植物气孔计

人们面对病毒入侵，会通过佩戴口罩进行有效抵御。同样，植物也会通过调节气孔的开放和关闭来抵抗病原入侵。气孔关闭可减少水分流失并限制病原体进入，然而长时间关闭气孔，会导致植物光合作用以及蒸腾作用的减弱，水分的过度积累甚至会促进植物体内病原体的定殖。所以，植物其实也是需要在合适的时间“摘掉口罩”。那么，植物是如何动态调节气孔关闭和开放的？其背后的分子机理仍不清楚。今年5月，美国德州农工大学何平教授、单立波教授与山东建筑大学侯书国教授在Nature主刊合作发表了相关研究，发现了一类新的调控免疫和水分流失的分泌小肽SCREWs，阐明了SCREWs参与植物重新打开气孔的分子机制。这也是山东建筑大学首篇Nature主刊文章。植物基因里编码数以千计的小肽，而其中多数小肽的功能仍是未知的。一些小肽是植物免疫的细胞因子，被驻扎在细胞表面的受体激酶所感知。作者首先分析了拟南芥小肽合成基因的转录组学，发现受细菌鞭毛蛋白刺激时，一些小肽的合成会明显提高，并且这些小肽具有保守的C端（图1）。用这些小肽处理种苗后，发现小肽诱导激活了MAPKs（mitogen-activated protein kinases），及包括WRKY30，WRKY333，WRKY353和FRK1在内的多种PTI（pattern-triggered immunity）标志物的表达，并且证明了C端保守的两个半胱氨酸（CC）对诱导免疫反应十分重要。体内实验发现这些小肽直接决定了拟南芥是否易感染Pst DC3000（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000）。由此作者鉴定这些小肽为一类新的植物细胞因子，被命名为SCREWs（SMALL PHYTOCYTOKINES REGULATING DEFENSE AND WATER LOSS）。图1 细胞因子SCREWs的序列比对作者的下一步是找到SCREWs的受体。受体激酶，特别是LRR-RKs（leucine-rich repeat receptor kinases）是很多内源肽的受体。作者筛选了拟南芥的受体激酶，发现NUT（AT5G25930）介导了SCREWs诱导的免疫反应。为了确定NUT是不是SCREWs的直接受体，作者使用Biacore T200，通过把NUT胞外域固定在CM5芯片上，SCREWs作为分析物流过芯片，检测得到SCREW1与NUT的亲和力达到12.95μM，SCREW2与NUT的亲和力达到6.23μM（图2）。图2 Biacore鉴定SCREWs的受体NUT（pH 7.5）为了更加接近体内的环境，作者同样使用Biacore方法检测了pH5.7条件下SCREWs与NUT的亲和力，发现在非原质体的pH条件下，SCREWs与NUT的亲和力基本一致（图3）。图3 Biacore检测非原质体酸碱条件（pH 5.7）下SCREWs与NUT亲和力前面提到，SCERWs羧基端的保守半胱氨酸对诱导免疫十分重要，这里作者同样用Biacore做了体外实验的验证，结果发现保守区域半胱氨酸的突变会使SCREWs与NUT的亲和力显著降低（图4）。由此，藉由Biacore完整、可靠的实验结果，作者确定了NUT就是SCREWs的受体。图4 关键氨基酸的突变使SCREWs与NUT的亲和力显著降低很多LRR-PKs的受体都是BAK1和相关的SERKs，利用免疫沉淀实验发现SCREW会刺激NUT-BAK1复合物的产生后，作者同样使用Biacore检测SCREW2-NUT-BAK1三元的结合（图5）。同样把NUT胞外域固定在CM5芯片上，分析物则设置固定浓度的BAK1预混多浓度的SCREW2，并且检测NUT与单独BAK1的结合试验作为对照。结果发现，BAK1的存在显著提高了NUT和SCREW2的亲和力，达到了0.38μM。图5 Biacore检测SCREW2-NUT-BAK1三组分的结合除了调控免疫，作者还发现SCREW-NUT可以调控植物的水分流失。植物缺水时，ABA会促进气孔的关闭，调控植物的水分利用和耐旱性。作者发现，SCREW-NUT通过调控ABI（ABA INSENSITIVE）的磷酸化，导致ABI磷酸酶对OST1（OPEN STOMATA 1，一种介导ABA和MAMP诱导的气孔关闭的关键激酶）的活性增加，降低S型阴离子通道的活性，最终抑制气孔关闭。总结图6 文章整体研究思路综上所述，团队首次发现了植物应对病原体侵染或水分缺失时，会通过SCREWs-NUT来控制气孔的重新开放。SCREW-NUT系统广泛分布于双子叶和单子叶植物中，说明本研究在优化植物对非生物和生物胁迫的适应性方面有重要作用。Biacore作为分子互作的金标准，轻松应对信号通路的二元，三元体系研究，在研究植物生长发育和抗逆的信号通路，转录调控等方面，深受广大农业和植物科学家的信赖。Biacore可靠的实验数据，加上科学家创新又严谨的研究思路，定会加速我国科学家们在农业和植物领域的科研进展，巩固我们在此领域的领军地位。Biacore，for a better life参考文章：Liu, Z., Hou, S., Rodrigues, O. et al. Phytocytokine signalling reopens stomata in plant immunity and water loss. Nature 605, 332–339 (2022).

