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实时定量系统

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实时定量系统相关的论坛

  • 实时定量PCR应用中的问题及优化方案

    聚合酶链式反应（polymerase chain reaction ， PCR）自诞生之日起就决定了它不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法，而且也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具。随着分子生物学技术研究的不断进展，定量PCR技术取得了突飞猛进的发展，不仅建立了一系列的方法，而且也诞生了许多与这些方法相匹配的新型热循环仪和实验材料。实时定量PCR(real-time quantitative PCR)技术便是一种具有革命性意义的定量PCR技术，所谓实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量。目前它作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域，仅2000-2001年，收录在Medline上的以real-time PCR为关键词的文章就达一千多篇。实时PCR技术较之与以前的以终点法进行定量的PCR技术具有无与伦比的优势。首先，它不仅操作简便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特异性。其次，由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定，大大降低了污染的可能性并且无须在扩增后进行操作。另外，它还可以通过不同的引物设计在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增，即多重扩增。本文将对实时定量PCR目前的应用状况、仪器应用、新材料进展以及实验条件的优化作一综述。实时定量PCR的应用现状实时定量PCR技术自1996年诞生以来，由于它显著的优越性，不仅广泛的应用于分子生物学的各个研究领域，而且也开始作为一种诊断手段应用于临床。其应用涉及到的范围包括DNA、mRNA和病毒荷载量的定量，核酸多态性分析，基因突变分析等多个领域。Giulietti 等人对用实时定量PCR测定细胞因子基因的表达作了详细的描述。细胞因子是一种调节蛋白，它对免疫反应、炎症反应具有重要的调节作用，其量的改变常常与一些疾病，如炎症反应、自身免疫性疾病、移植排斥有密切的关系。由于所得到组织样本常常因为太小而不能满足在蛋白质水平的检测，另外，通常用的蛋白质检测方法（如ELISA）的灵敏度也难以完成对极微量的蛋白产物的检测，所以应用PCR定量进行基因诊断就显得十分有意义。众所周知，cDNA微排列和差异表达PCR技术是对基因表达变化分析的两种关键技术，但是这两种技术只能对基因表达变化进行定性分析，而不能进行定量分析。Rajeevan等人利用实时定量PCR技术却成功地将基因表达的变化进行了量化，不仅有效地证明了上述两种方法的有效性，而且提供了一种具有高通量的对基因表达变化进行检测的新技术。实时定量PCR技术的出现不仅增强了有关对基因量变化的研究方法，而且也增强了对基因质所发生变化方面的研究。例如Laird和他的同事们建立了一种被称作Methylight的实时定量PCR方法，它能通过特异的引物和/或Taqman探针检测基因CpG岛的胞嘧啶是否发生了甲基化。由于实时PCR的敏感性和特异性，使得这种方法对胞嘧啶的过度甲基化常常具有极高的灵敏度。最近有研究表明这种方法可以从食管癌病人的食管粘膜中检出含有发生了过度甲基化基因的细胞。又如Sevall等人证明可以用实时定量PCR方法区分含有突变的等位基因。这是利用两种不同的荧光报告基团标记Taqman探针，该探针既可同野生型基因又可同突变型基因发生杂交，由于探针的杂交效率及随后的切割是由杂交决定的，所以如果出现一种信号强于另一种信号则表明两条基因具有同源性，若两种信号都增强则表明为异源性。目前实时定量PCR在临床诊断方面的应用主要体现在对感染组织或细胞负载病毒的定量测定上，这一技术对DNA和RNA病毒都可以检测，目前已有标准的操作手册供人们使用，但是必须明确，国际上既没有统一的病毒荷载的标准，也存在着对其标准曲线和定量准确性的各种争论。这里值得一提的是一种称为NASBA（nucleic acid sequence-based amplification）的技术，它是一种利用电化学以光的等温PCR反应，在反应过程中能产生一种与靶RNA反极性的RNA扩增子，分子beacon常用于这种技术 ，这种方法常常用于对逆转录病毒的定量测定。常用的热循环仪对PCR产物进行实时定量的测定之所以能成为现实，并且应用如此广泛，其中一个重要的原因就是新的热循环仪的研制与推广。目前，国内外常用的热循环仪主要有以下几种：一、PE公司生产的Applied Biosystem系列1、 ABI Prism 7700 Sequence Detection System (SDS)是第一种作为商业用途的实时PCR测定仪，它由激光激发荧光，并且可在500-660nm范围内调节波长，可以用于基于水解探针、双链DNA结合染料、分子beacon原理的分析。一次可以测定96个样本，并且速度较快，一批样本的完成只耍要2小时。但是它不能实时对扩增结果进行分析，而只能在全部扩增结束后才进行数据分析。2、Gene Amp 5700 SDS: 它的基本工作原理和操作与ABI Prism 7700 SDS相同，但是它是利用卤素灯为激发光源，而且只设计了一个检测波长。3、ABI Prism 7900 SDS: 这是一种为实现高通量检测而设计的仪器，其基本构成与ABI Prism 7700 SDS相同，但程序设计完全实现自动化要求，而且有两种样品盘可供选择（96孔和384孔）。如果加上一个装载辅件，可以在24h之内完成84个384孔板的样本测定。二、Roche 公司生产的Lightcycler热循环仪，它以能装载20-25ul的毛细硅管作为反应管进行扩增，光源选用冷光源系统，可以减少光源对样本的影响。由二极管发射蓝光激发荧光，并提供三个滤光片，可利用荧光分光测定的原理，同时对一个反应体系的多种荧光进行检测，所以它完全可以进行多重PCR.由于Lightcycler使用了其独特毛细管反应体系和空气快速热循环系统，使样本能在非常短的时间内有效地实现温度变化，从而能在20-30min内快速完成30-40循环，达到样本扩增的目的。Lightcycler通常使用的实验材料主要是SYBRI Green I荧光染料和Taqman荧光探针和杂交探针。虽然Lightcycler有相当多的优点，但是这也有一些不足之处，由于它只提供一个32孔的样品盘，这使得不能在一次进行较多的样本测定。三、Bio-rad 公司生产的iCycler iQ：这种仪器提供连续的检测波长调节，程序满足实时数据处理，可以同时在一个反应体系中检测四种荧光信号，由于一批能完成96个样本的测定，所以能提供相对较快的扩增反应。四、Strategene公司的MX4000 Multiplex: 这种仪器的检测波长可在350-750nm范围内进行调节，以卤素灯作为激发光源，常选用的实验材料包括Taqman探针、杂交探针和分子信标（molecular beacon），其样品盘的规格有多处可供选择，包括96孔盘、8联管或单管，其程序也提供实时数据分析。五、Cepheid公司的Smart Cycler System: 这种仪器正如其名一样具有强大的功能，它有16种反应模式可供选择，而且每种模式都有各自的程序，任一模式不仅能同时检测四种荧光信号，而且不同的使用者可对同一批样品同时运行不同的模式进行检测。Smart Cycler System的这种设计虽然有其优点，但是其缺点也是显而易见的，由于其将样品盘分得过细，所以不利于同时进行较多样品的分析。六、Corbert Research 公司的Rotor-Gene: 这种仪器与Lightcycler相比，属于中心型热循环仪，即从反应体系内部进行热变化；其具有双光源系统，蓝光在470nm处激发荧光，绿光在530nm波长激发荧光；具有两种样品盘（32孔和72孔）供选择；可以对多种荧光材料进行测定

  • 便携式实时荧光定量PCR仪特点及规格参数

    [url=http://www.f-lab.cn/pcr/rpcr-m8.html][b]便携式实时荧光定量PCR仪rpcr-m8[/b][/url]是一款便携式实时荧光定量PCR检测系统和实时PCR仪,为客户提供高效而精确的PCR测试结果,在任何时间,任何地点都能快速提供PCR检测能力。[b]便携式实时荧光定量PCR仪rpcr-m特点[/b]:●便携式：12V直流，高效节能。●用户友好：简单的界面。●小尺寸：便携式设计,可携带到任何地点工作,也可用实验室台面,只有2.1kg 。●灵敏度高：低至1COPY。●样本容量：8x0.2ml PCR管●两个通道：SYBR/FAM, ROX/Texas Red[img=便携式实时荧光定量PCR仪]http://www.f-lab.cn/Upload/RPCR-M8.jpg[/img]●开放系统：与大多数商业试剂兼容。[b]便携式实时荧光定量PCR仪rpcr-m规格参数[/b]光源：高功率LED探测器：光电二极管探测器加热/制冷模式：peltier最大升温速率：最大3℃/s热均匀性：+/-0.2℃温度精度：+/-0.2℃温度范围：4-100℃样品类型：8孔反应容积：10-150微升加热时间：1分钟探测灵敏度：1copy高分辨率融化：支持最高分辨率为0.5℃倍增性能：可探测2种染料,同时探测470/520nm(SYBR/FAM)和565/625nm(ROX/Texas Red)尺寸： 205x190x98mm重量：2.1kg计算机要求：WIN7,WIN8或Win2000工作温度：15-30℃工作湿度：15-90%更多PCR仪请浏览官网：[url]http://www.f-lab.cn/pcr.html[/url]

