色谱整体柱

伴随着Merck公司第二代硅胶基质整体化色谱柱的问世，除亚2微米和核壳微粒色谱柱外，液相色谱分析又多了一个高效、高通量色谱柱的选择，且相比颗粒柱，压力更低，抗污染能力更强。有关第二代硅胶整体化色谱柱的制备过程，第一代、第二代整体化色谱柱的对比，以及硅胶基质整体色谱柱未来的展望，默克公司都有详细的阐述，欢迎来函、来电索取！http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/05/201205081321_365600_2491887_3.jpg

==整体柱是个啥呢？==http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/10/201010192337_252346_1600062_3.jpg所谓整体柱,又称为棒状柱、连续床层、无术塞术，是一种用有机或无机聚合方法在色谱柱内进行原位聚合的连续床固定相 这种色谱柱制备方法简单 由于使用了聚合方法可以往固定相中引入各种可能的作用基团 有十分多变的灵活性 同时用原位聚合制得的整体色谱柱要比常规装填的色谱柱具有更好的多孔性和渗透性 具有灌注色谱的特点 即色谱柱中既有流动相的流通孔又有便于溶质进行传质的中孔（几十个纳米）因而可以对生物大分子进行快速分离 而且色谱柱的稳定性很好 在毛细管电色谱中使用整体色谱柱可以避免了塞子的制作难题 并排除了由塞子产生气泡的烦恼。---来自百科你了解整体柱吗？大家来谈谈整体柱吧！

[align=center][font=宋体][font=宋体]色谱仪故障诊断的注意事项[/font] [font=宋体]—— 色谱图的整体考察[/font][/font][/align][align=center][font='Times New Roman'][font=宋体]概述[/font][/font][/align][font=宋体]当色谱峰分析中出现色谱峰形不良故障时，建议首先做全图考察，抓住整体谱图的特点，在进行分析和诊断。[/font][align=center][font=宋体]简介[/font][/align][font=宋体][font=宋体]色谱工作者在日常工作中经常会遇到色谱图谱发生不良的故障，例如基线不良、色谱峰拖尾、前伸、分叉、峰宽增大，峰高降低甚至不出峰等，处置这些故障时，我们一般可以检索书籍资料或者互联网，可以得出常规的故障对照表形式的解决方案，如图[/font][font=Times New Roman]1[/font][font=宋体]所示。[/font][/font][align=center][img=,234,164]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/10/202310052218544146_7015_1604036_3.jpg!w690x481.jpg[/img][font='Times New Roman'] [/font][/align][align=center][font=宋体][font=宋体]图[/font][font=Calibri]1 [/font][font=宋体]常见的故障对照表[/font][/font][/align][font=宋体]故障对照表对于色谱初学者帮助较大，结合色谱基本原理，可以较快的给出初步故障诊断和解决方法。但是建议具有一定经验的色谱工作者，在面对出现故障的色谱图时，应当首先对色谱图作出全面的考察，并且结合样品和色谱进样方式的特点给出初步判定，可以迅速的缩小故障诊断范围，提高解决问题的效率，建议考虑以下几点，故障的周期性，故障与保留时间的关系，故障的统一性：[/font][font=宋体]一． [/font][font=宋体]谱图的故障现象是否存在明显的周期性[/font][font=宋体][font=宋体]当出现基线稳定性不良故障时，首先考虑整体谱图中，色谱图基线是否存在周期性的扰动或者毛刺类型的干扰，有可能表现为正弦波、三角波、或周期性脉冲，如图[/font][font=Times New Roman]2[/font][font=宋体]所示。[/font][/font][align=center][img=,184,88]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/10/202310052219026325_663_1604036_3.jpg!w690x328.jpg[/img][font=Calibri] [/font][/align][align=center][font=宋体][font=宋体]图[/font][font=Calibri]2 [/font][font=宋体]周期性较强的基线[/font][/font][/align][font=宋体]故障现象的周期性，不仅仅表现在色谱图在时间维度上出现的周期性变化，还表现在色谱信号强度，尤其是色谱峰高的强度的周期性变化。[/font][font=宋体]存在周期性变化的色谱图，一般情况下与色谱外围环境存在周期性变化有关，建议色谱工作者仔细考察色谱仪的工作环境。其次考虑色谱仪的温度、流动相控制系统是否存在故障。[/font][font=宋体]例如实验室的空调，可能会造成色谱仪工作环境温度发生周期性变化；配合[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp][color=#3333ff]气相色谱仪[/color][/url]工作的气体发生器可能发生输出流量不稳定的故障；色谱仪供电线路中存在周期性工作的电气设备对色谱仪产生周期性的电气干扰。[/font][font=宋体]首先考虑故障周期的时间长短，予以初步诊断。一般情况下，来自温度、或者色谱仪气源不稳定的故障，故障出现的周期时间长度较长，一般大于几分钟。来自色谱仪内部控制异常发生的故障，一般周期时间长度较短。[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp][color=#3333ff]气相色谱仪[/color][/url]柱温箱温度控制异常时，基线扰动周期较短，载气或辅助气源不稳定造成的基线扰动周期时间长度较长。[/font][font=宋体][font=宋体]可以考察色谱仪某个工作参数是否影响故障周期性的方法，进一步缩小故障诊断的范围。例如某台安装有[/font][font=Times New Roman]FID[/font][font=宋体][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp][color=#3333ff]气相色谱仪[/color][/url]在恒温状态下，基线呈现为周期性较强的三角波状态，修改其空气流速后，发现基线变化周期随之发生改变，那么基本可以确认为空气发生器故障。