质谱蛋白量

p　　用于生物样品分析的蛋白指纹法，该专利技术被国际顶级科学杂志《科学》以及医学界权威杂志《柳叶刀》评为世界蛋白指纹图谱和蛋白质芯片排名第一的技术。针对这项技术的一些问题，火石创造对许洋博士进行了深度的专访。/pp style="text-align: center "img width="300" height="385" title="001.png" style="width: 300px height: 385px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/ebf3be8e-c0c2-49d6-9891-a76d207d183f.jpg" border="0" vspace="0" hspace="0"//pp style="text-align: center "strong　　许洋博士/strong/pp　　许洋博士一直致力于蛋白质组学研究开发，怀揣近五十项蛋白分子质谱诊断技术的自主发明专利。2009年他创办了湖州赛尔迪生物医药科技有限公司，凭借专利产品蛋白指纹图谱仪成为行业领头羊，也成为此类器械行业标准的起草者。/ppstrong　　火石：请问您为什么做蛋白质谱?/strong/pp　　许洋博士：我研究蛋白质谱是偶然也是必然。在美国纽约著名的Sloan-Kettering研究所单克隆抗体实验室早期研究治疗白血病时，我们制造了全世界第一枚人源化单克隆抗体(抗CD33人源化单抗)。后来我又和顶尖美国公司合作第一个将人源化单克隆抗体做成了靶向药。有了扎实的基础，必然能在更窄的蛋白质谱领域做的更好。/pp　strong　火石：蛋白质谱当前的临床应用情况如何?/strong/pp　　许洋博士：只有拿到医疗器械注册证才算进入临床，蛋白质谱目前只有三种临床应用：对肿瘤的筛查 对早期肾脏疾病的分析 在细菌上的鉴定应用。蛋白质谱在国内仍处于非常早期的阶段，且具有垄断性，极少人能做且在做。/ppstrong　　火石：作为国家“千人计划”医疗器械特聘专家，您认为蛋白指纹图谱仪在医疗器械中的角色是什么?/strong/pp　　许洋博士：蛋白指纹图谱仪分析的大数据可以生动地比喻为人体疾病的健康地图。/pp　　蛋白指纹究竟是什么?把质谱仪的显示屏中的每一个蛋白质都用一个分子量来表达，这些分子量组合起来就叫蛋白指纹。就像每个人的指纹都是不同的，每种疾病的特定蛋白质表达物也不同，称之为指纹图谱。蛋白指纹图谱技术是由蛋白质芯片及分析仪器——表面加强激光解析电离飞行时间质谱仪两部分组成，可以将病人血清中蛋白质成分的变化记录下来，绘制成蛋白指纹质谱图，并显示样品中各种蛋白的分子量、含量等信息。将这张图谱与正常人、某种疾病病人的谱图或基因库中的谱图进行对照，就能最终发现和捕获新的特异性相关蛋白及其特征。这种方法具有微量、精确、简易、快速的特点，适应于基础和临床等各个领域。/pp　　之所以将蛋白指纹图谱仪分析的大数据比喻为人体疾病的健康地图(MAP)，是因为既然β2—微球蛋白是11731、人绒毛膜促性腺激素是37580、转甲状腺素蛋白是13761(数字对于计算机的应用更好管理)，而每个蛋白质在质谱仪分析中都是数字，它本身就是大数据。任何物质在质谱底下都是数字，综合起来就是大数据。我把大数据串联起来，就能将分子在身体的MAP做出来。譬如一位吸烟的男士来体检，能发现他吸了烟数年之后肺部出现影像学病理性位点，结合质谱仪分析发现相关的疾病标志物，我们能够模拟出肺部疾病的健康地图，即通过质谱仪检测的健康大数据，可以模拟出该患者肺部出现了数个小红点，点击每个红点后都会解释原因，如显示铅、铬等数据是否超标，以及告诉你相应的对策。这样的技术开启了全智能健康4.0时代。/pp　　Tips：β2—微球蛋白(β2—MG)被认为是诊断早期肾功能损伤的敏感指标，尤其对于糖尿病肾病、高血压肾病、红斑狼疮肾炎的早期诊断具有重要参考价值，因此β2—微球蛋白的测定在临床上是有多种价值的。/pp　　strong火石：您和您的团队在蛋白质组学研究的技术或者方法上有什么突破吗?/strong/pp　　许洋博士：蛋白质作为标志物对肿瘤的诊断，确实没有太大的进展。/pp　　一直以来蛋白质组学研究面临的重大瓶颈是蛋白质分离问题：人体内有十万种蛋白质与衍生物，多数可能与疾病有关联，但这十万种蛋白质与衍生物只有分开后，质谱才能分析清楚。此前蛋白质组学技术中最流行、最通用的蛋白质分离方法是双向电泳，基本上能分离近二千种血浆蛋白质，远远不及十万种，所以成为了瓶颈。/pp　　2006年我提出了一个设想：和蛋白有关的抗体至少有一万多种，那为什么不用抗体来分离蛋白质?这件事一直有人在做，但之前都没有人想到用抗体组把一千个蛋白质一次性快速、实时地分离出来。之后就诞生了免疫质谱分析方法(专利号ZL 200610140652.0)，可以在一个抗体组基质上同时捕获多个生物标志，并对捕获的变异的或修饰的生物标志进行质谱精确分析，还可以同时检测多个生物标志群。用免疫组质谱技术能测定抗原变异片段的分子量。另外，还可以将多种疾病特异性抗原的抗体同时标在一个基质点上。/pp　　Tips:免疫质谱分析方法：质谱与抗体分离技术联合应用即为免疫组质谱(Immunomic mass spectrometry，IMS)。免疫组质谱检测为一组多种(类)抗体与质谱联合来精确地鉴别变异或修饰生物标志群的方法。在一个抗体组基质上同时捕获多个生物标志，并对捕获的变异的或修饰的生物标志进行质谱精确分析。可以同时检测多个生物标志群(biomarkers)。/pp　　双向电泳(Two-dimensional electrophoresis)：是一种等电聚焦电泳与SDS-PAGE相结合，分辨率更高的蛋白质电泳检测技术。目前是快速成长的蛋白质组学技术中最流行最通用的蛋白质分离方法。目前2D-PAGE能够在同一块凝胶上同步检测和定量数千个蛋白质。/pp　　从整个2015年的政策看，医疗器械行业是受到国家大力扶持的，行业地位与重要性大幅提升，法规向国际化看齐，行业监管不断趋严，医疗器械正成为与药物齐头并进的新兴产业。/pp　　strong火石：是什么驱动着行业的高增长?/strong/pp　　许洋博士：一是需求，老龄化加剧，家庭支付能力增强，导致医疗需求高增长 二是政府加大医疗卫生投入，《医疗器械科技产业“十二五”专项规划》表示，“十二五”期间将扶植形成8～10家产值超过50亿元的大型医疗器械产业集团 三是为配合新医改完善基层医疗建设的目标 四是国内生物技术研发应用进入突破期。/pp　　strong火石：您认为接下来医疗器械未来发展的特点和前景会是怎么样的?/strong/pp　　许洋博士：未来5年，医疗器械和制药占比将会达到1:1。近十年，我国医疗器械市场规模快速增长，国内医疗器械工业总产值从2003年的189亿人民币上升到2013年的1889亿，2013年同比增长21%，增长速度远快于药品。预计在未来5年左右，我国医疗器械行业仍然将保持高速增长。医疗器械行业涉及到医药、机械、电子、塑料等多个行业，中高端医疗器械更是多学科交叉、知识密集、资金密集的高技术产业，研发成本高，决定了只有大型厂商才能在大中型医疗器械方面有所作为。此外，器械“国产化”也会成为必然趋势。/pp　　strong火石：赛尔迪当前开展的业务、研发的产品有哪些?公司部署战略是怎么样的?/strong/pp　　许洋博士：我们现在正在做一张人类的大健康MAP。通过精准医疗计划，基于环境健康大数据，通过蛋白指纹图谱仪完成健康管理。现在的疾病市场最关注的问题分别是：检测0～6岁儿童智力、优生优育(为什么生不出聪明宝宝)、高达5千万的肿瘤人群以及3.5亿的高血压、糖尿病人群。/pp　　其中糖尿病肾病是糖尿病最常见且严重的并发症之一，是糖尿病所致的肾小球微血管病变而引起的蛋白排泄和滤过异常那个渐进性肾功能损害。而微量白蛋白尿即早期糖尿病肾病是可逆的，这不同于大量白蛋白尿即临床糖尿病肾病，因此积极防治早期糖尿病肾病就显得尤为重要。去年底，赛尔迪公司与中国医学科学院北京协和医院签署协议，承担国家对糖尿病肾病体内铅、镉毒素的临床大样本检测。全新升级的蛋白指纹图谱仪，是目前唯一获国家药监局批准、能检测含微量白蛋白、β2—微球蛋白以及泛素3项指标的医疗器械。这对糖尿病肾病的早发现、早治疗具有重大意义。/pp　　赛尔迪接下来将按照个体化精准检测所附带的信息，由这些信息与大数据库交流，提出符合个体化治疗的方案，向个体化精准医学管理方式转变。/pp　　随着大数据时代的来临，“互联网+”概念的提出让医疗健康事业呈现出了新的发展势态和特征。医学知识体系正被大数据、精准医疗所重构，信息化进程提高了知识传递速度与医疗协同效率。/ppstrong　　火石：蛋白质组学技术如何助推精准医疗?/strong/pp　　许洋博士：常识知道铅、镉会引起糖尿病性肾病。但铅、镉指标不是医院常规检测的项目。如果采取个体化精准治疗，每年常规检查一次体内铅与镉的指标，发现异常就能进行针对性的从尿液排泄的治疗。已经得了肾病正在透析的病人，检测铅与镉指标后进行针对性排泄也会增强治疗效果。利用蛋白指纹图谱仪能够发现早期的肿瘤和心血管标志物，这就会对疾病的治疗带来极大的希望。随着质谱技术在精准医疗的应用，越来越多的个体化标志物将会被发现，人体的蛋白指纹图谱测定将会成为医院的常规工作。/pp　　精准医疗，即考虑每一个体健康的差异，制定个性化的预防和治疗方案。正确的选中一个工具，解决关键问题，这就是精准医疗。基于基因组测序技术、生物医学工具以及大数据工具逐步成熟和完善，精准医疗能够为个体基因特征、环境以及生活习惯进行疾病干预及治疗，但如何尽快与大数据结合才是发展重点。日前我与北京协和医院合作，创立了中国特色的首个百万人疾病与环境毒素数据库与IMS(爱睦世)特检中心：HZIMS2008，首次在复杂疾病系统中构建了基于环境毒素大数据的移动网络数据库的质量控制体系，使我国重大疾病，如高血压、糖尿病、肿瘤的大数据病因学研究处于世界领先。/pp/p