LI-600是一款同时测量气孔导度和脉冲调制式（PAM）叶绿素荧光的紧凑型仪器，它能够测量同一叶片的同一区域。LI-600设计的初衷是用于快速、精准调查环境条件下植物的蒸腾、光合变化，为科学家提供野外调查植物生理相关参数的变化情况。仪器可以在参数稳定时自动记录测量值，也可通过按钮手动测量。主要特点快速调查使用方便● USB—充电数据下载● 日光下清晰可见的显示屏，显示仪器的状态，实时读数，以及最近的测量结果● 条形码扫描器直接读取样品信息，减少手工错误● 内置可充电电池，持续工作8小时以上● 人体工程学设计及轻巧的外观，方便握持● 几秒钟即完成测量持续测量数据可靠● 红外温度传感器可快速准确测量叶片温度● 内置光量子传感器记录叶片附近环境的光合有效辐射● 自动，或手动匹配相对湿度传感器确保测量真实的差值● 柔软的垫圈材料贴合叶片，以尽量减少扩散和大流量泄漏● 自动漏气检测，确保准确测量孔径内叶表面技术参数 测量时间： 气孔导度：典型5~15S，取决于物种、叶片表面特性，以及叶片健康状况 叶绿素荧光：1s 工作环境： 温度：0~50℃ 气压：50-110kPa 湿度：0~85%RH，无冷凝 重量： 0.68kg（仅气孔计）；0.73kg（含荧光仪） 尺寸： 32.4 cm x 16.9 cm x 6.2 cm (L x W x H) 显示： 尺寸：对角线6.8cm 分辨率：400 × 240 像素；单色，日光下可读 键盘： 5键 电池： 内置锂电池 工作时长：典型8小时 电池容量：5200mAh 充电时间：典型3.5小时，Qualcomm Quick Charge™ 2.0 或 3.0可2小时快充 数据存储容量： 128MB USB技术参数： 通讯及充电接口：Micro-USB Qualcomm Quick Charge™ 2.0或3.0快充 通用充电适配器： 输入：90~264VAC； 50~60Hz 输出：5VDC；1Amp 配置软件： Windows 及 MacOS应用程序 数据文件： 与任何电子表格应用程序或数据分析程序兼容的纯文本数据，输出：csv格式 条码扫描器： 1D和2D CODE 39,COD 128 PDF417 100% UPC 数据矩阵；二维码 光合有效辐射测量： 单位：光量子通量密度（PPFD）；μmol m-2 s-1 校准准确度：读数的±10%，NIST可追溯， 余弦校正：余弦校正至60°入射角 气孔导度测量测量孔：0.75cm直径流速：低75μmol/s, 中100μmol/s,高150μmol/s相对湿度传感器准确度：±2%参考温度：±0.2℃叶片温度传感器准确度：±0.5℃进气流速测量：读值的±1%@75~150μmol/s出气流速测量：全量程的±5%，上限150μmol/s测量参数气孔导度gsw（mol m-2 s-1）；边界层导度gbw（mol m-2 s-1）；总导度gtw（mol m-2 s-1）；蒸腾速率 E（mol m-2 s-1）叶室水汽压VPcham（kPa）；参考水汽压VPref（kPa）；叶片水汽压VPleaf（kPa）；饱和水汽压亏缺 VPDleaf（kPa）参考腔室水汽浓度H2Oref（mmol/mol） 样品腔室水汽浓度H2Osamp （mmol/mol） 叶片水汽浓度H2Oleaf（mmol/mol）荧光计技术参数饱和闪光类型：矩形饱和闪光和多相饱和闪光（MPF）测量光峰值波长：625nm峰值光强：0-10000μmol m-2 s-1饱和闪光强度：0-7500μmol m-2 s-1LED风险组：符合IEC 62471:2006的豁免组。LED不会造成任何光生物危害可获取参数Fo 暗适应下最小荧光信号值Fm 暗适应下最大荧光信号值Fv/Fm 潜在最大光化学量子效率F 实时荧光信号值Fs 光下稳态荧光信号值Fo’光下最小荧光信号值Fm’ 光下最大荧光信号值φPSII 实际光化学量子效率ETR 电子传递速率Fv’/Fm’ 既定光强下光系统II最大光化学量子效率Fq’/Fv’ 即qP，光化学淬灭系数NPQ 非光化学淬灭qN非光化学淬灭系数qE非光化学淬灭快相组分qI非光化学淬灭中光抑制淬灭组分qL光系统ll反应中心开放比例（湖泊模型）可选配置PF型气孔-荧光仪 P型气孔计(日后可以加配600-01F 荧光仪升级套装，成为PF型)产地与厂家:美国LI-COR公司创新点：LI-600是一款同时测量气孔导度和脉冲调制式（PAM）叶绿素荧光的紧凑型仪器，它能够测量同一叶片的同一区域。