  • ABI Stepone实时荧光定量PCR仪

    ABI Stepone实时荧光定量PCR仪

    [img=,280,259]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707060949_01_3194653_3.jpg[/img]ABI Stepone实时[url=http://www.fameinstrument.com.cn/Product/758432351.html]荧光定量PCR仪[/url]品牌介绍：美国应用生物系统公司StepOnePlusTM实时PCR扩增仪采用用户易于使用的界面，是一种功能强大的实时PCR仪。得益于其高度灵活性和易用性，甚至连先前几乎无实时PCR经验的研究人员都完全有信心设置和操作StepOnePlusTM扩增仪。此新型低通量扩增仪价格经济适中，适合于具有各种实验经验的人员使用。从软件首页上开始，配合可选的操作向导，引导用户执行实验的各步骤，包括样本和反应设置、热循环和荧光检测等。StepOnePlusTM扩增仪甚至还可协助用户在线查询所需的实时PCR试剂。荧光基团检测化学试剂包括基于FAMTM和VIC染料标记的TaqMan探针的分析试剂，提供卓越的特异性和灵敏度，便于进行实时定量检测、基因分型分析和多重反应分析。此扩增仪还提供SYBR Green I染料化学试剂，是执行靶标发现、初始筛选分析或仅需少数反应类研究的一种经济、实用的选择。产品特点：1. 高效益的Stepone Plus 4色96孔反应板规格，提供精确的实时定量PCR结果2. LED光学系统可记录从FAMTM/SYBR Green、VIC/JOETM、ROXTM和NED/TAMRA染料发出的荧光信号，便于进行基因表达分析、病原体定量测定、单核苷酸多态性基因分型以及存在/不存在分析3. 采用同一个加热块执行标准和快速PCR反应（不超过40分钟）4. 直观、灵活的软件和向导，指导新用户轻松地完成实时PCR实验的三个简明易懂步骤5. 超小型化设计的仪器箱架，适合任何实验室环境6. 五种安装配置，适合不同实验室需要7. LCD触摸屏和USB驱动器，易于设置和分析8. 便捷的远程监控和电子邮件通知功能，节能省宝贵时间9. 具有性能独特的VeriFlex™ 加热块，可实现六个独立控制的peltier加热块，精确控温，加强了PCR的功能多种实时PCR应用：1、仪器应用：SNP（单核苷酸多态性）基因分型、基因表达分析、MicroRNA表达分析、染色体易位分析、基因检测、病毒载量分析；2、软件应用：基于标准曲线的绝对定量、相对标准曲线、基于比较Ct值的相对定量、融解曲线分析、存在/不存在（阳性/阴性）分析（包括阳性内对照）、基于或非基于实时扩增的基因分型。荧光检测：StepOne扩增仪中的所有样本反应孔均使用一种大功率蓝色LED照明。该LED可持续使用10年，减少了更换光源的需要。荧光发射通过电二极管上的滤光器进行检测。发射滤光器经优化可配合FAMTM/SYBR Green I、VIC／JOETM和ROXTM荧光染料使用。软件：美国应用生物系统公司StepOne实时PCR扩增仪配备的软件在WindowsXP操作系统上运行，并提供仪器控制、数据采集和数据分析等功能。软件采用用户易用的直观界面，包括下列功能：1. 实验没计向导，帮助您设计和设置实验。2. 移液方案和配方，用于快速设置实验。3. 高级设置，适用于需要灵活性以便进行更复杂应用（如多重反应）的高级用户。4. 快速启动设置，允许您扛即启动实验并于稍后反应板信息。5. 实时监视扩增增长曲线，让您即时查看实验进程。6. 远程实日寸监控，可从一台远程计算机监控实验进程。7. 电子邮件通知，在实验已开始或结束时提醒您。8. 自动基线和白动阈值功能令数据分析得以简化。9. 自动单核苷酸多态性基因分型识别功能，具有直观的图表输出和量值分配特性。10. 工具提示功能，当查看扩增曲线或单核苷酸多态性基因分型图谱时，易于识别样本反应孔。11. 故障排除标记，帮助您诊断并解决实验中出现的问题。12. 多图谱视图，可同时从四个透视图评估数据。13. 简便的剪切和粘贴功能。14. 方便地导出为PowerPoint、Excel格式或直接导出为jpeg文件。技术参数：1、性能指标：① 动态范围：9个数量级的线性动态范围② 灵敏度：可在单一报道基因TaqMan分析的30μl反应量中检测10份拷贝RNaseP模板③ 精密度：使用TaqMan RNase P仪器验证反应板，StepOne扩增仪可分辩5000~10000个RNase P模板拷贝（置信度99.7%）④ 运行时间：快速，使用TaqMan RNase P验证测试反应板，40循环PCR反应耗时不足40min；标准，40循环PCR反应耗时不足2h⑤ 安装规格：发货前，每台StepOne扩增仪均已经过专业校准，以确保光学和热学精确度。在不足四小时安装期间，通过RNase P仪器验证测试反应板会验证各项性能规格，以确保数据的高度精确性。2、无需PC及可联网操作。StepOne扩增仪可采用五种不同配置进行安装：① 本地协作配置（计算机控制）② 独立运行配置（无需计算机）③ 联网配置④ 本地协作配置（局域网计算机控制）⑤ 扩增仪联网配合木地协作计算机配置（计算机控制）连接至以太网能够实现远程监控及下载和上载试验文件与数据。3、计算机规格尽管StepOne扩增仪在无计算机的情况下也可执行操作（可从仪器触摸屏上通过快速启动功能启动实验运行），但StepOne扩增仪可能配备有膝上型电脑或立式计算机及USB记忆棒。也提供不带计算机的扩增仪。用户自行提供的计算机必须满足以下最低要求方可支持本扩增仪：• WdindowsXP操作系统并已安装ServicePack2• 英特尔处理器，主频1GHz或更高• 最小内存容量512MB• 最小硬盘驱动器容量20GB• CD-ROM光盘驱动器• 以太网接口适配器（网卡）（10BASE-T）• 最低分辩率达1024×1280的显示器4、便捷的在线查询：为便于订购实时PCR扩增母液和塑料器皿耗材，可通过扩增仪软件中的Design Wizard（设计向导）访问实验材料清单，并直接链接到美国应用生物系统公司产品仓库（可选）。服务与保修：购买StepOneTM实时PCR扩增仪包括—年期的免费保修（包括零件保修和维修工时）服务。5、仪器规格：① VeriFlexTM加热块：六个独立控温区② 热循环系统：珀耳帜效应系统（Peltier-based System）③ 加热块规格：96孔加热块④ 支持容量：10-30μl⑤ 支持耗材：96孔（0.1ml）反应板与光学盖膜、96孔（0.1ml）反应板与光学平盖、8连管（0.1ml）与光学平盖、单管（0.1ml）与光学平盖⑥ 样本升降温速率：快速模式 ±2.2℃/s；标准模式 ±1.6℃/s⑦ 加热块最高升降温速率：4.6℃/s⑧ 温度范围：4℃-100℃⑨ 温度精确度：设定值/显示温度的±0.25℃（35~95℃）（时钟启动后3min开始测量）⑩ 温度均一性：±0.50℃（时钟启动后30s），温度范围35℃~95℃⑪ 解链曲线分辨率：低至0.1℃⑫ 光学系统：LED激发光源，发射滤光器、光电二极管⑬ 安装时已校正染料：FAMTM、SYBR Green 、VIC、JOETM、NED、TAMRA、ROXTM染料⑭ 被动参照染料：ROXTM染料⑮ 数据采集：所有滤光器中收集中的所有反应孔数据（无论何种反应板设置）。试验结束后反应板设置可修改⑯ 定量PCR分析时间：快速 不超过40分钟；标准 不超过2小时⑰ 触摸屏：LCD/6.5″ Full VGA（640×480）/32K色⑱ 尺寸：宽度 24.6cm（9.7″）、深度 51.2cm（20.2″）、高度 42.7cm（16.8″）、重量 23.6kg（52lb.）⑲ TaqMan基因表达，SNP（单核苷酸多态性）基因分型和MicroRNA分析