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]二[/font] [font=宋体]谱图的故障，是否与保留时间相关。[/font][/font][font=宋体]常见的情况下，对于某项恒温状态下的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp][color=#3333ff]气相色谱[/color][/url]分析，保留时间较短的色谱峰宽度较低，保留时间较宽的色谱峰宽度逐渐变大。程序升温状态下，保留时间较长的色谱峰宽度也存在逐渐变宽的趋势，但是变宽的趋势不太明显。一般情况下保留时间的对称性与保留时间关系不大。[/font][font=宋体][font=宋体]如果色谱图中出现保留时间较弱的组分色谱峰形状较差（例如峰宽增大、拖尾严重、分叉、峰顶部不尖锐），保留时间较长的组分色谱峰形状正常的情况，如图[/font][font=Times New Roman]3[/font][font=宋体]所示。色谱工作者需要重点考察进样部分——例如进样方式、进样口问题或者溶剂不良等，故障来自色谱柱和检测器的可能性较小（当然不能完全排除来自色谱柱和检测器的原因）。[/font][/font][align=center][img=,315,63]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/10/202310052219098919_2375_1604036_3.jpg!w690x128.jpg[/img][font=Calibri] [/font][/align][align=center][font=宋体][font=宋体]图[/font][font=Calibri]3 [/font][font=宋体]不良谱图[/font][/font][/align][font=宋体]例如顶空进样时，采用了进样速度较低的小分流比或者不分流进样方式；进样口污染或者进样口衬管惰性较差；样品溶剂选择不良；或不分流进样时柱温程序选择不良都可能导致类似的故障出现。[/font][font=宋体][font=宋体]如果保留时间较短的组分出峰正常，保留时间较长的组分出峰异常[/font][font=宋体]——例如响应较低或不出峰、拖尾或者前伸严重，那么故障来自色谱柱的可能性较大。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]此类故障的判定依据基于色谱峰的聚焦现象[/font][font=宋体]——组分在色谱柱内运行时，组分的后端的分子总是在已经分配有前端分子的固定相中发生分配，那么运行速度就比前端分子运行速度快，该组分在色谱柱内的分布宽度会逐渐减小。[/font][/font][font=宋体]在不良的进样方式或者不良进样口状态下，组分以分布较宽、分布状态不均匀的状态下进入色谱柱，保留时间较长的组分由于经过长时间的聚焦，最终的色谱峰形状相对比较对称，而保留时间短的组分由于聚焦不足，造成峰形状较差。[/font][font=宋体][font=宋体]三[/font] [font=宋体]谱图故障是否具有统一性[/font][/font][font=宋体][font=宋体]当出现色谱峰分叉、或目标组分灵敏度较低、重复性不良等故障发生时，需要注意整体色谱图中的其他色谱峰[/font][font=宋体]——例如溶剂峰、杂质峰——是否存在相同的情况。[/font][/font][font=宋体]例如待测组分的重复性不良，但溶剂或者该样品中杂质重复性良好，那么色谱工作者就不用去怀疑色谱系统的硬件存在故障。建议考虑样品或者与样品有关部位的问题，例如进样器、样品瓶、进样口或样品自身是否不稳定。[/font][font=宋体]如果某些待测组分灵敏度下降，而其他组分灵敏度正常时，那么色谱工作者就不用去怀疑检测器是否存在故障。建议考虑是否色谱系统惰性变差，或者样品存在不稳定问题。[/font][font=宋体]如果[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]分析中出现待测组分色谱峰出现分叉，需要考察色谱图中的其他色谱峰是否存在相同的分叉现象。如果有，那么重点怀疑色谱柱；如果没有，重点怀疑分析方法或者样品不良。[/font][font=宋体] [/font][font=Calibri] [/font][font=Calibri] [/font]

[align=center][font=宋体][font=宋体]色谱图整体考察[/font] [font=宋体]—— 异常色谱峰的峰宽考察[/font][/font][/align][align=center][font='Times New Roman'][font=宋体]概述[/font][/font][/align][font=宋体]谱图综合考察中，需要考虑整体色谱图中某个或者某些异常色谱峰的峰宽问题。[/font][align=center][font=宋体]简介[/font][/align][font=宋体]色谱工作者在诊断和维修色谱峰宽度异常的故障时，需要对色谱图进行整体考察，确定故障的来源。[/font][font=宋体][font=宋体][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp][color=#3333ff]气相色谱仪[/color][/url]的恒温分析或者[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱仪[/color][/url]的等强度洗脱条件下，色谱图中色谱峰的峰宽一般会随着保留时间的延长而增加，如图[/font][font=Times New Roman]1[/font][font=宋体]所示。