大家好，本周为大家介绍的是一篇发表在Analytical Chemistry上的文章Charting the Proteoform Landscape of Serum Proteins in Individual Donors by High-Resolution Native Mass Spectrometry1，文章通讯作者是来自荷兰乌得勒支大学的Albert J. R. Heck教授。　　血清中大多数蛋白都是糖基化蛋白，这些糖蛋白对疾病诊断有着重要意义，基于质谱的糖链释放后分析和糖肽分析是目前普遍使用的糖蛋白分析方法，但仍存在一些局限，例如可能遗漏同时发生的翻译后修饰、缺乏对O-糖的研究、遗漏某些糖肽覆盖不到的糖基化位点等。高分辨非变性质谱为完整糖蛋白的分析提供了新的思路，本文开发了一种基于离子交换色谱的分离纯化方法，能够从150μL血清中分离和分析20多种血清(糖)蛋白，质量范围在30-190 kDa之间。　　图1为血清糖蛋白的分离和分析方法。150μL血清首先经过亲和柱以快速去除大量的白蛋白、IgG和血清转铁蛋白等，这一步骤使用的是作者内部制造的机器人，可以加快过柱子的速度。接着血清被送入离子交换(IEX)色谱，使用40分钟的梯度时，大多数蛋白在14-27分钟内洗脱，故作者在13-30分钟内每隔0.5分钟收集一次级分，并将每个级分缓冲液换为乙酸铵溶液，最后进行Thermo Exploris Orbitrap质谱仪分析。　　　　图1.血清糖蛋白非变性质谱分析方法　　作者使用该方法分离了大约24种血清蛋白，并在文中详细介绍了其中4种蛋白的分析过程：α-1抗胰蛋白酶、补体C3、血红素结合蛋白、铜蓝蛋白。　　(1)α-1抗胰蛋白酶(A1AT)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，在呼吸系统的功能中起重要作用，作者使用唾液酸酶和PNGase F确认了蛋白上的糖型，又通过TCEP的还原处理发现大部分血清样品的A1AT都是半胱氨酸化的，也确认了A1AT存在N端截短的特征，综上，作者共统计出了13个A1AT异质体。针对捐献者提供的血清，作者区分出了携带V237A和E400D突变的A1AT蛋白的供体。　　(2)补体C3蛋白在免疫调节过程中发挥作用，在血清中浓度相对较高，分子量为187kDa。与该蛋白共流出的还有两种约137kDa和80kDa的蛋白，在唾液酸酶处理后，只有80kDa的蛋白质量减少很多，证明其存在唾液酸，而C3和137kDa蛋白的糖型上无唾液酸。通过对级分的糖肽分析确定N糖位点在Asn 63和Asn 917。137kDa蛋白鉴定为C3缺失α链后降解而成。　　(3)血红素结合蛋白(HPX)在血清中的主要功能是结合和运输游离的血红素，进行血红素和铁的再循环。非变性质谱显示HPX质量范围在58-63 kDa，而蛋白质主链质量仅50 kDa。本文首次解析了血清HPX的蛋白型谱，证明了4-5个N-糖和1个O-聚糖的存在，共17种独特的糖型。　　(4)铜蓝蛋白(CER)负责在人体内转运大部分的铜，分子量132kDa，每个CER分子可以携带6-7个铜离子。CER在非变性质谱检测后的分子量比理论质量多409±5Da，作者将其归为6个铜离子和1个钙离子的结合所致，并发现了CER完全去糖后失去结合金属离子的能力。　　　　图2.绘制血清糖蛋白组的全貌图。观察到的血清蛋白质量范围为30-190 kDa，浓度范围为0.2-50g/L　　总结：本文开发了一种从少量人血清中分离多种糖蛋白的方法，并通过高分辨非变性质谱表征了蛋白型谱，为蛋白全貌提供完整视图。该方法的优势在于非变性质谱需要的样品处理步骤少，最大程度的还原了蛋白的生理状态，劣势在于目前通过完整质量只解析了20余种蛋白中的8种，后续需要结合自下而上或自上而下的蛋白质组学方法进行辨别。在未来的研究中，作者建议联用分子排阻色谱和离子交换色谱，实现高通量在线血清蛋白分离分析。　　撰稿：英语佳 编辑：李惠琳　　原文：Charting the Proteoform Landscape of Serum Proteins in Individual Donors by High-Resolution Native Mass Spectrometry

在翻译后修饰和/或极碱肽的序列分析方面，电子转移裂解（ ETD ）线性离子阱质谱是很有优势的工具。传统的诱导活化裂解（CAD）常用来鉴定蛋白，并试图确定和找到他们修饰的位点，但这种技术有其本身固有的缺点，下面将详细叙述。与线性离子阱的结合使用的ETD是蛋白质组学研究的一个可靠的技术，可以很容易鉴定用CAD不能鉴定的多肽。ETD 是一个相对较新的肽/蛋白质碎裂的技术，能够大大推进质谱鉴定蛋白质这个领域的进步。 翻译后修饰 翻译后修饰（PTM）是翻译后的蛋白质进行的一种化学修饰，是蛋白质生物合成的后续步骤之一。蛋白的分析及其翻译后修饰的分析对于研究许多疾病是非常重要的，如癌症、糖尿病、心血管疾病和神经退行性疾病---阿尔茨海默病。这是因为在蛋白质的合成的过程中以及合成之后，可能发生各种蛋白修饰。对于正常细胞的功能，这些修饰是必须的，但调节这些修饰的变化可能会导致疾病的发生，如阿尔茨海默病，癌症和勃起功能障碍。蛋白质修饰可提高/降低蛋白质的活性，可以与其他蛋白质发生相互作用和将某一蛋白质定位到细胞的特定地方。 翻译后修饰，如磷酸化，乙酰化和甲基化被用作化学开关，激活/灭活组蛋白基因转录调控， DNA复制和DNA损伤修复。组蛋白是染色质的主要蛋白，DNA盘绕时，它们起到线轴的作用，而且在基因调控中发挥重要作用。因此，鉴定这种翻译后修饰是必需的，因为它在生物系统中对于某些蛋白的功能和作用至关重要。 用CAD鉴定蛋白 质谱在确定蛋白及其翻译后修饰上发挥了不可或缺的作用。CAD是一种常见的分析鉴定蛋白质的技术。一般用胰蛋白酶将蛋白质消化成较小的多肽，然后用反相色谱将其分离，并直接注入电喷雾质谱仪检测，通过串联质谱（ MS / MS法）获得序列信息。通过电喷雾电离这些多肽形成几种带电状态的肽离子，而较低带电状态的最适合CAD分析。低能量的CAD串联质谱一直是最常用的分析方法，通过裂解肽离子进行后续的序列分析。 翻译后修饰分析，如磷酸化，磺酸化和糖基化很难用CAD进行分析，因为这些修饰通常是不稳定且容易丢失肽骨架的碎裂信息，从而导致很少或几乎不能得到肽序列和磷酸化位点。利用常规的CAD质谱对于含多个碱性残基多肽测序也是极为困难。 根据不同的蛋白质序列，有时胰蛋白酶会产生过小或过大的肽段。在这种情况下，缺乏可信的序列分析手段。因此CAD对短的，低带电的多肽是最有效的。对于鉴定蛋白和了解蛋白的生物学功能，这是一种广泛使用的方法，然而，限制了研究者分析了所有的肽段，这也阻止多个翻译后修饰位点的检测和了解这些蛋白的生物学功能。 先进的碎裂方式：ETD ETD是基于离子/离子气相化学一种碎裂多肽的新方法。ETD通过从阴离子自由基到质子肽转移电子的化学能量将肽碎裂，这引起多肽骨干的分裂。 ETD产生的骨干肽序列和肽侧链的信息往往与CAD互补。 ETD已成功应用与线性离子阱以及其前身三维离子阱。虽然ETD在三维阱的执行价格具有竞争力且和CAD自身相比提供了独特好处 ，这样的组合并没有提供蛋白质组学分析所需的技术能力。非线性离子阱的ETD，它一直未能很好控制裂解过程，而且由于三维阱离子存储能力的有限不能处理大量的多肽。基于此，研究人员已经提出ETD功能应用于线性离子阱（Thermo Scientific LTQ XL mass spectrometer质谱仪） 。 相对于传统的CAD技术， ETD提供了更稳定的方法来定性PTMs，鉴定大型多肽或甚至整个蛋白质。 ETD能够将普通翻译后修饰的多肽，或者多个碱性残基的多肽甚至整个蛋白质生成离子。 ETD也可以轻易碎裂含有二硫键的的多肽。 ETD是为更复杂的FT-ICR仪器开发相似的裂解技术。使用电子转移试剂，而不是影响肽碎裂的自由电子使ETD在广泛使用的射频四极离子阱中得到应用。射频离子阱质谱仪具有低成本，低维护费用以及更易接受优点，相对于CAD碎裂方法，ETD碎裂技术能够产生更多的产物离子，利于肽段的解读。 ETD的线性离子阱提供了强有力的工具鉴定蛋白及其翻译后修饰 。LTQ XL线性离子阱质谱仪比其他任何离子阱提供更多的结构信息，ETD能够得到常规方法无法得到的序列信息。相比非线性离子阱，ETD的线性离子阱的显著特征在于离子和离子发生反应。虽然ETD功能是完全自动的且通常无需用户干预，但是当需要对离子数进行累积的时候，用户可通过软件完全控制线性离子阱的离子。线性离子阱质谱仪有能力处理大量的样品，并分析低浓度的大分子和小分子。与非线性离子阱的相比，该过程更为复杂和费时 应用实例 在最近的应用中，极碱的多肽和大量重要的翻译后修饰已经用含CAD和ETD线性离子阱质谱分析了。通常CAD碎裂方式产生的普通只显示有限的肽碎裂信息。然而，用ETD碎裂这些多肽的时候， 肽骨架碎裂信息能完全或几乎完全产生，因此得到更广泛的多肽序列的信息。 ETD的灵敏度和稳定性对于蛋白质组学分析是必不可少的。 ETD提供了高度可靠的解决方案，此方案具有用户友好性，几乎不需要日常维护，并提供高度准确的数据，而且ETD的数据分析有相应的软件支持，非常方便简单。 结论： 在蛋白质组学研究领域，ETD的应用对于研究疾病的机理，如癌症，药物开发研究以及细胞功能和信号转导有重大意义，ETD将扩大目前的分析，包括更多的碱性、非胰酶切肽段和蛋白质。它们能确定各种翻译后修饰以及鉴定新的蛋白亚型。 配备ETD的线性离子阱质谱可应用于蛋白质组学各个领域内。ETD的线性离子阱将继续推动蛋白质组学的发展，而且已被证明是替代CAD一种有效技术，而且ETD同样可以应用于非线性离子阱进行肽序列分析。在不久的将来，配备ETD的线性离子阱预计将成为碎裂技术的一种新选择。 参考文献 Leann M. Mikesh et al, The utility of ETD mass spectrometry in proteomic analysis, Biochemica et Biophysica Acta (2006), doi:10.1016/j.bbapap.2006.10.003关于 Thermo Fisher Scientific （赛默飞世尔科技，原热电公司） Thermo Fisher Scientific纽约证交所代码：TMO）是全球科学服务领域的领导者，致力于帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。公司年销售额超过100亿美元，拥有员工约30000人，在全球范围内服务超过350000家客户。主要客户类型包括：医药和生物公司，医院和临床诊断实验室，大学、科研院所和政府机构，以及环境与工业过程控制装备制造商等。公司借助于ThermoScientific和FisherScientific这两个主要的品牌，帮助客户解决在分析化学领域从常规的测试到复杂的研发项目中所遇到的各种挑战。ThermoScientific能够为客户提供一整套包括高端分析仪器、实验室装备、软件、服务、耗材和试剂在内的实验室综合解决方案。FisherScientific为卫生保健，科学研究，以及安全和教育领域的客户提供一系列的实验室装备、化学药品以及其他用品和服务。赛默飞世尔科技将努力为客户提供最为便捷的采购方案，为科研的飞速发展不断地改进工艺技术，提升客户价值，帮助股东提高收益，

