三天左右在这些点进行低剂量免疫,一般十几天就可以完成免疫。 大家可以看这篇文献:Rapid development of affinity matured monoclonal antibodies using RIMMS和这篇:Shorter development of immunoassay for drugs application of the novel RIMMS technique enables rapid production of monoclonal antibodies to ranitidine, 不过成功的实例中,很多人都是取小鼠的淋巴结而非脾脏进行融合的,淋巴结不好取啊。 免疫周期和间隔: 大部份人基本都同意免疫周期和免疫间隔尽量长一点比较好,这样得到的抗体亲和力更高(除了上述的RIMMS外)。 甚至有人打完第一针后,再过九个月才打第二针的,作者说效果很好,这个方法显然不适合大规模免疫,不然动物管理的压力咱们是承受不起的。另外,一些新型的佐剂则强调短周期也可以得到高亲和力的抗体的, 市场上有很多佐剂宣称两周内即可完成免疫并得到高效价的血清的,实在是太快了。另外最近有文献还对白天免疫动物还是晚上免疫动物更好这一问题作出了探讨,比如这篇:The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity , 作者认为一些调控免疫的分子也有生物节律性,它们的表达水生是跟随生物钟有规律变化的,在这些调节分子表达水平比较高的时候进行免疫或许可以得到更好的免疫效果。