[/font][/font][align=center][img=,302,120]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/10/202310170746106527_5962_1604036_3.jpg!w473x187.jpg[/img][font='Times New Roman'] [/font][/align][align=center][font=宋体][font=宋体]图[/font][font=Times New Roman]1 [/font][font=宋体]峰宽增加[/font][/font][/align][font=宋体][font=宋体][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp][color=#3333ff]气相色谱仪[/color][/url]的程序升温分析或者[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱仪[/color][/url]的梯度洗脱条件下，色谱图中色谱峰宽度一般变化不大，如图[/font][font=Times New Roman]2[/font][font=宋体]所示（较多的情况下，色谱峰宽度也存在一定程度的缓慢增加，当不如恒温分析或等强度分析条件下峰宽增加的现象更显著）。[/font][/font][align=center][img=,302,162]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/10/202310170746170153_6572_1604036_3.jpg!w690x368.jpg[/img][font=宋体] [/font][/align][align=center][font=宋体][font=宋体]图[/font][font=Times New Roman]2 [/font][font=宋体]峰宽变化不大[/font][/font][/align][font=宋体][font=宋体]如果在连续出现的宽度相似色谱峰中出现宽度异常增大的情况，如图[/font][font=Times New Roman]3[/font][font=宋体]所示，那么需要首先考察该色谱峰强度，在纯度分析中（即主峰峰高较高）经常出现类似情况。[/font][/font][font=宋体]此外需要考虑是否该异常色谱峰是否为色谱柱内滞留的杂质或者上次进行未流出的组分，需要实验是否需要增加多次进样之间的时间间隔。[/font][align=center][img=,189,148]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/10/202310170746227236_9957_1604036_3.jpg!w690x538.jpg[/img][font='Times New Roman'] [/font][/align][align=center][font=宋体][font=宋体]图[/font][font=Times New Roman]3 [/font][font=宋体]色谱峰变宽[/font][/font][/align][align=center][img=,302,220]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/10/202310170746280162_3591_1604036_3.jpg!w454x356.jpg[/img][font=Calibri] [/font][/align][align=center][font=宋体][font=宋体]图[/font][font=Calibri]4 [/font][font=宋体]纯度分析色谱图[/font][/font][/align][font=宋体][font=宋体]如果在连续出现的宽度相似色谱峰中出现宽度异常减小的情况，如图[/font][font=Times New Roman]5[/font][font=宋体]所示，需要考虑是否存在色谱分析程序、是否为固体颗粒或者其他电气信号的干扰。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]然后需要进一步考察，如果由于色谱程序（例如阀程序、流量程序）造成的较窄色谱峰的宽度要稍大些，与普通的保留时间较短色谱峰较为接近。而固体颗粒杂质造成的较窄色谱信号的宽度会更小，可能低于[/font][font=Times New Roman]1s[/font][font=宋体]。[/font][/font][align=center][img=,288,109]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/10/202310170746345404_9125_1604036_3.jpg!w660x250.jpg[/img][font='Times New Roman'] [/font][/align][align=center][font=宋体][font=宋体]图[/font][font=Times New Roman]5 [/font][font=宋体]色谱峰变窄[/font][/font][/align]

【网络讲座】：赛默飞色谱产品在农药残留分析领域的整体解决方案【讲座时间】：2016-11-15 10:00【主讲人】：吕建霞，女，博士，毕业于中国科学院生态环境研究中心，现就职于赛默飞世尔科技（中国）有限公司任气相色谱质谱产品应用工程师，自2007年毕业以来一直从事农药残留检测工作，在农药残留检测方面有着丰富经验。【会议简介】1、 基于农药数据库的600种农药筛查方法；2、 基于CSR大体积进样技术和GCNCIMS联用方法测定复杂基体中的农药残留；3、 基于CSR大体积进样技术和T-SIM功能测定各种基体中的农药多残留；4、 在线固相萃取-双梯度高效液相色谱测定中痕量水甲萘威和百菌清5、 在线固相萃取-高效液相色谱法快速测定柑桔原料及其成品中多菌灵的残留量； 6、 离子色谱和质谱联用测定草甘膦。-------------------------------------------------------------------------------1、报名条件：只要您是仪器网注册用户均可报名参加。2、报名参会：http://www.instrument.com.cn/webinar/meeting/meetingInsidePage/2117http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/10/201610181522_614348_2507958_3.jpg扫描二维码，报名参会4、报名及参会咨询：QQ群—290101720，扫码入群“色谱or食品”http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/01/201701191701_669288_2507958_3.gif