p　　何为非变性质谱?就是选用温和的溶液体系及质谱条件，使蛋白保持在非变性状态下被分析。听到这，有些小伙伴可能会一头雾水：师兄师姐教我处理蛋白质样品的时候，第一步就是要变性啊，怎么现在又不要变性了?/pp　　在通常的蛋白质相关分析中，为了破坏蛋白质的三维立体空间结构，便于酶解等操作，会通过加热或是加入高浓度的变性试剂(如尿素、盐酸胍等)，使蛋白质变性 另外，对于常用的分离手段——反相色谱来讲，其流动相的酸性pH条件与高有机相同样也会使蛋白质变性。当需要对蛋白质中的非共价结合进行研究时，为了避免非共价结合被强烈的变性条件所破坏，则需在非变性的液相-色谱条件下(通常为50mM醋酸铵，pH=7的中性体系)进行研究 另外，对于组成较为复杂的蛋白样品，在非变性条件下分析时，由于体系中质子数减少，所以蛋白电荷态数目也会相应减少，电荷态之间的相互重叠度也会下降，进而减少复杂组分之间的相互影响，从而能够得到复杂蛋白样品中每个组分的分子量信息(图1)。/pp style="TEXT-ALIGN: center"img title="图1_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/56171fe8-be7c-4cc8-a672-814a9fe87e30.jpg"//pp style="TEXT-ALIGN: center"　strong图1/strong 同一样品分别于变性及非变性条件下进行分子量测定的原始谱图/pp　　目前，strong非变性质谱技术主要应用在两个方面/strong：一是strong生物制药领域/strong，通过打开单克隆抗体链间二硫键后在Cys位点上偶联小分子药物(Cys-ADC)的完整分子量分析，此类药物的链间仅靠非共价力结合，故变性条件下各条链会分离，无法测得其完整状态的分子量 另一应用方向为strong研究蛋白质多聚体/strong，非变性条件下不仅可以保持各个亚基间的非共价相互作用，同时由于中性条件更接近生理状态，得到的结果更具意义。/pp　　现在，非变性质谱与氢氘交换、X-ray衍射、核磁共振、冷冻电镜和cross-linking等技术联合使用、互为补充，已经越来越多的被应用在结构生物学、生物医药等领域的研究中。本期文章将会重点介绍非变性质谱在治疗性生物医药制品完整分子量测定中的研究，下期文章将会侧重介绍非变性质谱用于蛋白复合物的研究进展。/ppspan style="COLOR: #002060"strongOrbitrap超高分辨质谱：非变性质谱研究的理想平台/strong/span/pp　　古人云：工欲善其事，必先利其器。要想研究做得好，趁手工具不可少!针对于非变性质谱研究中的需求，我们在Orbitrap质谱平台上对相关参数进行了优化，包括离子源区脱溶剂能量、质量范围的扩展以及高质荷比离子传输效率的优化等，使Orbitrap在固有的高分辨率、高质量精度及高灵敏度基础上，在非变性质谱领域也能有出色表现。/pp style="TEXT-ALIGN: center"img title="图2_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/caeec8f3-896f-4e02-a44a-84aae9ecd287.jpg"//pp style="TEXT-ALIGN: center"　　strong图2/strong Orbitrap质谱平台用于非变性质谱分析/pp　　上文中提到，在生物制药领域中，会通过分子工程设计，在单克隆抗体的特定氨基酸上通过化学反应，偶联上小分子治疗药物，通过单克隆抗体的靶向识别功能将小分子药物精确带至病变细胞处并释放，达到精确给药、减少毒副作用的目的，这类药物被称作抗体药物偶联物(Antibody Drug Conjugates，ADCs)。在这类药物中，通过将单抗链间二硫键打开从而在Cys位点上偶联药物的Cys-ADC，由于其链间仅靠非共价力结合，故需在非变性质谱条件下才能对其完整分子量进行测定(图3)。/pp style="TEXT-ALIGN: center"img title="图3_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/270ff8dd-d5c1-442b-baf1-f287fcb557b9.jpg"//pp style="TEXT-ALIGN: center"　strong　图3/strong Cys-ADC结构示意图/pp style="TEXT-ALIGN: center"　　图4展示了使用非变性质谱平台对Cys-ADC进行完整分子量测量的结果。由图中不难发现，使用体积排阻色谱(SEC)，可以将单克隆抗体与其他杂质分离开，而Orbitrap质谱平台能够得到基线分离、信噪比高的原始谱图。经数据处理软件解卷积处理后，可见偶联了0/2/4/6/8个小分子药物的簇峰分布，符合Cys-ADC的典型分布特征 解卷积后计算所得该ADC的药物/抗体比值(Drug to Antibody Ratio, DAR)，与之前报道过的DAR值相符。/pp style="TEXT-ALIGN: center"img title="图4_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/b494de8a-6ac5-42cf-ad12-d84637e32bef.jpg"//pp style="TEXT-ALIGN: center"　　strong图4 /strong使用非变性质谱平台对Cys-ADC进行完整分子量测量。/pp style="TEXT-ALIGN: center"　　(上)，原始色谱/质谱图 (下)，解卷积后谱图。/pp　　作为对照，在变性条件下也对同一个样品进行了分子量测定(图5)，发现链间的非共价结合在强烈的变性条件下均被破坏，只能观察到部分ADC的分子量信息。该实验进一步说明了在非变性条件下对Cys-ADC进行分子量测定的必要性。/pp style="TEXT-ALIGN: center"img title="图5_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/46b85220-b769-47dc-b534-f92c93b56cff.jpg"//pp style="TEXT-ALIGN: center"　　strong图5/strong 变性质谱条件下对Cys-ADC进行分子量测量。/pp style="TEXT-ALIGN: center"　　(上)，原始色谱/质谱图 (下)，解卷积后谱图。/pp　　对于常见的另外一种ADC——Lys-linked ADC，虽然其小分子药物与单克隆抗体是通过共价键相结合，但偶联上小分子药物后，ADC的复杂度大大增加，此时若在非变性条件下进行分子量测定，可以减少信号之间的干扰，得到更加准确的测量结果(图6)。/pp style="TEXT-ALIGN: center"img title="图6_20170406090915_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/7c9e60f0-f01a-45eb-85eb-f9dceece9c46.jpg"//pp style="TEXT-ALIGN: center"　　▲非变性条件可减少复杂组分间信号重叠/pp style="TEXT-ALIGN: center"img title="非变性2_20170406090518_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/e634be51-bf68-49f2-b7be-e205227a7242.jpg"//pp style="TEXT-ALIGN: center"　　▲非变性条件下Lys-ADC完整分子量测量结果/pp style="TEXT-ALIGN: center"　　strong图6 /strong使用非变性质谱平台对Lys-ADC进行完整分子量测量。/pp　　strong小结/strong/pp　　本期我们对非变性质谱技术的原理、适用范围进行了介绍，并以Cys-ADC与Lys-ADC样品的完整分子量测量为例展示了该方法的应用，不知道小伙伴们有没有对非变性质谱技术有个初步的了解呢?下期我们将会介绍该技术在蛋白复合物研究中的应用，各位看官走过路过不要错过，我们下期见!/pp　　参考文献/pp　　[1] Dabaene et al., Anal Chem. 2014, Nov 4 86 (21):10674-83./pp /p

临床质谱成为精准医疗新方向临床检验需求的提升不断推动着检验技术的发展。生化、免疫等传统检验技术虽然具有自动化程度高、检测速度快的优势，但是已经不能满足临床对于检验方法灵敏度、特异性、多指标联检等的需求。近年来，临床质谱逐渐进入临床，由于其本身具有高灵敏度、高特异性、多指标联检等的优势，可以提高现有检验项目的精准度，也可以作为生化、免疫技术的有力补充，更好地指导临床诊断，有望成为精准医疗的新方向。所谓临床质谱，是指针对临床上特定分子的检测需求，结合了质谱仪器、试剂、耗材及样本前处理的一整套解决方案的统称。临床质谱技术目前在新生儿遗传代谢病筛查、维生素检测、药物浓度监测、激素检测、微生物鉴定、微量元素检测等多个临床场景应用广泛，主要集中在临床小分子代谢物的定量检测以及蛋白、核酸等大分子的定性检测方面，鲜见对于蛋白标志物的定量检测。MALDI-TOF质谱：临床大分子检测利器临床小分子代谢物的检测主要采用的是三重四极杆串联质谱技术（LC-MS/MS），这也是一段时间内临床质谱的主流技术。随着生命科学的进展，以及质谱技术的发展，能用于蛋白质、多肽、核酸等生物大分子检测的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术越来越受到人们的关注。MALDI-TOF MS的工作原理是用一定强度的激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量，与样品之间发生电荷转移使得样品分子电离。离子在高压电场作用下加速进入飞行管中，小离子飞得快，先到达探测器，大离子飞得慢，后到达探测器，从而得出检测结果。图 MALDI-TOF MS工作原理示意图由于其“软电离”的工作原理，MALDI-TOF MS非常适用于蛋白质、多肽、核酸等生物大分子的检测。临床质谱新高地——蛋白定量质谱目前常用的临床蛋白标志物的检测主要采用化学发光、免疫等方法，这些方法普遍存在依赖于抗体、抗干扰能力差、检测通量低、成本高等问题；串联质谱应用于蛋白质的检测虽然具有灵敏度、准确度、特异性高的优势，但是由于临床样本基质复杂，样本前处理繁琐，较难实现自动化，其对蛋白标志物的检测仍然停留在大规模蛋白标志物的筛选即科研层面，真正能用到一线临床蛋白标志物检验的质谱尚未出现。也就是说，临床质谱的蛋白定量检测目前仍然是一块空白的区域。MALDI-TOF MS在众多质谱中原理较简单、操作简便、对样本要求较低，是最容易实现自动化的一类临床质谱类型，这对于临床质谱的蛋白定量检测而言是一项巨大的优势。然而，上一代的MALDI-TOF MS由于重现性较差（SD＞30%），不能满足临床定量的要求，所以其应用集中在定性检测方面，临床上我们所熟知的微生物质谱、以及近两年热门的核酸质谱都是MALDI-TOF MS在临床上的定性应用场景。随着技术的更新迭代，如今MALDI-TOF MS也能实现临床定量检测应用了。融智生物自主研发的新一代的MALDI-TOF MS平台——QuanTOF新一代宽谱定量飞行时间质谱，通过速度和空间同步聚焦、靶板和离子探测器同时接地、极高频率数据采集等专利技术的改进，首次实现在宽质量范围内（10-1,000,000Da）具有高的检测灵敏度和分辨率，且仪器的重现性达到SD＜5%，完全能够满足临床定量的性能要求。图 QuanPRO蛋白定量质谱解决方案依托于高性能的QuanTOF质谱平台，融智生物正在朝蛋白定量检测方向积极布局，已经推出了包含试剂盒、全自动前处理仪器、质谱仪、数据处理软件在内的QuanPRO蛋白定量质谱全流程解决方案，可以一站式解决临床蛋白定量检测的面临的挑战，为临床疾病蛋白标志物的筛查提供更加快速、准确、经济的新方法。未来，临床蛋白标志物的快速筛查将是QuanTOF除微生物鉴定、核酸检测以外的一个重要的应用领域。