  • 关于LC系统中定量的各个部件的解释

    （http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20130714/4850104/index_1.shtml）最近在以前发的一篇帖子中有版友开始讨论LC系统中定量的问题，其中有很多误解，所以就写一张帖子解释一下。到目前为止，在LC的定量系统中主要分为2种：一种是可以随意设置进样量的自动进样系统，大多要求在定量环容量的50%以下。这种系统多是由定量环，计量泵等组成。根据流路设计，有些计量泵在流路中，如1100，有些在流路外，如2695和手动进样阀。其中具有定量功能的是计量泵，注射器（如果有）。定量环只做为一定量液体在流路中的容器而已，这个容器的主要作用是保证样品在流路中，不流出流路外，或者避免样品溶液进入计量泵导致扩散。所以有人说用PEEK管做定量环也可以，我认为应该影响不大，只要注意接口问题和管道体积问题就行。以上所谓流路均指分析流路。以上中比较特殊的是2695，它是注射器和计量泵配合使用，进行定量进样的，其中注射器决定抽液的截面积，计量泵确定抽取的距离，从而确定进样体积。第二种是满环进样。在这种情况下，你用任何抽取装置都是无所谓的，只要保证抽取的量是定量环的3～5倍体积，并且不会抽入空气即可。3～5倍定量环体积是用于消除“管壁效应”的。这时，起定量作用的就是定量环本身了，进样量就是满环体积。当然在各个领域有各种变种，只要了解样品的动力和流路，基本就可以理解他们是怎么定量的了。希望以上知识对各位有所帮助。

  • 煤质在线实时检测分析与监控系统简介

    “煤质在线实时检测分析与监控系统”（以下简称为煤质在线检测系统）是我们在国际上率先开发的，用于电厂入炉煤炉前煤质在线实时检测分析、入厂煤全程实时监测的绿色环保、低能高效、无辐射的高科技产品。该系统应用高精的红外检测分析技术，在国际上率先真正实现了原煤的热值及灰份、挥发份等工业分析值的在线实时检测与分析，其检测分析方法于一九九九年通过全国鉴定，结论为国际领先水平,在没有应用推广及经济效益的情况下，获辽宁省科技进步三等奖。煤质在线检测系统采用全封闭恒温保护设计，于二零零三年六月十二日在阜新发电厂通过在线实时检测分析现场验收。为我国乃至世界的原煤检测分析技术尤其是热值的直接检测，开辟了一种快速、简便、高效、实时、全程监控的新方法。一、 主要技术路线及技术关键煤质在线检测系统采用傅立叶变换红外光谱分析技术，红外光是一种电磁能量，当其照射到样品时，由于样品内有机成份在不同波数对红外光吸收能量不同，将这些不同记录下来，既得到红外光谱，当对红外光谱所包含的信息进行分析后，就会得到样品内不同有机成份的性质及含量。煤质在线检测系统是利用红外探测光对在线（输煤皮带上）原煤样品进行实时测量，通过对燃煤中各种官能团对红外光吸收各有差异的特点，应用计算机将这些差异进行识别处理，从而准确地测量出燃煤的热值及灰份、挥发份等工业分析值。 煤质在线检测系统的技术关键是根据样品光谱中的信息特征，利用设计开发的软件及建立的数学模型系统，通过计算机识别，进行定性与定量分析。定性分析是利用模式识别与聚类的一些算法，主要用于将所测到光谱进行分类。定量分析是根据比耳定律，应用化学计量学的方法，建立全谱区的光谱信息与含量及性质间的数学关系，通过严格的统计验证并选择最佳数学模型，计算出对应成分的含量或性质。 该技术是将硬件和软件相结合，特别是利用软件，解决红外光谱中谱峰重叠、高背景底强度的信息、图谱不稳定等难点，充分提取红外光谱的信息，达到分析的目的。二、达到的指标 此前，由于没有有效的在线实时检测手段，火力发电厂入炉原煤检测只是每天在炉前进行抽样，经混样、缩分、制样，化验分析等步骤，要二十四小时后才能出具一份工业分析值报表，供生产调度参考。这种方式，使得燃煤在已经燃烧后很长时间才得到其工业分析值，不能起到指导生产、节约成本的目的，使燃煤成本的结算始终处于负平衡态，因此，无法实现发电厂竟实时竟价上网的目标。 煤质在线检测系统完全改变了原始的离线检测方法与手段，实现了在线、实时、连续检测分析与监控：1． 检测与分析时间：全程连续跟踪检测一组数据（包括低位热值、弹筒热值、空干基灰份、干燥基灰份、收到基灰份、干燥无灰基挥发份、空干基挥发份等），需时间约为60s；2． 检测指标为：（1） 热值（低位、弹筒）：±1000J/g；（2） 灰份（空干基、干燥基、收到基）：±2%；（3） 挥发份（空干基、干燥无灰基）：±1%。 由于上述指标的实现，可使燃煤结算达到分时及炉前预知燃煤成本的正平衡态，从真正意义上实现了指导生产，从而为实现竟价上网提供了重要的手段。三、 傅立叶变换红外光谱仪的原理傅立叶红外光谱仪的原理是把光源发出的光，经迈克尔逊干涉仪调制成干涉光，再让干涉光照射样品，由检测器获得干涉图，由计算机把干涉图进行傅立叶变换，得到全波段吸收光谱. 傅立叶变换红外光谱仪在整个检测过程中，只有一个可动镜在实验过程中运动；它的测量波段宽，光通量大，检测灵敏度高，具有多路通过的特点，故所有频率可同时测量；它的扫描速度最快可达60次/秒，因使用调制音频测量，故杂散光不影响检测；因样品放置于分束器后测量，大量辐射由分束器阻挡，样品接受调制波，故使热效应极小；因检测器仅对调制的声频信号有反响，其自身的红外辐射不会被检测器吸收。 四、 傅立叶变换红外光谱仪的特点 付立叶变换红外光谱仪共具备六个特点，既高光通量的特点，采用光能量损失很小的反射镜，以使入射光全部通过光孔，使光通量很大；高信噪比的特点，将入射光按不同的频率被干涉仪调制成不同的声频信息值，使所用检测器既获得强度的信息，又获得频率的信息，使各种频率光同时落在检测器上，无须分辨测量既测完全部光谱；高测量精度的特点，使动镜在无摩擦的空气轴承上移动，通过激光干涉图零点取样，用计算机自动完成数据输出及绘图，无人为因素干扰；高分辨率的特点，采用多路通过的方法，使分辨率随采样数据增加而加多；测量速度快的特点，采用多次扫描类加法消除光谱噪声，改善信噪比，提高灵敏度；测量波段宽、全波段分辨率一致的特点，用干涉法采集数据，以数字形式存储运算，使采集范围广且达到全波段分辨率一致。五、现场应用情况“阜新发电厂煤质在线实时检测”科研课题测试工作于二零零三年四月十二日在二十万机组五段输煤栈道进行。装置开机时间九点零六分，结束时间十三点五十八分；现场在线实时采集原煤样品六十四个，实际得到四十九组化验室化验数据，在线实时采集光谱十六组。对比数据见下表：测试指标化验室化验 平均值装置检测 平均值绝对 误差低位热值（g/J）19984.319924.3-60弹筒热值（g/J）22607.323106.8499.5空干基灰份（%）25.8827.791.91干燥基灰份（%）26.5027.951.45收到基灰份（%）23.5423.690.15空干基挥发份（%）29.8830.350.47干燥无灰基挥发份（%）41.6941.38-0.31 阜新发电厂参加建模原煤样品离线化验按照化验室的工作要求进行，建模用原煤样品光谱采取周累计采集方法进行；建模时温度控制在24~26℃，其中低位热值分布范围为10508J/g至29588J/g；弹筒热值分布范围为12392 J/g至29388 J/g；干燥基灰份分布范围为8.49%至55.33%；空干基灰份分布范围为8.1%至53.16%；收到基灰份分布范围为7.27%至50.86%；空干基挥发份分布范围为19.21%至35.55%；干燥无灰基挥发份分布范围为28.26%至52.8%，在建模的过程中，严格按照设备的使用要求进行测试，既设备预热时间大约为40分钟。目前阜新发电厂已正常使用煤质在线检测系统。 综上，煤质在线检测系统以高精的技术、稳定的模型、实时的测量、全程的监控等技术，完全实现了原煤的在线实时检测，它不仅可用于发电厂发电燃煤成本的实时结算，还可用于入厂煤的实时检测监控，一定会为我国的燃煤企业及电力系统的节能带来无穷的经济效益和广泛的社会效益。