摘要：本文通过原位自由基聚合方式，以卟啉铁（[color=black]Hemin[/color]）和甲基丙烯酸缩水甘油酯（[color=black]GMA[/color][color=black]）[/color]作为二元单体，二甲基丙烯酸乙二醇酯（[color=black]EDMA[/color][color=black]）作为交联剂，[/color][color=black]1,4-[/color][color=black]丁二醇、聚乙二醇[/color][color=black]200[/color][color=black]和[/color][color=black]N,N-[/color][color=black]二甲基甲酰胺作为致孔剂，[/color]偶氮二异丁腈作为引发剂，经一锅法制备了聚（[color=black]Hemin-co-GMA-co-EDMA[/color][color=black]）整体柱。并通过扫描电子显微镜、压汞法、氮吸附法对其性能进行了表征。最后，将其作为高效液相色谱的固定相，对多种蛋白质样品进行了分离。结果表明基于卟啉铁的整体柱具有颗粒堆积的多孔结构，通透性好，柱背压低，对蛋白质具有良好的选择性。[/color]关键词：[color=black]卟啉铁；整体柱；蛋白质；高效液相色谱[/color][b]1　　绪论1.1　引言[/b]蛋白质是人体的物质基础，某些蛋白质的表达水平的改变与疾病直接相关。这就要求对这些蛋白质进行细致研究，而将其从复杂的生物基质中分离出来是首要任务。对蛋白质进行分离鉴定通常使用电泳—质谱、液相色谱—质谱联用技术，但这些方法并不能完全满足蛋白质大分子对操作环境和分析方法要求较高的要求，并且费用较高。聚合物整体柱由于具有较大孔径和良好的生物兼容性，其在蛋白质大分子分离中的应用已经展现了特有的优势。此外，聚合物单体种类繁多，且其表面的官能团可以有多种修饰方法，对不同的蛋白质具有不同的选择性，从而实现分离[sup][color=black][/color][/sup][color=black]。[/color][b]1.2　聚合物整体柱[/b]整体柱又称连续床层，是一种在色谱柱管内制备的连续床固定相[sup][color=black][/color][/sup][color=black]。整体柱比颗粒填充柱的通透性更好，更易于实现快速分离[/color][sup][color=black][/color][/sup][color=black]。整体柱分为无机硅胶整体柱、有机聚合物整体柱、有机无机杂化整体柱（一般是基于硅胶的杂化整体柱）。硅胶整体柱和有机无机杂化整体柱具有良好的稳定性和机械强度，通透性好，但溶胶凝胶技术制备周期长，操作复杂，重复性差[/color][sup][color=black] [/color][/sup][color=black]。有机聚合物整体柱制备简单、适用[/color][color=black]pH[/color][color=black]范围广（[/color][color=black]pH1-14[/color][color=black]）。[/color]聚合物整体柱出现在上世纪90年代初，继而在制备和应用中得到发展[sup][/sup]，至今已成功地用于分离科学，特别是用于分离生物大分子[sup][/sup]。多种多样的功能单体使整体柱设计变得更容易。聚合物整体柱适用范围广，已被用于不同的色谱模式，包括反相液相色谱（RPLC）、亲水相互作用色谱（HILIC）、离子交换色谱（IEC）等[sup][/sup]。多孔聚合物整体柱通常具有球形颗粒堆积结构，其大型通孔之间的聚合微球有利于显著提高聚合物整体柱的通透性，降低涡流扩散项，使其在高流速下能够有效地分离大分子。斯韦克系统地阐述了各种多孔聚合物整体柱的制备技术[sup][/sup]，例如，2,2,6,6-四甲基-1-哌啶（TEMPO）介导的活性自由基聚合。Kanamori等以二乙烯基苯为单体，合成了具有明确的连续形态，高的比表面积的大孔聚合物整体柱[sup][/sup]。除了传统的自由基聚合，Hosoya等[sup][/sup]报道了一种将环氧单体与二胺类开环聚合的高性能有机聚合物整体柱，在毛细管液相色谱上，其对苯的分离塔板高度（H）可以达到小于5μm。值得注意的是，相比链生长聚合（比如自由基聚合反应）产生的球状结构，逐步聚合方式导致整体柱具有完全不同的形态[sup][color=black][/color][/sup]。[b]1.3　聚合物整体柱在生物大分子分离中的应用[/b]生物大分子样品结构复杂、种类繁多，而且需要在比较温和的条件下进行分离分析。而聚合物整体柱制备简单，分离迅速，且更易被后修饰为多种色谱模式的整体柱，对蛋白实际样品中的多种蛋白质有不同的选择性。因此，随着聚合物整体柱的进一步发展，其在大分子复杂生物样品的分离分析中将具有更为广泛的应用[sup][color=black][/color][/sup][color=black]。[/color][b]1.4　本文目的[/b][color=black]本实验欲制备一种新型液相色谱聚合物整体柱，用于蛋白质样品的分离分析。由于蛋白样品结构复杂，其中各种蛋白含量相差很大，这就要求液相色谱的固定相必须具有良好的选择性。因此，选择对目标蛋白质分子具有特异分子识别功能的材料，将其作为液相色谱固定相将会提高整体柱对蛋白质的选择性[/color][sup][color=black][/color][/sup]。[color=black]卟啉，是一类由四个吡咯环组成的吡咯衍生物，属于大分子。其母体为卟吩，卟吩被取代后称为卟啉。一定条件下，金属卟啉与某些蛋白质分子之间能够形成超分子，从而对这些蛋白质具有特异分子识别作用。正是由于金属卟啉对这些蛋白质具有特异分子识别作用，本实验以卟啉铁和甲基丙烯酸缩水甘油酯（[/color][color=black]GMA[/color][color=black]）作为二元单体，制备了一种新型聚合物整体柱。实验结果表明，该柱对蛋白质大分子具有分离能力。