近日美国质谱学会年会（ASMS）上发布的最新数据表明，新的仪器和工作流程极大地提高了基于质谱的血浆蛋白组学实验的覆盖深度和通量。这些进步可使质谱成为各应用领域中更有用的工具，包括血浆蛋白生物标志物的开发以及迄今由Olink和SomaLogic等亲和性平台主导的大规模人群研究。　　血浆是一种易于获取和常用的样本来源，尤其是在临床工作和人群研究中。然而，由于血浆含有大量丰度较高的蛋白质和较宽的动态范围，传统的质谱蛋白质组学分析能力不足。对于细胞裂解物的分析，质谱工作流程可测量8000到12000个蛋白质，但对血浆，类似的工作流程只能测量500到1000个蛋白质。虽然可通过去除丰度较高的蛋白质或进行粗分离来改善这一情况，但这也会牺牲通量。　　去年，瑞士蛋白质组学公司Biognosys在Journal of Proteome Research杂志上发表了一项研究，他们使用赛默飞的Orbitrap Exploris 480质谱仪，通过两小时的液相色谱梯度测量了180个去除了高丰度蛋白的血浆样品中的2732个蛋白质，这是未进行血浆分离处理情况下最高深度的血浆蛋白质组分析。　　最近，蛋白质组学公司Seer推出了一种新的血浆蛋白组学解决方案。该公司的Proteograph系统使用一组纳米颗粒来富集血浆蛋白质，然后可以使用质谱等技术对其进行鉴定和定量分析。与传统的血浆蛋白组学方法相比，Seer系统在覆盖深度和通量上都有所提升。在一份发表于四月BioRxiv预印本的研究中，威尔康奈尔医学院-卡塔尔团队使用该系统分析了345个血浆样本，测量了大约3000种蛋白质，在其液相色谱-质谱法的运行时间下每天可分析大约10个样本。　　根据以上数据，Biognosys分析和Seer系统的覆盖深度都接近于Olink的Explore平台，后者可以在血浆中测量大约3000种蛋白质，但它们仍远远落后于SomaLogic的SomaScan平台，后者可以在血浆中测量大约7000种蛋白质。在每周约70个样本的处理量上，Biognosys和Seer系统的通量仍然落后于Olink和SomaLogic平台，后者每周分别可以处理多达1000个和340个样本。　　ASMS年会上，Thermo Fisher Scientific展示了使用Seer最新发布的Proteograph XT试剂盒在其新的Orbitrap Astral仪器上测量大约6000种蛋白质的数据，每天处理大约30个血浆样本。这些数据标志着血浆蛋白组学工作流程的重大进展，并表明在大规模血浆研究方面，结合Seer Proteograph等血浆富集技术的质谱法与基于亲和性的平台现在可能成为竞争对手。　　剑桥大学临床医学院MRC流行病学单位的生物信息学家Maik Pietzner表示：“坦白说，我们没有预见到这么大的飞跃。”他和他的同事在大规模蛋白质基因组学研究中使用了SomaLogic的SomaScan和Olink的Explore。他指出，根据ASMS展示的数据，“看起来现在似乎变得可行了”，因为他们的研究需要1000个或更大的样本队列。　　华盛顿大学基因科学教授Michael MacCoss还表示，质谱技术具备的覆盖深度和通量使其成为大规模人群研究的有用工具。他说：“像英国生物库（UK Biobank）或弗雷明汉心脏研究（Framingham Heart Study）这样的大型队列……这些样本的价值是巨大的，研究人员希望能够以最少的资源获取最多的信息，很多实验都使用了Olink或SomaLogic。”　　如果质谱技术能够可靠地提供ASMS演示中展示的覆盖深度和通量，它可能成为亲和性平台的有力补充和竞争对手。许多蛋白质存在多种形式，或称为蛋白质变体，其变异包括氨基酸变异、截断或翻译后修饰等，这些变化会影响它们的功能，在亲和性平台上往往不清楚或不确定测量的是蛋白质的哪种变体。质谱方法更适合分析这些不同的蛋白质变体。　　Olink总裁Carl Raimond表示，他认为质谱和亲和性平台是“绝对互补的”，并补充说“看到蛋白质分析领域有创新是非常好的”。然而，他表示在Olink占据领先地位的大规模人群研究中质谱技术近期可能无法成为竞争对手，他同时也质疑ASMS展示的令人印象深刻的数据在广泛应用时是否能够经受考验。他说：“细节决定成败。提出要求很容易，但真正能够实现或提出关于这一要求背后的问题则是完全不同的事情。”Raimond补充说，虽然质谱技术不断改进，但亲和性平台也将不断进步。Olink正在将其Explore平台扩展到约5,000种蛋白质靶点，而SomaLogic计划在今年年底前将SomaScan平台扩展到覆盖约10,000种蛋白质。Pietzner同样表示，虽然在ASMS上发布的数据令人兴奋，但他和他的同事们期待看到更广泛的数据，包括总体的蛋白质覆盖范围，不同蛋白质和肽段在样本中检出的一致性和重复性。他说，“亲和性方法已经应用于规模大于50,000的人群队列中，并带来了惊人的发现。我们需要进行头对头的比较以评估这些新的质谱技术是否能够实现类似的扩展。”　　MacCoss表示，使用质谱进行此类研究的公司或研究人员需要提供数据，证明他们能够在每个样本中一致且可重复地测量一组核心蛋白。他说：“当人们使用Olink时会有一个清单，上面列出了每次都会测到的蛋白质。我们仍然需要这样做。我们仍然需要说，这是每次实验都会返回定量值的蛋白质列表……以及测量中获得高质量分析数值的蛋白。”　　Pietzner表示，他和他的同事目前正在努力扩展他们的蛋白质基因组学研究以包括质谱技术。强生和强生制药公司的神经科学数据科学主管，以及英国生物库药物蛋白质组学项目（PPP）主席Christopher Whelan表示，目前一个规模最大的蛋白质基因组学人群研究项目正在实施基于质谱的蛋白质组学。　　Seer本月宣布推出Seer技术访问中心，该中心将组合其XT试剂盒与Orbitrap Astral质谱仪，为没有质谱仪的用户提供蛋白质组学服务。　　尽管到目前为止很难全面评估Thermo Fisher的Orbitrap Astral和Seer的Proteograph XT的性能，但一些早期用户表示其产生的结果很出色。　　Cedars-Sinai精准生物标志物实验室主任Jennifer Van Eyk一直在使用Orbitrap Astral进行血浆蛋白质分析，在这方面它比先前的仪器有更强的能力。Van Eyk表示，在每天运行60个样本时，新仪器可测得的蛋白质数量是相同工作流程下使用Thermo Fisher的Exploris 480仪器的2到2.5倍。　　她说：“我们不仅可以检测到更多蛋白质，而且可以定量更多蛋白质，并且这些蛋白质是可重复的，也就是说，如果我们运行一个样本五次，我们确实会五次都观察到同样的蛋白。这是一个很大的飞跃。”这台仪器最出色的或许是其高通量，Van Eyk表示，她和她的同事们每天可以运行多达180个的未去除高丰度蛋白的血浆样本并获得良好的数据和深度的覆盖。她说，“在每天运行180个样本的情况下，突然间你可以开始讨论运行10,000个样本，然后它就成为一个人群研究了。”Van Eyk和她的同事目前正在试验Seer Proteograph系统，以“充分测试”其性能，并评估是否要将其作为血浆蛋白质组学工作流程的一部分。　　威斯康星大学麦迪逊分校的生物分子化学和化学教授Joshua Coon指出，他的实验室能够使用50分钟的液相色谱梯度在未处理的血浆中测量大约1,500种蛋白质，并且已经在该仪器上开发出了一种一分钟的直接注射方法，能够在每个样本中测量约200种蛋白质。　　Coon还是SeerProteograph平台的用户，尽管他尚未将其与Orbitrap Astral结合使用。他的实验室一直在使用Seer XT试剂盒分析阿尔茨海默病患者的血浆样本以及长期新冠肺炎（long COVID）个体的样本。他说，尽管他的团队尚未开始处理大批量样本，但在初步工作中，实验室每个样本一致地测量到约3,000种蛋白质，这是不使用Seer系统时的五倍左右。他认为，当研究人员将工作流程应用于Orbitrap Astral系统时，这些数字还会进一步提高。　　除了覆盖深度外，Coon表示，Proteograph对简化质谱样品制备非常有用。他说：“我没有完全认识到到它的自动化程度，它非常方便。现在主要的用户是一个一年级和二年级的研究生……所以他们必须快速学习。他们在处理样本、获得消化产物和肽段方面取得了很大的成功。当你有新人或者长时间不做该工作的人时，进行大规模蛋白质组学研究的样品制备将耗费整个实验一半以上的精力，只需使用该平台然后熟练掌握。”　　尽管Seer Proteograph平台提供的覆盖深度使质谱血浆蛋白质组学在某些应用中与Olink和SomaLogic等亲和力平台更具竞争力，但Seer本身在血浆富集领域面临新的竞争。　　在ASMS会议上，蛋白质组学样品制备公司PreOmics推出了其ENRICH-ist富集血浆和血清蛋白质的试剂盒。该试剂盒使用非功能化顺磁性微珠来富集低丰度蛋白质，据该公司称，与未去除高丰度以及未富集的血浆相比，用该试剂盒处理血浆可将蛋白质检出率从50%提升至100%。PreOmics首席执行官Garwin Pichler表示，微珠与缓冲液的结合可在去除高丰度蛋白的同时富集低丰度蛋白以提高覆盖深度。Biognosys推出了一种新的基于微珠的血浆蛋白质组富集试剂盒，作为其TrueDiscovery服务平台的一部分。据该公司称，这种试剂盒可以高通量定量人类血浆中约4,000种蛋白质。　　此外，在本月，华盛顿大学研究人员领导的团队在BioRxiv预印本上发表了一篇论文，描述了一种使用ReSyn Biosciences的磁性微粒富集血浆蛋白质的方法，其通过结合血浆中的膜结合囊泡并分析相关蛋白质来提高覆盖深度。华大的MacCoss是这篇预印本的通讯作者，该预印本的第一作者Christine Wu也是该富集方法的主要开发者。他们能够在Orbitrap Astral上使用30分钟的液相色谱梯度稳定地定量约4,800种血浆蛋白质，每天可处理约40个样本。在使用一小时的液相色谱梯度时，他们能够测量5,000到6,000种蛋白质。MacCoss他们迄今没有过度挑战该方法的能力，所以这些数字是相对保守的。MacCoss表示，由于Seer公司的技术成本较高，研究人员对于血浆蛋白质组学富集的替代方法很感兴趣。他说：“Seer在制造这些产品方面做得很好，但成本是一个高门槛。”　　维也纳分子病理研究所的蛋白质组学负责人Karl Mechtler表示，他与Seer的讨论中，每个样品的报价大约是600美元。他说：“如果我有100个样品，对于一个蛋白质组学实验室来说，这是一笔巨款。”他指出，对于一个典型的蛋白质组学实验室，一个合适的价格范围应该在每个样品25到50美元左右。Wu表示，使用华大的富集方法进行实验的每个样品成本低于5美元。PreOmics将ENRICH-ist试剂盒作为完整蛋白质组学样品准备工作流程的一部分销售，每个样品总共80美元。　　在回答成本问题时，Seer公司董事长兼首席执行官Omid Farokhzad表示，他认为价格是“价值交换的问题”。他说：“并非所有内容都是等价的。问题在于，从Seer所提供的与其替代方案所提供的内容来说，价值交换是什么？”在血浆蛋白质组学领域最新的发展中，这个问题的答案似乎是一个不断变化的目标。