LI-600设计的初衷是用于快速、精准调查环境条件下植物的蒸腾、光合变化，为科学家提供野外调查植物生理相关参数的变化情况。仪器可以在参数稳定时自动记录测量值，也可通过按钮手动测量。LI-600 气孔-荧光速测仪

MST案例汇总 植物生长会受到各种复杂多变的逆境条件胁迫，包括干旱、盐碱和低温等。在长期的系统发育过程中，植物也逐渐形成适应、抵抗和忍耐的抗逆性，植物抗逆性机制为当前研究的热点，今天小编带大家来了解一下，微量热泳动（MicroScale Thermophoresis, MST）互作技术在植物适应逆境的机制研究的应用。01高温胁迫_蛋白&蛋白互作Chen, Si‐Ting, et al. "Identification of core subunits of photosystem II as action sites of HSP 21, which is activated by the GUN 5‐mediated retrograde pathway in Arabidopsis." The Plant Journal 89.6 (2017): 1106-1118.前人研究发现位于叶绿体的热休克蛋白21（HSP21）能够保护光系统II复合体 (PSII)，使其免受细胞内热和氧化应激，但其作用的分子机制尚不清楚。中科院植物生理生态研究所郭房庆研究团队发现，热应激下拟南芥HSP21被GUN5依赖的逆向信号通路激活，并直接结合其核心亚基D1和D2蛋白来稳定PSII。 组成性表达HSP21可以恢复热胁迫下PSII 的热敏稳定性和gun5突变体的功能缺失，表明HSP21是热胁迫条件下维持类囊体膜系统完整性的关键伴侣蛋白。研究人员借助MST技术直接在接近天然状态下的裂解液中检测了HSP21蛋白与PS II核心亚基D1和D2蛋白之间的亲和力。图注：MST技术检测HSP21和植物裂解液中D1/D2结合植物内某些蛋白较难纯化或者纯化后活性受影响，利用MST技术，可直接在植物裂解液内进行亲和力检测，无需纯化。在本次实验中，作者裂解表达35S::D1-eYFP或35S::D2-eYFP的转基因植物，直接向裂解液中加入梯度稀释的纯化HSP21蛋白，检测得到HSP21与D1/D2的亲和力Kd分别为0.67μM和1.32μM.02低温胁迫_蛋白&离子Ding, Yanglin, et al. "CPK28-NLP7 module integrates cold-induced Ca2+ signal and transcriptional reprogramming in Arabidopsis." Science Advances 8.26 (2022): eabn7901.寒冷的环境中会触发植物细胞质Ca2+的激增，导致植物的转录重编程。然而，Ca2+信号是如何被感知和传递到下游的低温信号通路仍然是未知的。中国农业大学杨淑华课题组研究发现，钙依赖性蛋白激酶28 (CPK28)启动了一个磷酸化级联，从而作用于低温诱导Ca2+信号下游的转录重编程。这项研究阐明了一种先前未知的机制，揭示了植物从质膜到细胞核的快速感知和转导低温信号的关键策略。研究中，作者通过MST实验检测到CPK28可直接与Ca2+结合。CPK28 EF-hand位点突变蛋白CPK28EFm与Ca2+亲和力降低了6倍，证明了EF-hand对结合Ca2+非常重要。