[/color][b]2　　实验部分2.1　仪器与试剂[/b]Agilent 1100型高效液相色谱仪（[color=black]Agilent[/color][color=black]，美国）；[/color][color=black]HWS-24[/color][color=black]电热恒温水浴锅（上海齐欣科学仪器有限公司）；[/color][color=black]UPT- II -5T[/color][color=black]型优普系列超纯水器（成都超纯科技有限公司）；[/color][color=black]BT25S[/color][color=black]型分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；[/color][color=black]KQ-500DE[/color][color=black]型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；[/color][color=black]S-430[/color][color=black]扫描型电子显微镜（[/color][color=black]Hitachi[/color][color=black]，日本）；[/color][color=black]TriStar II3020[/color]型全自动比表面积和孔径分析仪（[color=black]Micromeritics[/color][color=black]，美国）；[/color][color=black]AutoPore II9220 V3.04[/color]型压汞仪（ Micromeritics[color=black]，美国）。[/color]氯化血红素（卟啉铁，[color=black]Hemin[/color][color=black]）（阿拉丁试剂有限公司）；二甲基丙烯酸乙二醇酯（[/color][color=black]EDMA[/color][color=black]）（抚顺安信化学有限公司）；甲基丙烯酸缩水甘油酯（[/color][color=black]GMA[/color][color=black]）、偶氮二异丁腈（[/color][color=black]AIBN[/color][color=black]）、[/color][color=black]N,N-[/color][color=black]二甲基甲酰胺（[/color][color=black]DMF[/color][color=black]）（天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯）；[/color][color=black]1,4-[/color][color=black]丁二醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、聚乙二醇[/color][color=black]200[/color][color=black]（[/color][color=black]PEG200[/color][color=black]）（天津市光复精细化工研究所，分析纯）；甲醇（上海星可高纯溶剂有限公司，液相色谱纯）；实验用水为超纯水，进入高效液相色谱仪的所有流动相及样品均经规格为[/color][color=black]0.45μm[/color][color=black]的微孔滤膜过滤。[/color][b]2.2　聚（Hemin-co-GMA-co-EDMA）整体柱的制备[/b]按照表2-1中所[color=black]列柱[/color][color=black]C[sub]1[/sub]-C[sub]8[/sub][/color][color=black]的比例，在试管中加入[/color][color=black]Hemin[/color][color=black]、[/color][color=black]GMA[/color][color=black]、[/color][color=black]EDMA[/color][color=black]、[/color][color=black]1,4-[/color][color=black]丁二醇、[/color][color=black]PEG200[/color][color=black]、[/color][color=black]DMF[/color][color=black]、[/color][color=black]AIBN[/color][color=black]，超声[/color][color=black]15min[/color][color=black]使完全溶解并混匀，通氮气。分别将预聚溶液装入一端封口的不锈钢柱管中（[/color]50mm[color=black]×4.6mmi.d.[/color]），然后密封另一端，使其在[color=black]60[/color]℃[color=black]反应[/color][color=black]10[/color][color=black]小时。反应完成后，将整体柱连接于高效液相色谱系统，以甲醇在线冲洗除去整体柱中的致孔剂和其他未反应物。[/color]通过调整单体、交联剂、致孔剂的比例来考察各因素对整体柱柱压、孔径大小、通透性等的影响，最终得到优化的整体柱。[img=,690,305]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907241110575843_2573_3964321_3.png!w690x305.jpg[/img][b]2.3　色谱条件[/b]为了达到最佳分离效果，调节流动相磷酸盐溶液/水的比例，寻找对混合蛋白质样品具有最佳分离能力的流动相比例。[color=black]高效液相色谱仪为安捷伦[/color][color=black]1100[/color][color=black]系列，整体柱在不锈钢空色谱管柱[/color][color=black]([/color]50mm[color=black]×4.6mmi.d[/color])制得。流动相为[color=black]0.02mol/L[/color][color=black]磷酸盐溶液（[/color][color=black]NaH[sub]2[/sub]PO[sub]4[/sub]+Na[sub]2[/sub]HPO[sub]4[/sub][/color][color=black]）[/color][color=black]/[/color][color=black]水，流速为[/color][color=black]1.0mL/min[/color][color=black]。柱温为室温，紫外检测波长为[/color][color=black]280nm[/color][color=black]。