2015年CNHUPO生物质谱高级研讨会（上海-北京） -- 主题：蛋白定量邀请函（第一轮通知） 为积极促进我国生物质谱技术和蛋白质组学技术的发展和应用，加强国内外相关研究领域的专家学者之间的交流与合作，提升研究队伍理论和技术水平，拟定于2015年1月20日和1月22日在上海/北京举办“2015年上海-北京CNHUPO生物质谱高级研讨会--主题：蛋白质定量”。本次会议由中国人类蛋白质组组织(CNHUPO)主办，赛默飞世尔科技（中国）有限公司独家赞助。 本次会议特邀Dr. Mike MacCoss (University of Washington), Dr. Robert Everley (Harvard Medical School-Steve Gygi Laboratory)，和张玉奎院士，钱小红教授，曾嵘教授，刘斯奇教授，张丽华教授，贺思敏教授，邓海腾教授等多名国内知名专家围绕生物质谱在蛋白定量上的应用做专题报告。会议热忱欢迎各位同行、学者参加。现就会议有关事宜通知如下：一、会议时间2015年1月20日(周二)全天：上海邀请报告会2015年1月22日(周四)全天：北京邀请报告会 二、会议地点2015年1月20日上海邀请报告会：见第二轮通知 2015年1月22日北京邀请报告会：见第二轮通知 三、报名方式请有意参会者务必在2014年12月31日前将“报名回执表”以电子邮件反馈至会务组，或进行在线注册，请注明参加上海的还是北京的报告会。我们将根据“报名回执表”统计参会人数并发送第二轮会议通知。本次会议不接受现场注册。 四、会务费用会议费用：不收会务费。参会者交通和住宿等费用自理。会议提供午餐，茶点，以及晚宴。 五、会务组联系方式刘晓慧（复旦大学）：021-54237961 liuxiaohui_fudan@sina.cn于翌婷（赛默飞）：13127766615 yiting.yu@thermofisher.com 2015年CNHUPO生物质谱高级研讨会参会回执 我们将根据“报名回执表”统计参会人数并发送第二轮会议通知。您也可以登录 www.thermo.com.cn/Invitation116.html 在线报名。 中国人类蛋白质组组织(CNHUPO)赛默飞世尔科技（中国）有限公司2015年12月19日

各有关单位：根据《中国认证认可协会团体标准管理办法》规定，经中国认证认可协会批准立项，青岛海关技术中心等单位已完成《牛乳基婴幼儿配方乳粉中乳铁蛋白含量的测定液相色谱-质谱/质谱法》团体标准的起草工作，形成征求意见稿，现公开征求意见。有关事项通知如下：一、《牛乳基婴幼儿配方乳粉中乳铁蛋白含量的测定液相色谱-质谱/质谱法》团体标准征求意见稿及编制说明等有关材料可从中国认证认可协会网站下载，网址信息如下：http://www.ccaa.org.cn/images/jsbz/stbzgl/2023/03/24/1679628059381007576.rar二、请填写《意见反馈表》(见附件)，并于2023年4月25日前通过电子邮件反馈至标准起草组。联系人：张鸿伟联系电话：18562789917 电子邮箱：light04@126.com附件：意见反馈表中国认证认可协会2023年3月24日

以“跨界开拓检验行业视野 系统提高检验诊断能力”为主题，由中国医师协会和中国医师协会检验医师分会主办的“2016中国医师协会检验医师年会暨第十一届全国检验与临床学术会议”近日在厦门会展中心召开。　　依托本次会议的契机，紧扣“精准检测和精准诊断”的主题，由北京毅新博创生物科技有限公司组织的卫星会同时举办。与会期间，由北京协和医院与北京毅新博创生物公司合作建立的微生物蛋白指纹图谱数据库首次亮相，引发关注。毅新博创基因组技术负责人、中国人民解放军总医院陈琛博士介绍了一种新的应用于临床常规检测的技术，可满足循环肿瘤DNA和甲基化定量检测，即质谱技术在临床微生物鉴定及循环肿瘤DNA精准检测方面的应用，向更多人传播了临床检测的最前沿技术。　　本次大会的第九专题会会以“精准检测和精准诊断”为主题，由北京毅新博创生物科技有限公司协助组织，来自首都医科大学附属天坛医院实验诊断中心主任、中国医学装备协会现场快速检验(POCT)装备技术专业委员会会长康熙雄教授主持并做报告。期间，来自北京协和医院的肖盟〔协和研究实习员，北京协和微生物与感染网站责任编辑〕提出，由于当前国内没有统一的微生物蛋白指纹图谱数据库，临床菌库多引自国外，因人种的个体差异及地域的差异，造成国外菌库在中国临床的应用有所偏差，因此建立中国人自己的微生物蛋白指纹图谱数据库迫在眉睫。　　此外，毅新博创在企业展位重点介绍了质谱技术在临床微生物鉴定、循环肿瘤DNA 精准检测等领域的应用及研究进展，吸引了众多专家和业内同行关注。

近日，第四十一届J.P.摩根大会召开，会议上，多家科学仪器企业和诊断企业均分享了最新的业务情况，并对未来的行业发展重点进行了讨论。仪器信息网对部分科学仪器行业头部企业的业绩表现和战略重点进行了摘录，以飨读者。　　布鲁克(BRUKER)　　Bruker 首席执行官 Frank Laukien 表示，公司预计 2022年第四季度的有机收入将实现中高个位数增长，报告的收入将超过华尔街的普遍预期。分析师平均预计第四季度收入为 6.664 亿美元。 他补充说，公司预计 2023 年有机收入将实现3.6%的同比增长，收入约25亿美元。(数据未审计，仅供参考)　　Laukien 强调，布鲁克的蛋白质组学业务是一个特别重要的增长动力，并预测“蛋白质组学将迎来一个非常重要的十年”。 他提到蛋白质组学在生物制药中的“作用越来越大”，并补充说生物制药研究现在占公司收入的 15% 到 16%，而过去几年里这一比例不到 10%。 过去一年，美国生物制药一直是布鲁克业务增长最快的部分，呈现两位数的高增长。 截至 2022 年底，布鲁克已安装了600 多台 timsTOF 质谱仪，这些仪器已成为蛋白质组学研究人员最喜欢的仪器。　　Laukien 还强调了 Bruker 正在不断扩展其空间蛋白质组学产品组合，特别指出了其 Canopy Biosciences 子公司的 CellScape 空间单细胞蛋白质组学平台，以及去年与 AmberGen 合作推出的 MALDI HiPLEX-IHC 组织成像系统。 他介绍到，公司去年售出了 20 多套 HiPLEX-IHC 系统。　　Laukien 还讨论了布鲁克对瑞士蛋白质组学公司 Biognosys 的投资，布鲁克最近收购了该公司 80% 以上的股份。 Bruker 正在为 Biognosys 提供资金以在美国开设一个实验室，这笔投资将帮助 Bruker 从研究人员和行业团体那里获得业务，他们可能不具备自己操作公司质谱仪的专业知识或人员。 Biognosys 目前的年收入约为 1500 万美元，布鲁克预计该公司未来几年将实现两位数的增长。　　布鲁克2022年新产品新技术、市场动态大事记　　2月，布鲁克推出首款基于timsTOF技术的MPP系统，丰富高通量药物筛选平台。其具有 MALDI 的极快速度和久经考验的稳健性，并且在 HTS 中首次利用了布鲁克创新的捕获离子迁移谱 (TIMS) 技术。TIMS 通过利用分子碰撞截面实现等压线甚至异构体的快速气相分离。这与常规的 50000 质量分辨率和 QTOF-MS 检测相结合，可在 HTS 速度下实现革命性水平的特异性测定。timsTOF MPP 具有双 MALDI / ESI 离子源和布鲁克专利的smartbeam 3D激光技术，可实现与 uHTS 兼容的速度和高通量，并提供独特的基于激光的后电离技术 (MALDI-2 )选项以扩大化合物检测空间。作为 timsTOF MPP 解决方案的一部分，新的 MALDI PharmaPulse 2023 软件支持用于高通量药物筛选的应用。其自动化接口可实现与来自不同供应商的通用调度软件包协同工作。此外，MPP 2023 可将数据和结果无缝传输到下游分析软件，例如 Genedata Screener。　　4月，布鲁克宣布收购大气压DART(实时直接电离)技术的创新者IonSense公司，用于加快DART离子源技术的开发，以及加大在应用市场的应用开发投入，包括食品安全和法医学领域。　　5月，继收购DART后，布鲁克又一大动作进军工业领域！布鲁克和TOFWERK AG宣布建立战略合作伙伴关系，以提供高速、超灵敏的应用和工业分析解决方案，同时布鲁克对TOFWERK注入了新资本。布鲁克最近收购的实时直接分析(DART)技术与TOF-MS技术融合产生的新型业务机会分析解决方案也在开发计划中。　　6月，ASMS2022期间，布鲁克推出DART-EVOQ质谱组合产品，是一款结合了原位电离源(DART)的三重四极杆质谱仪。通过引入用于高通量定量的 DART-EVOQ 三重四极杆质谱仪，将实验室内外的质谱分析能力扩展到点对点高效分析。DART-EVOQ 不需要色谱分离来进行食品/饮料、法医、工业、安全、环境和制药等领域的分析。　　6月，布鲁克宣布了组织和肿瘤微环境(TME)空间多组学的重要创新。继布鲁克与 AmberGen 建立战略合作伙伴关系后，MALDI HiPLEX-IHC 质谱成像增强了关键性蛋白分析功能。布鲁克还宣布推出了用于 timsTOF fleX 系统的 smartbeam 3D MALDI 光源的 microGRID 模块。　　6月，布鲁克公司推出新的 timsTOF HT 系统，进一步拓展了革命性的 4D-多组学 timsTOF 平台。timsTOF HT 采用新型第 4 代 TIMS(trapped ion mobility separation，捕集离子淌度分离)XR cell 和14 位 Digitizer，可实现更宽动态范围、更深的肽段覆盖率和更准确的定量分析。该系统在 4D 血浆、组织蛋白质组和表观蛋白质组学中表现出色。　　2022年布鲁克在蛋白质组学、生物制药等领域进行了多项关键收购和商业投资，可以说是动作频频，基于此，2022年仪器信息网特别采访了布鲁克道尔顿中国区掌门人何磊，与他进行了深入的交谈。点击了解　　不仅如此，2022年，布鲁克推出timsTOF HT(High Throughput)系统，直面蛋白成像的难题与挑战。可以说，布鲁克基于timsTOF持续进行着技术创新，并努力拓展蛋白质组学应用研究的边界。在此背景下，仪器信息网特别采访了布鲁克道尔顿中国区组学与制药应用经理刘先明，与他就timsTOF平台的里程碑产品技术、4D-蛋白质组学技术以及蛋白组学成像技术难点、未来发展趋势等话题进行了深入的交流。点击了解