  • 【求助】实时荧光定量PCR试剂求助

    本人即将开展大豆转基因方面的检测，研究工作，现已购置ABI公司的实时荧光定量PCR，但是对后期的试剂耗材比较头痛，原厂试剂是不错，但是价格昂贵，不适合大量，长期使用，请问各位，国产那个公司的试剂可以替代，以保证实验长期进行。

  • 利用实时定量PCR分析基因相对表达量

    METHODS 25, 402–408 (2001)Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2－△△CT MethodKenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen¶,1*Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and ¶ Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy,Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534原文下载摘要：现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。2－△△CT方法是实时定量PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。另外，在本文中我们还介绍了两种2－△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量 实时PCR Taqman反转录 PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（1 - 3 ）。实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（4 ,5 ）。实时定量 PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。通过实时 PCR 进行绝对定量已有多篇报道（6 - 9 ），包括已发表的两篇研究论文（10,11 ）。在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。显然，我们说 X 基因在经过某种处理後表达量增加 2.5 倍比说该基因的表达从1000 拷贝/ 细胞增加到2500 拷贝/ 细胞更加直观。用实时PCR 对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的验证。2－△△CT方法可用于定量PCR 实验来计算基因表达的相对变化：2－△△CT公式的推导，以及实验设计，有效性评估在Applied Biosystems User Bulletin No.2（P/N4303859）中有介绍。用2－△△CT方法分析基因表达数据在文献中也有报道（5,6）。本文介绍了该方法的推导、假设以及应用。另外，本文还介绍了2－△△CT两种衍生方法的推导和应用，它们在实时定量PCR 数据分析中都可能被用到。1. 2－△△CT方法1.1. 2－△△CT方法的推导PCR 指数扩增的公式是：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054042.jpg这里，Xn 是第 n 个循环後目标分子数，X0 是初始目标分子数，Ex 是目标分子扩增效率，n 是循环数，C T 代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数。因此：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054008.jpgX T 是目标分子达到设定的阈值时的分子数。C T,X 是目标分子扩增达到阈值时的循环数。Kx 是一个常数。对于内参反应而言，也有同样的公式：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054009.jpg用XT 除以RT 得到：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054010.jpg对于使用 Taqman 探针的实时扩增而言， XT 和 RT 的值由一系列因素决定：包括探针所带的荧光报导基团、探针序列对探针荧光特性的影响、探针的水解效率和纯度以及荧光阈值的设定。因此常数K 并不一定等于1 。假设目标序列与内参序列扩增效率相同：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054011.jpg http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054018.jpg或：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054019.jpgXN 代表经过均一化处理过的初始目标分子量；△CT表示目标基因和内标基因CT值的差异（CT,X－CT,R ）整理上式得：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054020.jpg最后用任一样本q 的XN 除以参照因子（calibrator, cb）的XN得到：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054021.jpg在这里http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054023.jpg对于一个少于150bp 的扩增片断而言，如果 Mg2+ 浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于1 。因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是http://tong.dxy.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054022.jpg

  • 【转帖】实时荧光定量PCR在人感染猪流感诊断中的作用

    彭年才12 张镇西1 兰邹然3 黄兵3 李红东2 李明2 苗保刚2 1西安交通大学生物医学分析技术与仪器研究所 2西安天隆科技有限公司 3山东省动物疾病预防与控制中心2009年4月30日摘要：病原检测方法及仪器是人感染猪流感防控的关键环节，针对实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]分子诊断核酸检测技术的先进性以及国产试剂和仪器的成熟性，本文分析了该技术在以往禽流感检测被采用的国家标准以及使用的广泛性，最后介绍了最新发布的美国CDC《针对人感染猪流感病毒治疗和预防的临时指南》和我国卫生部《人感染猪流感预防控制技术指南（试行）》，两部法规都将实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]确定为人感染猪流感实验室检测的确诊方法。从以上情况可以获知：实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术在人感染猪流感诊断中具有先进、快速、成熟、合法的特点，是一种法定的主流技术，将来实施中，国产化仪器和试剂都有保障。关键词：人感染猪流感 猪流感诊断 快速检测 实时定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url] Real-time RT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]全球性的人感染猪流感公共卫生事件发展势头迅猛，发生国家众多，世界卫生组织29日晚已将全球流感大流行警告级别从4级提高到5级，我国也于28日召开了国务院常务会议对防控进行了部署。现在已进入关键的防控措施落实阶段，其中检测与诊断技术至关重要。实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术在以往禽流感诊断中的应用众所周知，虽虽然本次人感染猪流感事件的病毒基因序列还在进一步确立当中，但本次疫情病原学基础明确，属于RNA病毒感染性疾病。回顾近年来感染RNA病毒的烈性传染病，如SARS、禽流感，世界卫生组织及我国卫生行政和技术部门相继制定了较为成熟的实验室检测和诊断标准，其中我国颁布的应用实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]方法进行实验室检测和快速诊断的标准如《GB/T 19438.1—2004禽流感病毒通用荧光RT—[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测方法》、《GB/T 19438.2—2004 H5亚型禽流感病毒荧光RT—[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测方法》、《GB/T 19438.3—2004 H7亚型禽流感病毒荧光RT—[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测方法》等，同时我们也注意到近年来国家针对食品安全尤其是乳品检测和食物致病菌检测的实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测标准，如《SN/T 1632.3-2005 奶粉中阪崎肠杆菌检验方法：荧光[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]方法》和《SN/T 1870-2007 食品中致病菌检测方法：实时[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]法》。以上实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术在禽流感及其它方面检测的国家标准是该技术在当前的人感染猪流感诊断中应用的基础和前提。实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术及在我国卫生应急中的应用要求 实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction简称Real Time [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]，如果用于RNA检测，这被称为逆转录实时[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]即Real-time RT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]）是实时[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]法，它是指对DNA或经过反转入（RT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]）的RNA通过聚合酶链式反应并实时监测DNA的放大过程，在扩增的指数增长期就测量扩增产物，因为扩增指数增长期测量值与特异DNA（RNA）起始量存在相关性，从而实现定量检测。Real Time [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]的基本目标是精确测量和鉴别非常微量的特异性核酸，从而可通过监测CT值而实现对原始目标基因的含量定量。目前被普遍使用的多种常规[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]方法如各种凝胶电泳[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]法，终点荧光定量法或[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]-ELISA法叫做终点[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]法。实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]法最大的优点是克服了终点[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现DNA/RNA的精确定量。普通[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术发明于1983年，而实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术发明于上世纪九十年代并于1996年生产出了世界上第一台实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪，实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术得以实现的技术要素主要有荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]试剂盒和实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪，我国荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]试剂盒研发实力强大，生产厂家较多，临床诊断的品种如HBV/HCV及禽流感诊断试剂盒性能优良、供应充足，基本实现国产化。在猪流感病毒RNA核酸序列明确的情况下，利用现有的试剂研发平台，人感染猪流感实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]诊断试剂盒很快就会面世。实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪由于技术含量高，只有少数几家中国企业有能力生产如西安天隆科技有限公司生产的TL-988系列仪器不但取得了发明专利、国家科学技术奖、国家重点新产品证书、医疗器械注册证，而且被国家发改委确立为国家高技术产业化示范工程2008年生物医学工程专项，产品性能达到国际先进水平，在乳品检测行业市场占有率比进口仪器还高[1-3]。实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪应用广泛，1999年开始，西方发达国家尝试将[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]应用于临床传染病诊断、食品安全检测以及血液筛查，目前已相当普及。2008年12月13日中国卫生部下发《卫生应急队伍装备参考目录》（卫办应急发[2008]207号），其中要求县级以上卫生应急队伍建设中必须配备[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪和实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪作为传染病控制类装备。实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术在猪流感诊断中的作用已有法规确立在人感染猪流感病毒出现以前，针对猪与猪传染的传统猪流感疫情，近年来我国科技人员经过不懈努力，探索快速检测与诊断方法，发表了一系列应用实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测的研究论文[4-5]。人感染猪流感疫情发生后，美国疾病预防控制中心（CDC）于2009年4月28日发布了针对人感染猪流感病毒治疗和预防临时指南，西安天隆科技有限公司在第一时间将其翻译成中文版本[6]。其中规定了确诊病例的诊断方法：具有急性发烧呼吸道疾病的临床症状并且经实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url] (real-time RT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url])或病毒分离培养 (viral culture)实验室检测方法检验证实感染A（H1N1）型猪流感病毒。卫生部办公厅于4月30日印发了《人感染猪流感预防控制技术指南（试行）》的通知》[7]，其中在实验室检测和病例诊断报告章节，内容如下：检测程序呼吸道标本应首先应用real time RT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]方法检测A型流感病毒的M基因、Swine（ H1N1）的HA基因和NP基因，以及质控对照RNP基因。同时，接种MDCK细胞或SPF鸡胚进行病毒分离，并测定病毒的全基因组序列。 推荐检测方法用Real-time RT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]方法检测猪流行性感冒（ H1N1病毒）病毒。 其他检测方法 快速流感抗原检测 病毒培养免疫荧光法（或装配的IFA ） 显然，上述卫生部法规中，与“其他检测方法”不同，实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]方法被法定为人感染猪流感诊断的推荐检测方法。参考文献：1. Nian-cai Peng（彭年才）, Chun-lin Wang ,Li-li Zhang ,Miao-lin Lu ,Zhen-xi Zhang: Asymmetric [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url] method in generation of HBV ssDNA for pyrosequencing, Academic Journal of Xi’an Jiaotong University,VOL.21 No.1,Feb 2009，54-562. 彭年才，张镇西，李明：乳制品中阪崎肠杆菌的快速检测，食品安全导刊，08.7：96-1003. 彭年才，苏明权，张镇西：乳品检测中实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪的研制，中国乳品工业，200705：62-644. 段廷云，陈红英，崔保安等：实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测H1N1亚型猪流感病毒，畜牧兽医学报，2008。39（6）：752-7565. 张春明，乔传玲，陈艳等，猪流感病毒M基因实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]诊断方法的建立，中国预防兽医学报，2008。20（10）：805-8096. 美国CDC针对人感染猪流感病毒治疗和预防的临时指南（中英文全文）http://www.medtl.com/ckxw.asp?id=757.中国卫生部：人感染猪流感预防控制技术指南（试行）http://www.moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohwsyjbgs/s3577/200904/40319.htm