[/color][b]3　　结果与讨论3.1　聚（Hemin-co-GMA-co-EDMA）整体柱制备条件的优化[/b]以[color=black]Hemin[/color]和[color=black]GMA[/color]作为功能单体，[color=black] EDMA[/color][color=black]作为交联剂，[/color][color=black]1,4-[/color][color=black]丁二醇，[/color][color=black]PEG200[/color][color=black]，[/color][color=black]DMF[/color][color=black]作为致孔剂，[/color]AIBN[color=black]作为引发剂，聚合方式为热引发的原位自由基聚合，制备[/color]聚（Hemin-co-GMA-co-EDMA）整体柱。通过改变整体柱各组分的比例，可以得到对蛋白质分离能力较好的整体柱。观察并比较整体柱各组分不同比例下制备的各聚合物整体柱的外观均匀度、贴壁情况、硬度、机械强度等，综合分析，从中获得最为理想的聚合物整体柱。[b]3.1.1致孔剂比例对聚合物整体柱制备的影响[/b]整体柱的机械强度和渗透性与致孔剂的种类及用量有很大的关系。单体用量一定的条件下，致孔剂的量越多，整体柱的背压越低而渗透性越大。选择致孔剂时，应注意所选致孔剂既要有良好的占位能力，又不至残留于柱体内而不能被冲洗溶剂洗脱出来。[color=black]Hemin[/color][color=black]在[/color][color=black]DMF[/color][color=black]中溶解性好，因此[/color][color=black]DMF[/color][color=black]被选为制备聚（[/color][color=black]Hemin-co-GMA-co-EDMA[/color][color=black]）整体柱的良致孔剂，与[/color][color=black]1,4[/color][color=black]丁二醇和[/color][color=black]PEG200[/color][color=black]组成致孔剂体系。表[/color][color=black]2-1[/color][color=black]中列出了典型的优化比例的过程，其中[/color][color=black]C[sub]1[/sub]-C[sub]4[/sub][/color][color=black]为采用不同比例致孔剂得到的整体柱，增[/color]加1,4丁二醇的比例，能够提高整体柱的渗透率。[color=black]结果表明：柱[/color][color=black]C[sub]2[/sub][/color][color=black]所采用的三元致孔体系比例能够得到同时具有低背压和高渗透率的整体柱。[/color][b]3.1.2单体与交联剂比例不同对聚合物整体柱制备的影响[/b]制备聚合物整体柱时，若单体与交联剂的用量占聚合物总量比例过大，则聚合物背压升高，导致渗透性下降；反之，则会导致聚合物整体柱渗透性过高，无法达到对样品的分离效果。此外，交联剂的用量比例增大则聚合物交联度增大，将致使制备的聚合物整体柱孔径减小，结构密实，在比表面积增大的同时，却会使柱压增高，通透性下降。表[color=black]2-1[/color][color=black]中，柱[/color][color=black]C[sub]5[/sub]-C[sub]8[/sub][/color][color=black]相比较，改变单体与交联剂的比例，结果表明柱[/color][color=black]C[sub]8[/sub][/color][color=black]性能最佳，机械强度适宜，渗透性良好，后续的分析分离实验均用[/color][color=black]C[sub]8[/sub][/color][color=black]号整体柱完成。[/color][b]3.2　聚（Hemin-co-GMA-co-EDMA）整体柱的表征[/b]用甲醇为流动相在线冲洗聚合物整体柱，以冲去致孔剂和未反应的单体，并以高流速将整体柱从色谱柱管内冲出，放入真空干燥箱内干燥24小时，分别用扫描电镜法、氮吸附法、压汞法对该聚合物整体柱进行表征。3.2.1聚（Hemin-co-GMA-co-EDMA）整体柱的扫描电镜图[img=,690,315]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907241114548185_7773_3964321_3.png!w690x315.jpg[/img]图3-1分别为柱C[sub]8[/sub]放大3,000倍和30,000倍的扫描电镜图。由图可知：整体柱内部为多孔颗粒堆积结构。[b]3.2.2聚（Hemin-co-GMA-co-EDMA）整体柱的氮吸附-脱附等温线[/b][img=,690,480]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907241116349175_9784_3964321_3.png!w690x480.jpg[/img][color=black]通过氮吸附法对该聚合物整体柱的孔类型进行分析，结果如图[/color][color=black]3-2[/color]所示。该等温线符合Ⅲ型等温线，[color=black]在低压区[/color][color=black]（[/color]p/p[sub]0[/sub]＜[color=black]0.1[/color][color=black]），[/color][color=black]曲线偏向[/color][color=black] X [/color]轴且没有拐点，氮气和柱材料之间的吸附作用很弱，且在中压段不存在回滞环，表明该材料孔结构中几乎不存在微孔和介孔；在相对压力较高时[color=black]（[/color]p/p[sub]0[/sub]＞[color=black]0.9[/color][color=black]），[/color][color=black]氮气和柱材料之间的吸附作用很强，吸附量呈较大上升趋势，表明该材料含有大孔结构。[/color][b]3.2.3聚（Hemin-co-GMA-co-EDMA）整体柱的压汞法分析图[/b][img=,690,350]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907241117438633_8238_3964321_3.png!w690x350.jpg[/img]由于该柱材料含大孔结构，故通过压汞法对其大孔结构进行了表征。由图3-3可知，整体柱的孔尺寸分布范围较窄，表明孔结构较均匀。其孔体积、众数孔径、孔隙率分别为1.40mL/g、3497 nm、57.32 %。