2024年6月2-6日，全球质谱领域最具影响力之一的专业盛会--第72届美国质谱年会（ASMS）在美国加州阿纳海姆会议成功召开，该盛会吸引了世界各地的质谱工作者汇聚一堂，共话质谱未来。此次大会盛况空前，举办了超70个分会议，约有6,800名科学家出席，并展示超3,400篇研究摘要。大会设有短期培训课程、墙报、分会场口头报告等，通过多种不同的形式，科学家们分享他们的最新研究成果，揭示质谱学的前沿技术和应用。同时仪器厂商也争相展示着最新的产品技术，仪器信息网在众多企业发布的新品中，总结了热门技术产品。会议现场&bull 赛默飞Stellar&trade 对Astral的定量补充本届大会上赛默飞带来了他们的最新仪器——一款能够执行靶向验证的质谱仪。这反映了整个行业正朝着靶向检测与验证这一趋势迈进。传统意义上，高分辨率质谱仪能揭示众多潜在生物标志物，但如何有效验证这些成千上万的候选标志物一直是难以逾越的障碍。赛默飞此次发布的全新产品Thermo Scientific&trade Stellar&trade 质谱仪，正是针对这一痛点的突破性解决方案，也是赛默飞创新的又一重大里程碑。Stellar质谱仪结合了两个质量分析器，一个四极质量分析器用于前体离子选择，以及超高速双压线性离子阱质量分析器。离子集中路由多极（ICRM）同时在两个离子阱中操控离子包。同步离子管理以高灵敏度、宽动态范围和增加特异性高达140的MS2数据，使科学家能够在更短的时间内自信地将更多的候选生物标志物转化为验证阶段。提供大规模定量性能：一个小时内可以稳定地定量近10,000种肽，实现有偏差的系统生物学分析；样本通量数据提高：绝对定量更多靶向化合物，以提高定量研究能力，样本通量提高4倍；将靶向定量推向单细胞水平：利用增强的灵敏度扩展靶向通路分析的范围，同时减少样本的缺失值；大幅缩减背景干扰，增强特异性：采用快速、灵敏的全扫描同步前体离子选择 (SPS) MS3 采集克服具有挑战性的背景基质干扰；提升实验室生产率：使用各种靶向和非靶向数据采集方案，加快靶向方法的创建和实施。&bull 岛津RX系列三款新品全面升级LCMS-TQ RX系列包括LCMS-8060RX、LCMS-8050RX和LCMS-8045RX三个型号，继承岛津三重四极杆液质联用仪UFMS的特点，同时提供更高的灵敏度、稳定性和可操作性。LCMS-TQ RX系列采用创新离子源设计，提高了数据可靠性。利用在分析前自动检查仪器状态、自动执行校准(调谐)的功能，以及将待机功耗降至更低的生态模式，实现高效的实验室操作和降低环境负荷。通过RX系列的导入，制药、环境、食品和科研领域等相关实验室工作效率将进一步提升。&bull 沃特世Xevo&trade MRT新一代多反射飞行时间质谱技术沃特世推出新款Xevo&trade MRT台式质谱仪(MS) ，是在先前推出的Waters SELECT SERIES&trade MRT 质谱仪 的技术基础之上，将多反射飞行时间(MRT)技术和混合四极杆飞行时间(QTof)技术的特性以及分辨率、速度的优势整合到了这款灵活的台式仪器中。 Waters Xevo MRT台式质谱仪在100 Hz下可提供100K FWHM的分辨率和亚ppm级质量精度。Waters Xevo&trade MRT质谱仪采用新一代多反射四极杆飞行时间技术，在不影响分析性能的前提下，实现了高分辨率和高速度的完美结合。与其他品牌的同类产品相比，该系统在上限运行时可提升高达6倍分辨率以及2倍的质量精度，有助于科学家用更短的时间处理更多的样品，更好地开展大型队列生物医学研究和流行病学研究。Waters Xevo&trade MRT能够提供完整的代谢组学、脂质组学和代谢物鉴定工作流程，用户可以方便灵活地使用沃特世软件、色谱柱和仪器开展高通量分离，并与第三方软件应用程序共享通用数据。&bull 安捷伦推出运用前沿GC/MS和LC/Q-TOF技术的新产品在第72届ASMS质谱与相关专题会议上推出两款新产品。一款是Agilent 7010D三重四极杆气质联用系统，这款以食品和环境为主要目标市场的系统，可在气相色谱-质谱联用分析中展现出色的精度和灵敏度。另一款为适用于6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF系统的Agilent ExD池，旨在助力生物制药市场与生命科学研究。Agilent 7010D三重四极杆气质联用系统（7010D GC/TQ）Agilent 7010D 三重四极杆气质联用系统（7010D GC/TQ）配备全新的HES 2.0离子源，灵敏度可达阿克级。该系统内置SWARM自动调谐和早期维护反馈（EMF）等智能功能，有助于简化分析工作流程和减少计划外仪器停机。连接碰撞池的Agilent ExD池（适用于6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF）适用于6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF的Agilent ExD池可增加电子捕获解离（ECD）功能，助力肽和蛋白质表征。ECD特别适合用于研究大分子蛋白质、易损修饰和异构体残基——仅使用传统的碰撞诱导解离（CID）方法难以明确表征这些分析物。结合 6545XT 本身就有的完整蛋白质分析能力，ExD 池还适用于对较大的和高电荷的蛋白质（如抗体）以及小一些的亚基（如肽）执行“top to middle down”表征，由此生成的丰富谱图信息可使用 ExDViewer 软件进行可靠的解析。&bull SCIEX 7500+系统迄今为止SCIEX速度最快的三重四极杆质谱仪SCIEX推出了SCIEX 7500+系统，这是SCIEX定量产品组合中的最新款质谱仪，不仅可以覆盖日益复杂的基质样本，同时能确保仪器在更长时间内保持优异的性能状态。SCIEX 7500+ 系统SCIEX 7500+系统中Mass Guard技术是一项新的技术，包含主动过滤潜在污染离子的能力。它降低了仪器污染的风险和频率，特别是在处理复杂基质时，维持仪器最高灵敏度性能的时间，与现有SCIEX技术相比可提升两倍。进样组件DJet+完全可拆卸，允许前端维护，从而能够最大化系统的运行时间。SCIEX 7500+系统每秒可进行800次多反应监测（MRM），是迄今为止SCIEX速度最快的三重四极杆质谱仪。这一提升扩展了大列队化合物的应用范围和定量能力，能覆盖更多新的化合物，从而提高了实验室的整体工作效率。&bull 布鲁克新产品持续推动单细胞蛋白质组学发展在第72届ASMS会议上布鲁克宣布推出一款革命性的MALDI-TOF/TOF质谱仪，即neofleX&trade 空间成像质谱仪。neofleX&trade Imaging Profiler配备了布鲁克专利的smartbeam 3D激光器，确保了具有真实的“方形像素点”成像采集功能；配备了增强型检测器，可实现线性模式和反射模式下、持久稳定的数据采集性能。neofleX&trade 还提供TOF/TOF配置，该配置具有进一步优化设计的二级碎裂模块，能显著提高TOF/TOF的检测灵敏度、采集速度和序列覆盖度。布鲁克还宣布了一款SCiLS&trade 系列软件的扩展产品 - SCiLS&trade Scope 1.0，为neofleX&trade 结合靶标蛋白质成像的空间多组学成像流程而设计。SCiLS &trade Scope软件可处理来自靶向成像工作流程（如MALDI HiPLEX-IHC等）的OME-TIFF数据集。离子图像通过预先选定的通道色彩编码进行空间可视化分析，借助简单工具还可以实现快速图像处理和距离测量。布鲁克推出了全新的超高灵敏度 timsTOF Ultra 2 质谱系统，该系统大大提高了对微小细胞、亚细胞细胞器进行深度分析的灵敏度，并增加了样本进样量范围的灵活性。结合新的 Spectronaut 19 软件和全新的 PreOmics ENRICHplus 试剂盒，布鲁克正在建立从超高灵敏度到大规模深度血浆蛋白质组学的4D-蛋白质组学新标准。&bull 国内厂商莱伯泰科、清谱科技精彩亮相在ASMS展会上，也出现了更多的国产质谱企业，莱伯泰科旗下子公司CDS携带蛋白组学样品前处理自动化平台以及最新发明的相关耗材产品精彩亮相，向世界展示了其在生命科学领域的创新实力。在本次ASMS中，CDS展示了MiniLab蛋白组学样品前处理自动化平台、6通道EZ-Trace固相萃取装置，以及基于Empore膜技术的最新E系列蛋白消解和脱盐产品。在展台上重点介绍了CDS新开发的蛋白组学样品前处理离心小柱的性能，其高肽容量和出色的高pH分馏效果让现场观众耳目一新。清谱科技也携带最新产品在#433展位与行业分享。清谱科技通过3个口头报告、18个墙报，展示分享团队近一年取得的创新技术成果及产品研发应用进展。