  • 【原创】实时荧光定量PCR在人感染猪流感诊断中的作用

    实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]在人感染猪流感诊断中的作用彭年才12 张镇西1 兰邹然3 黄兵3 李红东2 李明2 苗保刚2 1西安交通大学生物医学分析技术与仪器研究所 2西安天隆科技有限公司 3山东省动物疾病预防与控制中心2009年4月30日摘要：病原检测方法及仪器是人感染猪流感防控的关键环节，针对实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]分子诊断核酸检测技术的先进性以及国产试剂和仪器的成熟性，本文分析了该技术在以往禽流感检测被采用的国家标准以及使用的广泛性，最后介绍了最新发布的美国CDC《针对人感染猪流感病毒治疗和预防的临时指南》和我国卫生部《人感染猪流感预防控制技术指南（试行）》，两部法规都将实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]确定为人感染猪流感实验室检测的确诊方法。从以上情况可以获知：实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术在人感染猪流感诊断中具有先进、快速、成熟、合法的特点，是一种法定的主流技术，将来实施中，国产化仪器和试剂都有保障。关键词：人感染猪流感 猪流感诊断 快速检测 实时定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url] Real-time RT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]全球性的人感染猪流感公共卫生事件发展势头迅猛，发生国家众多，世界卫生组织29日晚已将全球流感大流行警告级别从4级提高到5级，我国也于28日召开了国务院常务会议对防控进行了部署。现在已进入关键的防控措施落实阶段，其中检测与诊断技术至关重要。实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术在以往禽流感诊断中的应用众所周知，虽虽然本次人感染猪流感事件的病毒基因序列还在进一步确立当中，但本次疫情病原学基础明确，属于RNA病毒感染性疾病。回顾近年来感染RNA病毒的烈性传染病，如SARS、禽流感，世界卫生组织及我国卫生行政和技术部门相继制定了较为成熟的实验室检测和诊断标准，其中我国颁布的应用实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]方法进行实验室检测和快速诊断的标准如《GB/T 19438.1—2004禽流感病毒通用荧光RT—[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测方法》、《GB/T 19438.2—2004 H5亚型禽流感病毒荧光RT—[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测方法》、《GB/T 19438.3—2004 H7亚型禽流感病毒荧光RT—[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测方法》等，同时我们也注意到近年来国家针对食品安全尤其是乳品检测和食物致病菌检测的实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测标准，如《SN/T 1632.3-2005 奶粉中阪崎肠杆菌检验方法：荧光[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]方法》和《SN/T 1870-2007 食品中致病菌检测方法：实时[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]法》。以上实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术在禽流感及其它方面检测的国家标准是该技术在当前的人感染猪流感诊断中应用的基础和前提。实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术及在我国卫生应急中的应用要求 实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction简称Real Time [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]，如果用于RNA检测，这被称为逆转录实时[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]即Real-time RT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]）是实时[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]法，它是指对DNA或经过反转入（RT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]）的RNA通过聚合酶链式反应并实时监测DNA的放大过程，在扩增的指数增长期就测量扩增产物，因为扩增指数增长期测量值与特异DNA（RNA）起始量存在相关性，从而实现定量检测。Real Time [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]的基本目标是精确测量和鉴别非常微量的特异性核酸，从而可通过监测CT值而实现对原始目标基因的含量定量。目前被普遍使用的多种常规[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]方法如各种凝胶电泳[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]法，终点荧光定量法或[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]-ELISA法叫做终点[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]法。实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]法最大的优点是克服了终点[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现DNA/RNA的精确定量。普通[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术发明于1983年，而实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术发明于上世纪九十年代并于1996年生产出了世界上第一台实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪，实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术得以实现的技术要素主要有荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]试剂盒和实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪，我国荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]试剂盒研发实力强大，生产厂家较多，临床诊断的品种如HBV/HCV及禽流感诊断试剂盒性能优良、供应充足，基本实现国产化。在猪流感病毒RNA核酸序列明确的情况下，利用现有的试剂研发平台，人感染猪流感实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]诊断试剂盒很快就会面世。实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪由于技术含量高，只有少数几家中国企业有能力生产如西安天隆科技有限公司生产的TL-988系列仪器不但取得了发明专利、国家科学技术奖、国家重点新产品证书、医疗器械注册证，而且被国家发改委确立为国家高技术产业化示范工程2008年生物医学工程专项，产品性能达到国际先进水平，在乳品检测行业市场占有率比进口仪器还高[1-3]。实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪应用广泛，1999年开始，西方发达国家尝试将[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]应用于临床传染病诊断、食品安全检测以及血液筛查，目前已相当普及。2008年12月13日中国卫生部下发《卫生应急队伍装备参考目录》（卫办应急发[2008]207号），其中要求县级以上卫生应急队伍建设中必须配备[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪和实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪作为传染病控制类装备。实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术在猪流感诊断中的作用已有法规确立在人感染猪流感病毒出现以前，针对猪与猪传染的传统猪流感疫情，近年来我国科技人员经过不懈努力，探索快速检测与诊断方法，发表了一系列应用实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测的研究论文[4-5]。人感染猪流感疫情发生后，美国疾病预防控制中心（CDC）于2009年4月28日发布了针对人感染猪流感病毒治疗和预防临时指南，西安天隆科技有限公司在第一时间将其翻译成中文版本[6]。其中规定了确诊病例的诊断方法：具有急性发烧呼吸道疾病的临床症状并且经实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url] (real-time RT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url])或病毒分离培养 (viral culture)实验室检测方法检验证实感染A（H1N1）型猪流感病毒。卫生部办公厅于4月30日印发了《人感染猪流感预防控制技术指南（试行）》的通知》[7]，其中在实验室检测和病例诊断报告章节，内容如下：检测程序呼吸道标本应首先应用real time RT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]方法检测A型流感病毒的M基因、Swine（ H1N1）的HA基因和NP基因，以及质控对照RNP基因。同时，接种MDCK细胞或SPF鸡胚进行病毒分离，并测定病毒的全基因组序列。 推荐检测方法用Real-time RT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]方法检测猪流行性感冒（ H1N1病毒）病毒。 其他检测方法 快速流感抗原检测 病毒培养免疫荧光法（或装配的IFA ） 显然，上述卫生部法规中，与“其他检测方法”不同，实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]方法被法定为人感染猪流感诊断的推荐检测方法。参考文献：1. Nian-cai Peng（彭年才）, Chun-lin Wang ,Li-li Zhang ,Miao-lin Lu ,Zhen-xi Zhang: Asymmetric [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url] method in generation of HBV ssDNA for pyrosequencing, Academic Journal of Xi’an Jiaotong University,VOL.21 No.1,Feb 2009，54-562. 彭年才，张镇西，李明：乳制品中阪崎肠杆菌的快速检测，食品安全导刊，08.7：96-1003. 彭年才，苏明权，张镇西：乳品检测中实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪的研制，中国乳品工业，200705：62-644. 段廷云，陈红英，崔保安等：实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测H1N1亚型猪流感病毒，畜牧兽医学报，2008。39（6）：752-7565. 张春明，乔传玲，陈艳等，猪流感病毒M基因实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]诊断方法的建立，中国预防兽医学报，2008。20（10）：805-8096. 美国CDC针对人感染猪流感病毒治疗和预防的临时指南（中英文全文）http://www.medtl.com/ckxw.asp?id=757.中国卫生部：人感染猪流感预防控制技术指南（试行）http://www.moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohwsyjbgs/s3577/200904/40319.htm