[b]3.2.4聚（Hemin-co-GMA-co-EDMA）整体柱的机械稳定性[/b]图3-4为分别以磷酸盐缓冲液（NaH[sub]2[/sub]PO[sub]4[/sub]+Na[sub]2[/sub]HPO[sub]4[/sub]）和水为流动相时柱C[sub]8[/sub]的[color=black]柱背压与流速的关系图。以磷酸盐缓冲液和水为流动相时，其相关系数[/color][color=black]r[/color][color=black]值分别为[/color][color=black]0.9992[/color][color=black]和[/color][color=black]0.9991[/color][color=black]，表明柱压与流速有良好的线性关系，[/color]且高流速下整体柱稳定性依然良好，表明柱材料具有良好的机械稳定性。[img=,690,375]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907241119324545_1492_3964321_3.png!w690x375.jpg[/img][b]3.3　聚（Hemin-co-GMA-co-EDMA） 整体柱的色谱性能考察3.3.1整体柱对人血浆的色谱分离[/b]人血浆预处理：取新鲜人血，于4℃，4500r/min的条件下离心15min，取上清液冷藏保存，备用。以整体柱C[sub]8[/sub][color=black]为[/color][color=black]HPLC[/color][color=black]固定相，以[/color][color=black]0.02mol/L[/color]磷酸盐溶液（NaH[sub]2[/sub]PO[sub]4[/sub]+Na[sub]2[/sub]HPO[sub]4[/sub]）[color=black]/[/color][color=black]水为流动相，流速为[/color][color=black]1.0mL/min[/color]，对人血浆样品进行pH[color=black]和离子强度梯度洗脱，结果如图[/color]3-5[color=black]所示。表明整体柱[/color][color=black]C[sub]8[/sub][/color][color=black]对人血浆中的蛋白质具有良好的选择性和较高的分离效能。这是由于整体柱中的卟啉铁结构易于与蛋白质之间形成多种作用力，从而达到特异识别。[/color][img=,690,444]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907241124228955_449_3964321_3.png!w690x444.jpg[/img][b]3.3.2　整体柱对鸡卵清的色谱分离[/b][color=red] [/color]鸡卵清预处理：取市售的新鲜鸡蛋一枚，取其蛋清液并用磷酸盐缓冲液（50mmol/L，pH7.0）稀释一倍（V/V）。将稀释后的蛋清液混合均匀于4℃，4500r/min的条件下离心15min，取其上清液冷藏保存，备用。图[color=black]3-6[/color][color=black]为整体柱[/color][color=black]C[sub]8[/sub][/color][color=black]对鸡卵清的色谱分离图。结果表明，整体柱[/color][color=black]C[sub]8[/sub][/color][color=black]对鸡卵清中的多种蛋白质具有良好选择性。[/color][img=,690,407]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907241125286053_9665_3964321_3.png!w690x407.jpg[/img][b]3.3.3　整体柱对蜗牛酶的色谱分离[/b]蜗牛酶是一种含有[color=black]20[/color][color=black]多种酶的混合物，其主要成分有[/color][color=black]9[/color][color=black]种。图[/color][color=black]3-7[/color][color=black]为整体柱[/color][color=black]C[sub]8[/sub][/color][color=black]对蜗牛酶的色谱分离图。由图可知，整体柱[/color][color=black]C[sub]8[/sub][/color][color=black]对其中的一些酶有良好的选择性。[/color][img=,690,407]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907241126464743_5894_3964321_3.png!w690x407.jpg[/img]尽管聚（Hemin-co-GMA-co-EDMA）整体柱[color=black]C[sub]8[/sub][/color]对三种实际样品中的某些蛋白质有较好的选择性，但色谱峰普遍存在拖尾情况，这可能是由于卟啉铁能够与蛋白质之间形成配位从而造成拖尾。此外，分离后的蛋白质分析和鉴定工作还未完成，后续的研究需要通过色谱-质谱联用技术对蛋白质进行定性分析。[b]4　　结论与展望[/b][align=left]本实验引入新的功能单体卟啉铁（Hemin），制备了聚（Hemin-co-GMA-co-EDMA）整体柱，并将其用于蛋白质的分离。该整体柱具有均匀的内部结构，高通透性和良好机械性能。其对蛋白质的色谱分离结果表明：卟啉铁的引入，能够从复杂的生物样品中分离较多数量的蛋白质，表明整体柱对蛋白质具有良好选择性。[/align]生物样品中蛋白质的分离是一项十分复杂的工作，本文中的方法还需要进一步完善分离机理，改善柱选择性，更有待续的蛋白质鉴定工作需要研究。通过本实验中的方法对蛋白质进行分离和后续的鉴定研究工作的完成将为蛋白质组学的分类、分级研究提供重要的数据支持。