图示：MST技术检测CPK28/CPK28EFm与Ca2+的亲和力03淹水胁迫_蛋白&离子Lehmann, Julian, et al. "Acidosis-induced activation of anion channel SLAH3 in the flooding-related stress response of Arabidopsis." Current Biology 31.16 (2021): 3575-3585.淹水胁迫导致厌氧菌引发的胞质酸中毒，使植物细胞感知酸性并通过膜去极化传递这种信号的分子机制尚不清晰。德国维尔茨堡大学研究表明，拟南芥根中酸中毒诱导的阴离子流出依赖于阴离子通道AtSLAH3，细胞质子浓度的增加使SLAH3从无功能二聚体转变为活性单体形式，激活了阴离子通道。研究发现硝酸盐对于pH依赖的通道激活至关重要，并通过MST技术研究SLAH3与NO3-的结合。图示：(左) 淹水相关胁迫响应中酸中毒诱导的阴离子通道SLAH3的激活(右) MST技术检测不同PH下SLAH3与NO3-亲和力作者表达SLAH3-GFP融合蛋白作为荧光信号源，无需其他标记。在pH6.5下检测到SLAH3与NO3-相互作用的Kd为120±50 mM。在pH为7.3时，SLAH3仍与NO3-结合，但亲和力降低了60%，表明SLAH3与阴离子的结合依赖于pH。04干旱胁迫_蛋白和磷脂分子Yang, Yongqing, et al. "Phosphatidylinositol 3-phosphate regulates SCAB1-mediated F-actin reorganization during stomatal closure in Arabidopsis."The Plant Cell 34.1 (2022): 477-494.为了应对干旱胁迫，植物关闭气孔以减少叶片蒸腾水分的损失。气孔运动受信号分子磷脂酰肌醇三磷酸(PI3P)的调控。然而，这一过程的分子机制尚不清楚。中国农业大学郭岩研究组研究表明，拟南芥气孔关闭过程中，PI3P通过与植物特异性肌动蛋白结合蛋白 (SCAB1) 结合，抑制其寡聚，从而调节气孔关闭期间保卫细胞中F-肌动蛋白稳定性和重排。为了检测SCAB1蛋白是否可与PI3P结合，作者进行MST实验，结果显示二者具有非常强的亲和力，解离常数Kd为4.5±0.09 pmol。为了确定具体结合位点，作者将PI3P motifs RXLR-dEER进行突变，MST结果显示，三重突变蛋白不能与PI3P结合。综合其他实验，最终证明，SCAB1的4个RXLR motifs均具有PI3P结合能力，且至少需要2个RXLR才能与PI3P结合。图示：MST检测SCAB1与PI3P的亲和力05氧化胁迫_蛋白&离子Zhou, Xin-Tong, et al. "Ectopic expression of SsPETE2, a plastocyanin from Suaeda salsa, improves plant tolerance to oxidative stress." Plant science 268 (2018): 1-10.质体蓝素（Plastocyanin）是一种I型含铜蛋白，存在于叶绿体类囊体中，越来越多的证据表明，植物质体蓝素参与了铜的稳态调节，但其生理相关性仍不明确。中科院微生物所夏桂先和仲乃琴团队发现了一个来自盐生碱蓬的质体蓝素基因(SsPETE2)具有抗氧化功能，该基因与铜螯合活性有关。作者通过MST实验发现SsPETE2可与铜离子结合，进而缓解H2O2的形成。此外，与过表达AtPETEs的植物相比，表达SsPETE2的植物对氧化胁迫表现出更强的耐受性，MST结果显示，SsPETE2比AtPETEs具有更强的铜结合活性。图示：MST检测SsPETE2、AtPETE1和AtPETE2与Cu2+的亲和力。总 结 在抗逆机制研究中，常常涉及到蛋白和小分子，甚至是与离子的互作。MST技术在进行互作亲和力检测时，不依赖于分子量的变化，因此，即使是几十个道尔顿的离子和蛋白的亲和力也可以轻松胜任。此外，MST亲和力检测范围宽（pM-mM），可研究不同强度亲和力的互作，是植物抗逆研究中的一件利器。新品Monolith X分子互作检测仪-即将面世点击图片-参与新品发布会