  • 【原创大赛】实时荧光定量PCR经验总结

    【原创大赛】实时荧光定量PCR经验总结

    实时荧光定量PCR(real-time PCR)作为普通PCR的一项改进，随着分子技术的发展，在基因表达谱分析，基因定量分析，基因检测，SNP分析等多方面受到广泛应用。它的原理是在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，具有灵敏度高，特异性强的特点。由于real-time PCR的这些特点，因此在操作中要特别的细致，每一个细节都可能影响到最终结果。荧光定量PCR有多种方法，包括Taqman探针法，分子信标法，SYBR Green法，LUX Primers法等，我在的实验室一般采用SYBR Green法，而我也做过几次real-time PCR，结果从最初的一塌糊涂到现在的基本能用，期间走过不少弯路，也碰到过不少问题，现在想把这些问题写下来，希望给大家做一下借鉴吧。1 实验前的准备准备工作也很重要，开始前计算好要配的体系，样品布局，选择一个光线较暗，比较安静的环境进行实验。2 实验中每一个混合体系都要充分混匀，这一步非常重要，我之前因为没混匀，每次重复间误差非常大，结果都不能用，白白浪费了很大的功夫，现在我都用振动仪混匀，效果好了很多。另外，在将混合物分到PCR板的时候，枪头要吸打干净，不能有气泡，确保每个重复间的一致性。实验中要集中注意力，注意速度，因为时间一长，荧光效果可能会受到影响。3 实验后分析实验后及时整理分析数据，从扩增曲线，Ct值等方面总结实验经验和教训，为下一次实验开展积累经验。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507121820_555076_3023762_3.jpg http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507121820_555077_3023762_3.jpg

  • 实时荧光定量PCR实验指南：关键步骤与注意事项

    [font=宋体][font=宋体]实时荧光定量聚合酶链式反应（[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]）指的是在[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]进行的同时，对其过程进行监测的能力（即实时）。因此，数据可在[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]扩增过程中，而非[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]结束之后，进行收集。这为基于[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]定量方法带来了革命性的变革。在实时荧光定量[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url] (q[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url])[/font][font=宋体]中，反应以循环中检测到目标扩增的时间点为特征，而非在一定循环数后目标分子累计的扩增量。目标核酸的起始拷贝数越高，则会越快观察到荧光的显著增加。相反，终点法检测（也称 “读板检测”）测量的是[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]循环结束时累计的[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]产物量。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]一、实时荧光定量[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]使用方法[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、样品准备：首先将样品进行细胞分离，提取细胞总[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]，然后将细胞总[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]转换为[/font][font=Calibri]cDNA[/font][font=宋体]，最后将[/font][font=Calibri]cDNA[/font][font=宋体]作为[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]反应的模板。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]反应：将样品[/font][font=Calibri]cDNA[/font][font=宋体]混合物，[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]引物，[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]缓冲液，[/font][font=Calibri]Taq DNA[/font][font=宋体]聚合酶等混合在一起，在[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]反应管中加入荧光探针，然后将反应管放入[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]仪中，按照[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]反应的温度曲线进行反应，最后将反应管放入荧光检测仪中进行检测。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、检测：在荧光检测仪中，按照设定的参数，实时监测[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]反应管中的荧光信号，根据荧光信号的变化，可以实时监测[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]反应的进展情况，并对样品进行定量分析。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]二、实时荧光定量[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]使用注意事项[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、样品提取：根据实验目的，确定样品提取的方法，如细胞分离，细胞总[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]提取，[/font][font=Calibri]cDNA[/font][font=宋体]合成等，以确保最终检测的准确性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]反应：在[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]反应中，应注意控制反应温度，反应时间，反应次数，配制反应体系时，应注意控制反应体系的稳定性，以确保反应的准确性和可靠性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、荧光检测：在荧光检测中，应注意控制荧光探针的添加量，以确保检测的准确性，并且应注意控制检测仪器的稳定性，以确保检测的准确性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、数据分析：在数据分析中，应注意控制参考样品的添加量，以确保数据的准确性，并且应注意检测的结果是否符合实际情况，以确保数据的可靠性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]实时荧光定量[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]技术是一种非常有效的检测技术，它可以用于检测和定量分析样品中特定基因的表达水平，但在使用过程中，还需要注意以上几点，以确保实验的准确性和可靠性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、实验重复性和可重复性：[/font][/font][font=宋体][font=宋体]为了确保实时荧光定量[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]结果的准确性和可靠性，需要进行多次重复实验。重复实验可以检测实验的随机误差和系统误差。同时，实验设计应考虑可重复性，以确保不同实验条件下的结果具有可比性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]6、[/font][font=宋体]质量控制：[/font][/font][font=宋体][font=宋体]在进行实时荧光定量[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]时，需要建立严格的质量控制体系。质量控制包括对试剂、仪器、实验操作过程以及数据分析过程的质控。通过质量控制可以及时发现并纠正实验中存在的问题，确保实验结果的准确性和可靠性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]总之，实时荧光定量[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]是一种灵敏且可靠的分子生物学技术，在生物医药领域具有广泛的应用价值。为了确保实验结果的准确性和可靠性，需要在实验设计、样品处理、反应条件、数据分析、实验重复性和可重复性以及质量控制等方面进行充分考虑和优化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/real-time-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]-service][b]实时荧光定量[/b][/url][/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/real-time-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]-service][b][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/real-time-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]-service][b]技术服务[/b][/url]，更多详情关注[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/real-time-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]-service[/font][/font]

  • 【讲座】实时定量PCR技术”主题网络研讨会（9月26）可以报名了，免费培训班！（附技术资料）

    【讲座】实时定量PCR技术”主题网络研讨会（9月26）可以报名了，免费培训班！（附技术资料）

    [img]http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09505.gif[/img]仪器信息网只做知识的搬运工，福利给你！[b]首届“实时定量PCR技术”主题网络研讨会[/b]，将于2[b]017年9月26日[/b]举办。本届会议5位专家[b]将详解原理知识，解读政策标准，并介绍相关新技术进展，同时从应用中探讨严谨的实验技术方案设计及结果数据分析[/b]。授人以鱼不如授人以渔，系统全面地为你呈现RT-qPCR技术。免费但名额有限，尽快报名，莫错失学习的好机会。会议链接 [url]http://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/RT-qPCR/[/url]我们要求：[b]报名慎重，准时出席，不要浪费名额呦[img=,600,430]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708301634_02_3294588_3.jpg[/img][color=#cc0000]通过审核便可以免费参会，参会请加小编微信号，提醒审核[/color][/b][img=,400,373]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708301634_01_3294588_3.jpg[/img]