沃特世公司（纽约证券交易所代码：WAT）近日在北京成功举办了以“质谱技术在蛋白表征及高级结构中应用”为主题的技术研讨会，吸引了60余位来自国家蛋白质组中心、中国食品药品检定研究院、中国科学院、清华大学、北京大学、军事医学科学院、中国农业科学院等知名高校、科研院所、分析测试平台及生物制药企业等相关领域的研究人员参加了会议。 研讨会的主旨为 “提升国内蛋白表征领域对蛋白高级结构研究的认知”，涵盖三大议题：蛋白药物深度结构表征所需要的质谱技术与生物信息学软件、氢氘交换（HDX）技术及IMS在结构生物学特别是表位学研究、蛋白质相互作用研究领域的最新进展及SONAR技术在蛋白质鉴定和非标记定量蛋白质组学研究中的进展。 会上国际知名学者、日本大阪大学副教授Susumu Uchiyama博士指出，氢氘交换质谱（HDX MS）逐渐成为蛋白质高级结构研究不可或缺的技术，并介绍了氢氘交换质谱技术及其在表位学和蛋白相互作用研究上的具体应用 。同时对其最近发表在Nature Communication上的题为《Haem-dependent dimerization of PGRMC1/sigma-2 receptor facilitates cancer proliferation and chemoresistance》论文的研究成果进行了汇报，获得了与会科研学者的一致高度评价。 日本大阪大学副教授Susumu Uchiyama博士做大会报告 沃特世（Waters）总部制药业务部高级市场拓展经理Asish Chakraborty博士对生物制药行业普遍关注的宿主蛋白残余测定进行了报告演讲，并介绍了使用通用型UPLC/MS分析对生物治疗性蛋白质中的HCP进行全面鉴定和定量。此分析方法采用在线二维液相色谱法分离多肽，然后利用高分辨率、高质量准确度的质谱仪进行蛋白质鉴定和定量。另外，Chakraborty博士对当前氢氘交换质谱方案的新进展也作了更新介绍。 沃特世公司总部Asish Chakraborty博士做大会报告 来自沃特世亚太区的高级科学家陈熙博士作了题为“非变性质谱技术及IMS行波离子淌度质谱技术在蛋白质高级结构研究上的应用进展”的精彩报告，介绍了行波离子淌度高分辨质谱技术在生物药分析上的最新应用进展，成熟的行波离子淌度分离技术为常规高分辨质谱增加了更多一个维度的分离能力，在蛋白质药物常规结构表征如二硫键错配、氢-氘交换质谱技术进行蛋白质药物高级结构和动态变化研究以及HCP(宿主细胞蛋白)残留的鉴定和定量上发挥着重要作用。 沃特世亚太区高级科学家陈熙博士做大会报告 沃特世中国应用科学家殷薛飞博士作了 “最新DIA质谱技术-SONAR在非标记定量蛋白质组学研究中的应用”的报告。殷博士介绍的 SONAR数据采集模式于今年9月发布，科学家们只需执行一次进样即可完成更准确的定性和定量分析，对复杂样品中脂质、代谢物和蛋白质的定量和鉴定，可免去采用MS/MS方法分析时通常需要额外进行方法开发的麻烦。 大会还邀请了来自美国Genentech的蛋白质化学部科学家甘雨田博士分享了她运用蛋白质组学思路进行生物药物研究开发的思路与实践，甘博士还介绍了她今年8月发表于Nature Biotechnology上的ISDetect快速自动蛋白末端质谱检测法，引起与会人员的强烈兴趣。 会议最后 ，沃特世中国生物制药高级经理宋兰坤女士作了“LC/MS平台化方案助力生物药研究开发”的报告，并对会议进行了总结。宋经理说：“质谱技术是蛋白质研究中不可取代的工具，其在蛋白质常规表征及高级结构研究中均有很好的应用方案及研究文献, 为揭示生命科学的奥秘发挥着越来越重要的作用。作为全球生物制药领域解决方案顶尖供应商，沃特世公司为生物药物产业界及蛋白质研究相关科学领域提供先进的仪器和技术。希望本次会议的议题可以激发与启迪科研工作者的思路，为生物药物产业的从业人员搭建一个学术讨论与经验分享的平台。 会议同期展出的蛋白科学研究先进生物技术墙报

大家好，本周为大家分享一篇最近发表在 Journal of the American Chemical Society上文章，Native Top-Down Mass Spectrometry with Collisionally Activated Dissociation Yields Higher-Order Structure Information for Protein Complexes1。该文章的通讯作者是美国加利福尼亚大学洛杉矶分校的Joseph A. Loo教授。非变性质谱(native MS，nMS)通常用于揭示蛋白及其复合物的分子量大小和化学结合计量比，但若要进一步阐明深层次的结构信息，则需要与串联质谱结合，即非变性自上而下质谱（nTDMS），通过对母离子进行二级甚至多级碎裂可获取额外的序列、翻译后修饰(PTMs)以及配体结合位点信息。此外，nTDMS能以构象敏感的方式断裂共价键，这样就可以从碎片模式推断出有关蛋白高级结构的信息。值得注意的是，使用的激活/解离方式会极大地影响得到的蛋白质高阶结构信息。电子捕获/转移解离(ECD、ETD或ExD)和紫外光解离(UVPD)等快加热的活化方式因其能够在保留蛋白整体结构的情况下先对共价键进行断裂而被广泛应用于nTDMS分析中。而慢加热的活化方式如碰撞活化解离(CAD)会在断键前进行能量重排，导致一些较弱的非共价相互作用先发生破坏，例如：亚基的释放和展开，因此对高阶结构表征没有帮助。而此次Joseph A. Loo课题组的研究结果显示使用基于orbitrap的高能C-trap解离(HCD)同样也可以从天然蛋白复合物的中直接获得序列信息，并且碎片模式可以提供有关其气相和溶液相高阶结构信息。此外，CAD还可以生成大量的内部碎片(即不包含N-/ C-端的片段)用于揭示蛋白质复合物的高阶结构。为了研究蛋白复合物HCD的碎裂化情况，作者比较了酵母来源的乙醇脱氢酶四聚体（ADH）在Complex-down MS (psedo-MS3)和nTDMS两种分析策略下的碎片模式。如图1所示，在Complex-down MS分析中，ADH经源内解离（ISD）释放出单个亚基，该亚基经HCD碎裂生成肽段b/y离子。而在nTDMS分析中，肽段离子则可以从复合物中直接获得。如图2（上）所示，在Complex-down MS分析中总共获得了24个b离子和18个y离子，能够实现11.8%的序列覆盖率。近乎相等数目的b、y离子表明Complex-down MS分析中释放的ADH亚基N-端和C-端均具有较高的表面可及性，即亚基发生去折叠。此外，碎片模式也揭示了N-端乙酰化、V58T突变体以及Zn2+结合位点等信息。相比之下，nTDMS分析则更反映ADH的高阶结构，如图2（下）所示，在nTDMS分析中主要检测到b离子，几乎没有亚基信号，说明b离子是直接由复合物中共价键断裂产生的。ADH的nTDMS分析共产生了60个N-端b离子和3个C-端y离子（17.6%序列覆盖率）。由HCD产生的大量N端碎片类似于ADH基于电子和光子解离技术产生的nTDMS产物。将这些片段映射到ADH的晶体结构上可以看出，N端区域比C端区域更容易暴露于溶剂，而C端区域主要形成复合物的亚基-亚基界面。ADH的碎片离子中来源亚基界面断裂的仅占8%，大部分碎裂都发生在溶剂可及的N-端。图1 Complex-down MS和nTDMS分析流程图1 Complex-down MS（上）和nTDMS（下）碎片模式比较ADH的nTDMS分析充分展现了CAD在蛋白复合物高阶结构表征上的潜力，为了进一步验证，作者还选择了其他的蛋白复合物进行实验，如醛缩酶同源四聚体、谷胱甘肽巯基转移酶A1二聚体、肌酸激酶二聚体等。这些蛋白复合物在n-CAD-TDMS分析中都产生了与结构对应的碎片离子，说明基于CAD的nTDMS分析是具有普适性。当然也会存在一些例外，膜蛋白水通道蛋白(AqpZ)同源四聚体在nTDMS分析过程中产生了高丰度的单体亚基、二聚体、三聚体信号，这应该归因于AqpZ四聚体亚基之间的弱疏水结合界面，导致亚基的释放发生在共价键断裂之前，因此产生的b/y离子无法反映蛋白复合物的空间结构。相较而言，以盐桥为主要稳定作用的蛋白复合物，如ADH、醛缩酶等则更容易在nTDMS分析中产生肽段碎片离子。此外，基于CAD的nTDMS分析中还发现了大量的内部碎片，ADH产生的大部分内部碎片来源于溶剂可及区。尽管内部碎片难以辨认，但可以大幅度提高序列覆盖率，提供更精细的结构信息。一个从小分子裂解衍生到大分子解离的假设是，在实验的时间尺度内，由碰撞引起的激活是完全随机化的，并以沿着最低能量途径引导碰撞诱导的解离。然而，这些假设没有考虑到熵的要求，缓慢重排可能是释放亚基所必须的，例如重新定位盐桥将一个亚基与其他亚基相连。在碰撞次数或每次碰撞能量不足以碰撞出能释放亚基的罕见构型的情况下，以释放出更小的多肽碎片(具有更少的约束) 代替重排可能具有更高的竞争性。总之，本文展示CAD在nTDMS分析中的应用，无需基于光子或电子的活化方式，CAD可直接从蛋白复合物中获得肽段离子，并且该碎裂离子能够反映蛋白复合物的空间结构。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：Native Top-Down Mass Spectrometry with Collisionally Activated Dissociation Yields Higher-Order Structure Information for Protein Complexes参考文献1. Lantz C, Wei B, Zhao B, et al. Native Top-Down Mass Spectrometry with Collisionally Activated Dissociation Yields Higher-Order Structure Information for Protein Complexes. J Am Chem Soc. 2022 144(48): 21826-21830.

大家好，本周为大家分享一篇发表在Accounts of Chemical Research上的综述，Native Mass Spectrometry at the Convergence of Structural Biology and Compositional Proteomics [1]，文章的通讯作者是美国西北大学的Neil L. Kelleher教授。生命活动由一系列生物大分子相互作用驱动，这些相互作用距今已进化了数十亿年。正如乙酰化和磷酸化等共价修饰可以改变蛋白质的功能一样，与金属、小分子和其他蛋白质的非共价相互作用也可以改变蛋白质的功能。然而，传统的蛋白质组学方法会分离非共价相互作用并使蛋白质变性，导致许多蛋白质水平的生物学信息尚未被发现或仅靠推断获取。就在过去的几年中，质谱(MS)技术不断发展，目前已具备维持内源性蛋白复合物完整组成并表征其特征的能力。采用非变性质谱(Native Top-Down MS, nTDMS)激活蛋白复合体，可以释放部分或全部亚基，通过与中性气体或固体表面碰撞，在进一步表征之前分离。亚单位质量、母离子质量和活化亚单位的碎片离子可以拼凑出复合物的精确分子组成，包括蛋白质修饰在内的相互作用也能被阐明，并与人类疾病状态下的功能障碍联系起来。在本综述中，作者详述了nTDMS技术目前的发展和未来在表征更大的生物复合体方面所面临的挑战。目前，nTDMS可以靶向内源性核小体复合物，而病毒颗粒、外泌体和高密度脂蛋白颗粒表征或将在未来几年内得到深度解析。为充分解决这类大小为兆到千兆道尔顿级别的复合物的表征，未来的工作将主要集中于非变性分离、单离子质谱(Single ion mass spectrometry)和新的数据类型。为了实现这一目标，Kelleher教授课题组近年来发展了一系列策略，概括为以下几个方面（1）靶向非变性质谱表征整个核小体（图1）；（2）非靶向蛋白质组学深度解析内源性蛋白质复合物；（3）单分子质谱(Single molecule MS)。其中提到，阻止对非变性蛋白质进行整体表征最大的障碍之一可能是分子量分布于100 kDa到1 MDa的复合物的分辨率较差。而电荷检测MS通过直接测量离子电荷提供大型复合物的分子分布。此外有研究表明，通过对单分辨离子进行centroiding和rebinning，Orbitrap仪器的有效分辨率可以在电荷检测工作流程之上大大提高。在这种被称为“单离子质谱法(Individual Ion Mass Spectrometry, I2MS)”的技术中，可以同时检测数千个单离子，并允许在复杂混合物中分配约500种proteoforms的质量（前提是它们先前已被表征并且在数据库中可查找）。I2MS可用于分析病毒样颗粒和AAVs（图2）。图1. 核小体表征图2. 病毒颗粒检测未来随着技术的发展和创新，nTDMS都将扩展到研究极其稀缺和高度异质的生物复合物，了解蛋白质间的相互作用以及它们是如何出错的（例如错误折叠，在功能失调的化学计量和组成中形成复合物）。这些将不仅为疾病治疗的发展提供信息，还将深化我们在分子水平上对生命的理解。撰稿：张颖编辑：李惠琳原文：Native Mass Spectrometry at the Convergence of Structural Biology and Compositional Proteomics

