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利用硅胶膜法提取纯化质粒DNA摘要：系统的阐述了质粒核酸提取过程中针对裂解和核酸纯化两大关键步骤的研究，重点介绍了利用硅胶膜法提取纯化核酸，以及在实验过程中的一些经验。关键词：硅胶膜法；纯化；质粒DNA一、前言随着分子生物学技术的发展，核酸的分子生物学技术成为了药物研发、遗传病和感染性疾病的诊断、基因研究及物种鉴定等的常用研究手段之一。然而，核酸提取质量是进行下游一系列研究的关键，因此提取的方法会直接影响后续实验。细菌质粒是一类双链闭合环状的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份。质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。硅胶膜法是一种应用最为广泛的提取纯化质粒DNA的方法，因硅基质材料可特异吸附核酸DNA，使用方便、快捷，不需要使用有毒溶剂如酚、氯仿等，使得提取质粒核酸像过滤一样简单。二、实验部分2.1 原理硅基质材料吸附核酸的原理主要利用DNA在高盐低pH值环境下与硅基质材料相结合，在低盐高pH值环境下与硅基质材料脱离的特征。其机理是带负电荷的DNA和带正电的二氧化硅粒子之间有很强的亲和力。在高浓度盐离子的作用下，盐离子打破水中的氢和二氧化硅上带负电荷的氧离子间的氢键，DNA与硅基质紧密结合，洗涤除去其他杂质；再用低离子强度的TE缓冲液或蒸馏水洗脱结合的DNA分子，机理是当盐被清除后，再水化的硅基质破坏了基质和DNA之间的吸引力，因而DNA从硅基质上被洗脱下来。2.2 主要试剂溶液Ⅰ:50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。溶液Ⅱ：0.2NNaOH，1% SDS。溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。漂洗液：60mM 乙酸钾、10mM Tris-HCl (pH 7.5) 、60% 乙醇TE：10mMTris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。2.3 主要步骤该步骤采用CommaPrePTM的质粒小提纯化柱。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507171513_556042_3310_3.jpgCommaPrep™核酸小提柱可用在核酸提取过程中过柱结合、洗涤、洗脱步骤中http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507171516_556043_3310_3.jpg1. 取1.5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000 rpm 离心1 min， 尽量吸除上清。 （注意：应根据所培养菌体的浓度与质粒的拷贝数，确定收集的菌液量。菌量过大可能导致溶菌不充分，纯化时会影响质粒纯度菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。2. 将细菌沉淀重悬于100uL溶液Ⅰ中，移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀，使菌体分 散混匀。 (注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。并且溶液Ⅰ中 要加入适量的RNA酶）3. 向离心管中加入200uL溶液Ⅱ，温和地上下翻转数次，并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解。（注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。）4. 加入150uL溶液Ⅲ，立即将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀。12000rpm， 离心2分钟。 (注意：加入溶液Ⅲ后，要立即将管温和颠倒，避免产生局部沉淀。如果上清液中存在沉淀，可再一次离心。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物。）5. 吸取上清至吸附柱（内管）中（吸附柱在离心管中），尽量不要吸出沉淀，12000rpm，离心30秒。弃去废液，将吸附柱重新放入一个新的离心管中。6. 加入750uL的漂洗液（漂洗液要在实验前加入无水乙醇）12000rpm离心，1min。取出 DNA结合柱，弃废液，重新插入DNA结合柱到离心管中。7. 用500uL漂洗液重复冲洗过程。12000rpm离心，1min。（注意：重复一次可以增加质粒的回收效率。）8. 转移DNA结合柱到1个新的1.5mL离心管中，加入60uL的无核酸酶的水到DNA结合柱中，洗脱质粒DNA，室温条件下，12000rpm离心，1min。 （注意：不要转入DNA结合柱中的漂洗液，如果混有，就需要12000rpm离心，1min。洗脱缓冲液体积不少于50uL，体积小会影响回收效率。 洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大的影响，若用水洗脱应保证pH值在7.0-8.5范围内， pH小于7会降低洗脱效率。如果长期保存DNA，洗脱液建议使用TE。）9. 加入100uL的无核酸酶水到结合柱中，洗脱质粒DNA，离心12000rpm，1min。（注意：重复一次，增加洗脱效率。）10.洗脱DNA后，从1.5mL离心管中取出DNA结合柱并废弃。11.取2uLDNA进行电泳，检测DNA质量。12.将纯化的DNA溶液于-20℃中。三、实验结果图为质粒DNA（10kb）的凝胶电泳图，说明提取效果较好。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507171525_556044_3310_3.jpg
一、实验目的与原理质粒多为一些双链、环状的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是进行分子生物学实验操作，进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA载体。提取质粒的基本步骤分为三步：①细菌的培养和质粒的扩增②细菌菌体的裂解③质粒DNA的纯化本实验采取的菌体裂解方法为碱解法，质粒纯化方法为梯度离心法。二、材料与试剂1、材料：大肠杆菌2、仪器：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪3、试剂：Solution I 25 mM Tris-Hcl(pH7.4) 10 mM EDTA(pH8.0) 50 mM葡萄糖 高压灭菌，4℃保存 Solution II 0.2 M NaOH, 1%SDS 现配现用 Solution III 5 N KAc pH4.8 高压灭菌，4℃保存 3 M NaAc PH5.2, 高压灭菌，4℃保存。异丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，无水乙醇，70％乙醇，LB培养基，电泳试剂三、操作步骤1、细菌繁殖LB培养基，2 ml/20ml，37℃，200rpm，摇一摇，过夜2、离心10 min，5000 rpm, 4℃；弃上淸液3、沉淀（菌体细胞）预冷的TES缓冲液洗涤，离心10 min，5000 rpm, 4℃加入预冷的1 ml Solution I，冰浴，10 min4、重新悬浮，加入150 ul溶菌酶母液，室温放置5 min5、加入1.2 ml Solution II, 冰浴，5 min6、加入0.9 ml预冷乙酸钾，混匀，离心10 min，12000 rpm, 4℃7、加入1.5 ml异丙醇，-20℃冰箱内放置15 min8、离心10 min，12000 rpm, 4℃9、取沉淀，悬于400 ul TE缓冲液中10、加入40 ul，3 M NaAc11、酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀12、离心10 min，12000 rpm, 4℃13、取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于50 ul TE缓冲液中。14、电泳检测提取DNA的质量四、结果与分析超螺旋结构DNA
第一节概述 把一个有用的目的DN***段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。 质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。 利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些抗生素,降解复杂有机物,产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。 质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DN***段；（4）具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。 从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DN***段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。
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