  • 整理的实时定量PCR详细资料

    1． 实时PCR原理 对扩增产物进行可重复性的定量长期以来一直是科学家和研究者的目标。传统的方法需要对终产物进行凝胶电泳分析。这种方法可以确定目的产物和竞争产物的大小，估算纯度，计算条带强度。然而，所用扩增试剂和体系的变动会造成扩增的终产物的重复性有较大的变动，成为这种方法的主要弊端.扩增过程的指数期提供给我们最有用的，可重复的数据。在起始的目的DNA量与循环过程的指数期的扩增产物量之间存在着定量关系。这正是实时扩增的基础。随着DNA内嵌染料和探针特异性化学的发展，实时探测量子学的跳跃发展推动了对扩增过程的研究进展。今天的实时设备由荧光读数计和热循环仪组成，用来监测循环过程的荧光。与实时设备相连的计算机收集荧光数据。数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示。 原始数据被绘制成荧光强度相对于循环数的图表。在扩增的每个循环中至少收集一次荧光数据来进行扩增的实时*。用户能够根据一个一个的循环知道那个样品正在扩增。这些即时的数据答应用户看清楚各个样本相对于标准品，阳性对照和阴性对照是如何扩增的。用户不仅能在扩增过程中监督整个反应，还可以根据反馈的信息来优化相应程序。因此增加了敏感性，特异性和有效性。正常化后的数据画成荧光值相对于循环数的对数图。 原始数据收集后可以开始分析。实时设备的软件能使收集到的数据进行正常化处理来弥补背景荧光的差异。正常化后可以设定域值水平，这就是分析荧光数据的水平。样品到达域值水平所经历的循环数称为Ct值（限制点的循环数）。域值应设定在使指数期的扩增效率为最大，这样可以获得最准确，可重复性的数据。假如同时扩增的还有标有相应浓度的标准品，线性回归分析将产生一条标准曲线，可以用来计算未知样品的浓度。2． 探测化学物质有5种主要类型的探测化学物质用于实时扩增，包括：2.1内嵌染料（Sybr-Green I ） 内嵌染料，例如Sybr-Green I ，能与双链DNA结合 a)SG不与单链DNA结合，荧光信号强度较低 b)SG与双链DNA结合，荧光信号强度极大的增强 SG是一种荧光染料，能结合到DNA双螺旋的小沟。处于溶解状态的未结合染料显示低 的荧光强度，一旦结合到双链DNA之后荧光信号增强。这种特性被利用在实时扩增中。由于 在扩增反应中DNA增加，染料结合到扩增产物上，荧光信号增强。荧光信号相对背景水平的 增加进行分析。根据扩增子的长度有多个荧光染料的分子结合到双链DNA上。内嵌染料可以 所有其他传统扩增成分，例如水，缓冲液，MgCl2，dNTPs,Taq-聚合酶，引物和模板一起加到扩增反应管中。因为不需要设计序列特异性探针和新的引物对，这种方法是一种简便 ，性价比较高的实时监测方法。 内嵌染料没有序列特异性，可以结合到包括非特异产物和引物二聚体在内的任何dsDNA上，因此有必要区分目标信号和假信号。内嵌染料可以在反应末尾对扩增产物进行溶解，称为溶解曲线分析。在溶解曲线分析过程中，随着温度从低于产物溶解点缓慢升到高于产物溶解点，实时仪器连续监测每个样品的荧光值。基于产物长度和G/C含量的不同，扩增产物会在不同的温度点解链。随着产物的解链，可以看到荧光值的降低并被仪器所测量。对溶解曲线进行微分可以计算出溶解峰。溶解峰反映了反应中扩增到的产物。这些峰是凝胶电泳中条带的类似物。因此，用溶解曲线数据对SG反应后的产物进行质量监督。2．2 双标记探针 双标记探针是一种短的寡核苷酸序列，5‘末端连接有荧光报告染料，3‘端连接有荧光淬灭分子。由于这种探针只有15-25bp长，报告基团和淬灭基团紧密接近，几乎探测不到荧光信号。在循环过程中，Taq DNA聚合酶对每个引物进行延伸。DNA聚合酶具有外切核酸酶活性，因此在延伸过程中会切除下游的探针。一旦探针被降解，报告染料就会与淬灭分子相分离。 a) 报告染料R发射的能量被淬灭分子Q所吸收和淬灭。 b) 聚合酶的外切核酸酶活性通过水解方式将报告染料与淬灭分子相分离导致了荧光信号的增加。 在每个扩增循环由于切开了探针因此实时设备探测到报告染料的增加。由于报告染料被切开，因此不能进行溶解曲线分析。双标记探针比内嵌染料有更高的特异性，这里有2个原因 。首先，双标记探针具有序列特异性，只结合到互补区。第二个原因是双标记探针对每扩增的一个拷贝只释放一个分子的荧光染料。由于双标记探针增加了特异性，这种探测方法很适合检测低拷贝数的模板。2．3．FRET 探针 FRET 探针依靠荧光能量从一个荧光染料到另一个的传递。两个独立的特异寡核苷酸序列都标记上荧光基团。上游探针在3‘末端有一个供体基团，下游探针在5‘末有一受体基团。设计探针时他们在与目标序列结合时互相临近，使供体和受体荧光基团紧密接近。一旦探针杂交到模板上，从供体到受体荧光基团的能量传递产生了一个不同波长的荧光信号。供体荧光信号的减弱和受体荧光信号的加强都能分别监测到。因此，只有当两个探针都结合上去才能检测到荧光信号。FRET 探针可以进行溶解曲线分析，对基因型分析，SNP检测和其他突变检测非常有用。 a) 扩增循环中，两个探针与靶DNA退火 b) 供体被外部光源激发通过能量传递导致发射荧光的产生。

  • 实时超分辨率显微成像系统特点介绍

    [url=http://www.f-lab.cn/microscopes-system/storm.html][b]实时超分辨率显微成像系统[/b][/url]突破了光学显微镜的半波长分辨率极限,提供了比宽视场,共聚焦显微镜更好分辨率。实时超分辨率显微成像系统采用尼康或奥林巴斯显微镜，Chroma 滤波片,Andor公司EMCCD相机以及独特的照明系统，为客户提供全球同步的超分辨率成像系统。[img=实时超分辨率显微成像系统]http://www.f-lab.cn/Upload/storm-2.JPG[/img][b]实时超分辨率显微成像系统特点[/b]横向分辨率可达20nm,轴向分辨率可达40nm实时和线下图像重建GPU加速处理图像先进的自动聚焦硬件高分辨率X-Y-Z工作台灵活的配置[img=实时超分辨率显微成像系统]http://www.f-lab.cn/Upload/storm-1.JPG[/img]实时超分辨率显微成像系统：[url]http://www.f-lab.cn/microscopes-system/storm.html[/url]

  • 光谱定量分析中系统误差产生的来源有那些？

    光谱定量分析中系统误差产生的来源有那些？A、标准样品与分析样品性质不相同的结果B、第三元素的影响 C、光源发生器工作条件的变化未察觉D、偶然误差带来的影响E、电压来回波动不稳定F、氩气不纯G、表面处理有污染H、激发点单一区域