参考文献 Pellati F, Calo S, Benvenuti S. [color=black]High-performancechromatography analysis of polyacety and polyenes in echinacea pallida by usinga monolithic reversed-phase silica column[/color] . J. Chromatogr. A, 2007,1149(5): 56-65. Nonaka S, TsunodM, Aoyama C[i] et al[/i]. Determinationof N,N-dimethyl-arginine in rat plasmaand dimethylarginine dimethylaminohydrolase activity in rat kidney using amonolithic silica column . J. Chromatogr. B, 2006, 843(19): 170-174. Motokawa M, Ohira M, Minakuchi H[i] et al[/i].Performance of octadecylsilylated monolithic silica capillarycolumns of 530μm innerdiameter in HPLC . J. Sep Sci, 2006, 29(9):2471-2477. 王超然,王彦,高也等.聚(4-乙烯基苯硼酸-季戊四醇三丙烯酸酯)亲和整体柱的制备与应用.分析化学研究报告, 2012, 40(8): 1207-1212. 李晶, 周琰春,张嘉捷等.阴离子交换聚合物整体柱的制备及其在[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/3p][color=#3333ff]离子色谱[/color][/url]中的应用.分析测试学报, 2012, 31(9):1089-1094. 张振宾, 欧俊杰, 林辉等.有机-硅胶杂化整体柱的制备及应用研究进展.高等学校化学学报，2013, 34(9): 2011-2019. Lv Y, Lin Z, Svec F. Thiol-ene click chemistry: a facile and versatileroute for the functionalization of porous polymer monoliths . Analyst, 2012,137(9): 4114-4118. 平贵臣, 袁湘林, 张维冰等．整体柱的制备方法及其应用.分析化学, 2001, 29(12): 464-469. Lin Z, Huang H, Sun X [i]etal[/i]. Monolithic column based on a poly(glycidylmethacrylate-co-4-vinylphenylboronic acid-co-ethylene dimetharylate) copolymerfor capillary liquid chromatography of small molecules and proteins . J.Chromatogr. A, 2012, 1246(13): 90-97. Akira N, TakeshiS. Advancein monolithic materials for sample preparation in drug and pharmaceuticalanalysis . TrAC, 2013, 45(9): 182-196. Liu J, Wang F, Zhang Z. Reversed phase monolithic column based enzymereactor for protein analysis. Chin. J. Anal. Chem, 2013, 41(1): 10-14. Frantisek S, Lv Y. Advances andrecent trends in the field of monolithic columns for chromatography. Anal. Chem,2014, 87(9): 250-273. Liu Z, Ou J, LinH. Preparation of monolithic polymercolumnswithhomogeneousstructurevia photoinitiated thiol-yne click polymerization and their application inseparation of small molecules . Anal. Chem, 2014, 86(105): 12334-12340. Jin Zhang, Huilin Zou, Qin Qing [i]et al[/i]. Effect of chemical oxidation on the structure of singlewalled carbon nanotubes . J. Phy. Chem. B, 2003, 107(16): 3712-3718. Ou J, Liu Z, Wang H. Recentdevelopment of hybrid organic-silica monolithic columns in CEC and capillary LC. Electrophoresis, 2015, 36(9): 62-75. 王玺, 何健, 季一兵．聚甲基丙烯酸酯毛细管整体柱的制备及其性能考察.中国药科大学学报，2012, 67(7): 78-85. 吕仁江, 丁会敏, 李英杰．丙烯酰胺-β-环糊精毛细管电色谱手性整体柱的制备及应.应用化学，2012, 29(5): 604-607. Trojer L, Lubbad S H, Bisjak C [i]et al[/i]. Monolithicpoly( p-methylstyrene-co-1,2-bis( p-vinylphenyl)ethane) capillary columns as novel styrene stationary phases for biopolymerseparation . J. Chromatogr. A, 2006, 1117(1): 56-66. 白立改,牛文敬,杨更亮.聚合物整体柱在生物大分子分离中的应用.色谱，2013, 9(4): 303-309. Zuo L, Zou H, Zhang X [i]et al[/i]. Chromatographicseparation of proteins on metal immobilized iminodiacetic acid-bound moldedmonolithic rods of macroporous poly(glycidyl methacrylate-co-ethylenedimethacrylate) . J. Chromatogr. A, 2001, 926(2): 255-264. 郑晖,李秋顺,马耀宏等. 微流控芯片上电色谱聚合物整体柱研究进展.山东科学，2013, 26(1): 16-21.