  • 实时定量PCR应用中的问题及优化方案【2】

    实时定量PCR应用中的问题及优化方案荧光材料新进展为了满足实时PCR更高敏感性要求，各试剂公司都致力于开发新型的化学发光材料，目前作为商业用途的这些化学物质都能适用于上述的各种仪器。它们主要有以下几种：1. 水解探针或Taqman探针：这种探针用于Taqman分析法，它能被DNA合成酶(例如Taq酶)的5’à3’活性所降解，探针的5’端有一荧光报告基团，3’端有一荧光淬灭基团，当两个基团相互先靠近的时候，由于发生能量传递作用，报告基团不能发出荧光，但随着扩增反应的进行，5’端的报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭发生能量传递作用，从而能发出荧光，被信号探测器所捕获。常同探针5’端相结合的基团有FAM（6－羧基荧光素）,TET（四氯－6－羧基荧光素）,JOE（2，7－二甲基－4，5－二氯－6－羧基荧光素），HEX（六氯－6－甲基荧光素）或VIC，常与3’端相结合的荧光淬灭基团常为TAMRA (6- 羧基四甲基若丹明)或DABCYL（4-（4’-恶烷氨基苯偶氮）苯甲酸）。相较之于TAMRA，使用DABCYL可以更有效的减少自发荧光信号。目前，水解探针已被用于基因检测、病毒定量、癌细胞基因微突变检测、细胞因子基因定量等，其结果都具有高特异性与高敏感性。2. 分子信标: 是一种单链DNA形成的发夹结构，在其一端有一报告基团，在另一端有一淬灭基团，当它形成发夹结构时，由于荧光报告基团与淬灭基团想互靠近，两者之间发生荧光信号能量共振转移（fluorescent resonance energy transfer FRET），当热循环温度达到分子beacon的解链温度时，其构象发生改变，能与模板结合而完全伸展成线性分子，使得FRET消失，报告基团发出荧光信号。分子信标特别适用于检测点突变，这能区分只有一个核苷酸差异的不同DNA序列，而且其敏感性要远比同等长度的寡核苷酸探针高，分子beacon已被用于突变检测、病原体定量、病毒检测和胚胎的性别判断，它同时出用于多重PCR检测逆转录病毒。3. scorpions: 它由两个寡核苷酸分子组成，一个是引物，另一个是带荧光分子的探针，但是此探针也具有引物的功能。引物与形成发夹结构的探针相连，在探针上由于荧光报告基团与淬灭基团相互靠近，不能发射荧光。在反应的变性阶段，探针的发夹结构会解开，构象发生改变，在退火时则与模板相结合，形成线性分子，报告基团同淬灭基团分离而发射荧光。同Taqman探针和分子beacon相比，scorpion能更快地发射出荧光且信号更为强烈，其特异性也很高，因为只有在反应体系中存在特异的目的基因，探针-引物才会与之相结合。Scorpion是一种较新的荧光材料，具有良好的应用前景。4. 杂交探针：该材料使用四个寡聚核苷酸分子，两个引物与两个探针，杂交探针分别单标，一个携带荧光供体基团，一个携带荧光受体基团，当这两个探针杂交到目的基因上时，能形成首尾相连的结构使两个荧光基团相互靠近，发生FRET。受体基团能转移能量，使得供体基团在不同波长条件下被激发，发射出的荧光量直接与目的基因的产量成相关关系。这一方法已被Roche公司生产的Lightcycler所应用，进行病原体检测、病毒荷载量的测定等领域。5. SYBR Green I: 这是一种DNA结合染料，能非特异地掺入到双链DNA中去。在游离状态下，它不发出荧光，但一旦结合到双链DNA中以后，便可以发出荧光。它的最大优点就是可以与任意引物、模板相配合，用于任意反应体系中，从经济角度考虑，它也比其它的探针的价格要便宜得多，但由于它能与所有的双链DNA结合，所以一旦反应体系中出现非特异扩增，那它就会影响到定量结果的可靠性与重复性。要避免这种不利因素，一方面可以通过Lightcycler和Rotor gene、Smart gene等热循环仪内设定的程序过对扩增曲线进行分析，以区分由PCR产物和本底造成的荧光信号，另一方面就是选择良好的引物和探针并优化反应条件以消除非特异性影响。

  • PikoReal荧光定量PCR仪

    PikoReal设计小巧，反应速度快，灵敏度高。具有绝对定量，相对定量，溶解曲线分析，等位基因检测分析功能，是一款性能优越，并能成倍节省实验成本的高性价比荧光定量PCR系统。整体式设计，系统稳定可靠　　PikoReal 五通道实时荧光定量PCR仪；光学检测系统和PCR系统高度整合，几乎没有移动部件。仪器长途运输或搬动也不会导致光路系统偏移，无需光路校正。　　PCR系统快速高效；　　超快的反应速度能成倍节省实验时间。独特的设计能使反应体系小到5ul，节省试剂，耗材和能源消耗。

  • 实时气象自动监测系统小型气象传感器

    实时气象自动监测系统小型气象传感器

    实时气象自动监测系统小型气象传感器常见的气象站监测设备是实时气象自动监测系统，可分为多参数或六参数、五参数、四参数等。这种类型的气象站一般都是监测空气温度、空气湿度、风向风速、降水、大气压力、地面温度、太阳辐射类、能见度、云高、天气现象、闪电定位、大气电场、负氧离子、蒸发、冻土观测等一些要素，数据的业务处理完全符合气象观测的要求，是基本气象站和一般气象站地面气象观测的标准设备。实时气象自动监测系统常用到的监测设备有气压计、雨量计、风速计、风向标、百叶箱、风向风速计、干湿球温度表、温湿计、雨量计、蒸发皿、日照计、地温表。实时气象自动监测系统就是指在某个地域依据必须，基本建设的可以全自动检测好几个因素，不用人工控制，就能全自动转化成报文格式，定时执行向中心站传送检测统计数据的气象站，是填补室内空间地区上气候检测统计数据空白页的关键。 [img=实时气象自动监测系统,400,400]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/07/202207080913585033_928_4136176_3.jpg!w690x690.jpg[/img]实时气象自动监测系统由气象传感器、微电脑气象数据采集仪、电源、通风罩、全天候防护箱和气象观测支架、通讯模块等部分构成。能够用于对风速、风向、雨量、空气温度、空气湿度、光照强度、太阳辐射、土壤温度、土壤湿度、蒸发量、大气压力等十几个气象要素进行全天候现场监测。可以通过专业配套的数据采集通讯线与计算机进行连接，将数据传输到气象计算机气象数据库中，用于统计分析和处理各项数据。 实时气象自动监测系统湿度检测范围：0～99.9%RH，度：±3%RH（T0℃），±5%RH（T≤0℃），像素：01%；光谱仪范畴：300～1100nm硬件配置和手机均选用控制模块组合型开放式设计方案，可灵便组成应用。 实时气象自动监测系统设计实施《气象仪器及观测指南》气象组织仪器和观测会《QX/T 61-2007地面气象观测规范》 《QX/T-2000Ⅱ 自动气象站行业》[img=实时气象自动监测系统,400,400]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/07/202207080914165957_8137_4136176_3.jpg!w690x690.jpg[/img]

  • 【求助】荧光定量PCR与全自动微生物鉴定仪的不同

    请问不同点在哪里？高通量实时荧光定量PCR系统：瑞士，Roche，型号是Ligtcler 480全自动荧光法微生物鉴定药敏分析系统：英国，SENSITITRE，型号是ARIS是不是前者可用于致病菌，微生物的定性定量检测，而后者只能是定性的筛选快速检测啊？并且想具体问下PCR如何用于致病菌、转基因食品的检测？大概原理，因为我本身不是读这个专业的，单位决定买这两台仪器，但是单位派我去开个什么购买仪器专家听证会之类的，所以想问问，因为资料上我看得不是很明白

  • 【资料】“二恶英”实时在线检测系统介绍

    【资料】“二恶英”实时在线检测系统介绍

    近年来，国内垃圾焚烧处理产业正在兴起，并发展壮大。为防止垃圾焚烧电厂对环境产生二次污染，国家制订了相关的垃圾焚烧排放控制标准GWKB3-2000，于2001年6月正式实施，对炉渣、飞灰、烟气都有明确的控制指标和相应的管理方法，但对排放烟气中的微量二恶英的实时监控还没有一个行之有效的良策。如何监控垃圾焚烧系统排出的二恶英类物质，即时控制和消除二恶英类物质对环境的污染，已成为政府环境保护的一大重要课题，迅速且连续地测定二恶英类物质的需求日益迫切。 从国外引进的“二恶英”实时在线检测系统是世界上首次推出的利用极微量实时检测技术来检测垃圾焚烧设备中二恶英的含量的仪器，它可以连续检测垃圾焚烧系统所排出烟气中含有的生成二恶英类物质的重要中间体—氯苯酚的含量，从而可以判断出烟气中的二恶英类物质的含量。利用它可以实时连续地检测排放的烟气，能够把握每一时刻的垃圾焚烧系统和烟气处理系统的运行状态。[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2009/04/200904042115_142527_1615922_3.jpg[/img]

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