p　　感染性疾病的爆发与流行是我国乃至全球的公共卫生威胁，感染性疾病占全部死因的25%以上，而微生物快速准确鉴定是感染性疾病治疗的关键因素。国家卫计委关于全国食物中毒事件情况的通报中，微生物性中毒事件及中毒人数均居首位。2010年美国沙门氏菌感染、2015年肉毒杆菌污染奶粉等生物安全公共事件，都突显出致病菌的严重危害。/pp　　目前微生物国标的生化培养鉴定方法，鉴定时间超过72小时，鉴定范围在600种以内。该项目在国家重大科学仪器设备开发专项和传染病重大专项的支持下，由军事科学院牵头，中科院微生物所、国家疾控中心、301医院、302医院、毅新质谱等十几家国内知名医疗单位及机构联合，攻克离子聚焦与双场加速、脉冲延迟与例子推斥等质谱技术难题 研发了微生物全细胞蛋白组提取试剂 历时5年，经过3万株菌的蛋白组生物信息分析，开创了非线性相似性度量的人工智能算法，共同建立了超过370属、2200种、7900株的微生物蛋白指纹图数据库及全球首个微生物质谱云中心，实现了2200种微生物在培养后5分钟内快速鉴定的飞行时间质谱系统。时至今日，该数据库已经拓展至8100株，临床验证数量超过15万株。项目。该成果已在40余家医院及科研单位开展应用，获得了包含北京协和医院、解放军302医院、浙江大学附属第二医院、深圳北大医院、北大口腔医院等机构在内的一致好评，以下为部分医院发表的相关文章及用户体验。/pp　　该项目成果获发明专利4项、实用新型4项、软件著作权6项，发表论文20余篇。此次获奖，源于以下5大技术创新点。/ppimg src="http://img1.17img.cn/17img/images/201802/noimg/ba6a6a60-1e36-40a0-b1d7-e9e0320bc21e.jpg" title="001.jpg" width="650" height="406" border="0" hspace="0" vspace="0" style="width: 650px height: 406px "//ppimg src="http://img1.17img.cn/17img/images/201802/noimg/0330b28c-ee31-406e-bdfb-b5696a52f9e1.jpg" style="width: 650px height: 409px " title="002.jpg" width="650" height="409" border="0" hspace="0" vspace="0"//ppimg src="http://img1.17img.cn/17img/images/201802/noimg/24544e0d-ef9b-465e-9ac6-d2001ca5981b.jpg" style="width: 650px height: 406px " title="003.jpg" width="650" height="406" border="0" hspace="0" vspace="0"//ppimg src="http://img1.17img.cn/17img/images/201802/noimg/e9e88416-68d0-450f-b1ee-2ce1b24916e0.jpg" style="width: 650px height: 406px " title="004.jpg" width="650" height="406" border="0" hspace="0" vspace="0"//ppimg src="http://img1.17img.cn/17img/images/201802/noimg/d2ab5146-3d85-47f7-91dc-33c45d5e98bc.jpg" style="width: 650px height: 406px " title="005.jpg" width="650" height="406" border="0" hspace="0" vspace="0"//ppimg src="http://img1.17img.cn/17img/images/201802/noimg/5fc87af2-2f89-4da1-9ec1-a352ada32350.jpg" style="width: 650px height: 406px " title="006.jpg" width="650" height="406" border="0" hspace="0" vspace="0"//pp　　strong数据来源：北京科学技术奖答辩文件/strong/pp　　2月5日，北京市科学技术奖励大会隆重召开，北京市政府颁发了2017年度北京市科学技术奖。本次获奖领域涵盖纳米材料、生命科学、电子通讯、信息科学等领域，兼有原始创新、应用创新等环节。其中，由军事科学院牵头，由中科院微生物所、国家疾控中心、301医院、302医院、毅新质谱等十几家国内知名医疗单位及机构共同完成的 “2200种微生物蛋白谱数据库及飞行时间质谱鉴定系统研发及产业化”项目，喜获该奖项。/ppimg src="http://img1.17img.cn/17img/images/201802/noimg/bfb99ddb-b294-4d67-b8c9-5ca1686ab4c7.jpg" title="001.jpg" width="650" height="433" border="0" hspace="0" vspace="0" style="width: 650px height: 433px "//pp style="text-align: center "strong“2200种微生物蛋白谱数据库及飞行时间质谱鉴定系统研发及产业化”荣获北京科学技术奖/strong/pp　　北京市科学技术奖的设立，旨在奖励在本市科学技术进步活动中做出突出贡献的个人和组织，调动科学技术人员的积极性和创造性，加速本市科学技术进步，促进首都的经济建设和社会发展。 本项目的完成， 是对该项目参与单位多年来所做贡献的认可与肯定。/pp style="text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201802/noimg/2343ebb0-dad2-4ad0-ab27-eee3b166f74a.jpg" title="00.jpg" width="580" height="436" border="0" hspace="0" vspace="0" style="width: 580px height: 436px "//pp style="text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201802/noimg/f86e6cd4-3705-4b2e-b685-07ee0947c396.jpg" title="002.jpg"//pp style="text-align: center "strong中共中央政治局委员、北京市委书记蔡奇，市委副书记、市长陈吉宁，国家科技部副部长李萌等领导为获奖者颁奖/strong/ppbr//p

p style="text-align: justify "　　美国威斯康星大学麦迪逊分校的李灵军教授在《美国质谱学会杂志》上发表了题为" Faces of Mass Spectrometry”的文章。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "strong进展1：/strong/pp　　本月，李教授的团队在分析化学杂志上发表了一篇文章“HOTMAQ: A Multiplexed Absolute Quantification Method for Targeted Proteomics”。/pp style="text-align: center "img title="1111111.webp.jpg" alt="1111111.webp.jpg" src="https://img1.17img.cn/17img/images/201902/uepic/04527389-10d7-4d2c-9392-40078abb0c71.jpg"//pp style="text-align: justify "　　靶向蛋白组学中的绝对定量研究由于复杂背景下的低特异性、有限的分析通量及广泛的动态范围等诸多因素而具有挑战性。为解决这些问题,其课题组开发了一个混合offset-triggered多路复用绝对量化(HOTMAQ)方法。此方法结合了具有成本效益的质量差异和等压标签，能够在MS1前体扫描中同步构建内部标准曲线,在MS2水平上实时识别多肽,并在同步前体选择(SPS)-MS3光谱中对目标蛋白进行质量偏移触发的精确定量。这种方法将目标定量蛋白质组学的分析通量提高了12倍。采用HOTMAQ策略对临床前阿尔茨海默病候选蛋白生物标志物进行高精度验证。HOTMAQ的高通量和定量性能，加上样品的灵活性，使其广泛应用于靶向肽组学、蛋白质组学和磷蛋白组学的研究中。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "strong进展2：/strong/pp style="text-align: justify "　　清华大学欧阳证和瑕瑜教授与普渡大学学者共同在《自然通讯》上发表“Online photochemical derivatization enables comprehensive mass spectrometric analyses of unsaturated phospholipid isomers” 文章。/pp style="text-align: center "img width="600" height="304" title="22222222.webp.jpg" style="width: 600px height: 304px " alt="22222222.webp.jpg" src="https://img1.17img.cn/17img/images/201902/uepic/f219c925-a096-478e-a956-d221f5b56fbd.jpg" border="0" vspace="0"//pp style="text-align: justify "　　质谱技术是脂质结构分析的主要工具，但如何在不饱和脂质中有效定位碳碳双键(C=C)以区分C=C位异构体仍是一个难题。本文通过Paterno-Buchi反应与液相色谱-串联质谱联用在线C=C衍生化，开发了大型的脂质分析平台。这为脂质C=C位异构体提供了丰富的信息，揭示了牛肝脏中200多种不饱和甘油磷脂的C=C位，鉴定出55组C=C位异构体。通过对乳腺癌患者和2型糖尿病患者血浆样本的分析，其课题组发现C=C同分异构体的比例受个体丰度的影响较小，这说明同分异构体比例可能用于脂类生物标志物的发现。/pp /p

近日，北京大学深圳医院检验科纪玲博士团队使用融智生物的QuanTOF质谱平台再次发现新型变异血红蛋白（hemoglobin variant），即Hb-柳州，这是该团队继Hb-辽宁后发现的又一种新型变异血红蛋白。相关研究结果已经发表在Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation上，在此，小融将此篇文献进行解读分享给大家，供参考。血红蛋白（Hb）是由两对α和β珠蛋白链组成的多肽四聚体。血红蛋白变异是最常见的遗传性单基因疾病之一，以血红蛋白结构缺陷为特征。迄今为止，已有超过1350种主要由α-或β-珠蛋白基因突变引起的变异血红蛋白被记录在案，每种变体都具有特定的生物学特性。虽然大多数Hb变异杂合子是无症状的，但一些复合杂合子或纯合子会产生显著的临床症状。因此，对Hb进行产前基因鉴定和咨询具有重要意义。目前，检测血红蛋白组分及其糖化形式的最常用方法是基于阳离子交换高效液相色谱（HPLC）或毛细管电泳（CE）技术。此外，质谱（MS）已被用于分析血红蛋白变异。本文报道了用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）测定HbA1c时发现的一种新的变异血红蛋白，而基于 HPLC和CE技术的HbA1c检测程序未能确定其存在。一位来自广西柳州的23岁妇女来我院做例行检查。她的血糖结果为3.99 mmol/L（参考区间：3.90–6.10 mmol/L）。HbA1c分析最初由Variant II Turbo 2.0进行，与正常对照组相比，在展开色谱图右侧观察到异常凸起。因此，我们进一步检测了残留样本，发现了一个新的Hb变异体，用病人的出生地把它命名为Hb-柳州。使用HPLC系统、硼酸盐亲和层析系统、CE系统（HbA1c程序）和MALDI-TOF MS系统（QuanTOF，融智生物）重新分析HbA1c，用CE系统的Hb程序进行Hb分析。图. 糖化血红蛋白和血红蛋白分析。通过Variant II Turbo 2.0（A），HPLC系统（B），和CE系统（HbA1c程序）（C）检测糖化血红蛋白。血红蛋白分析是通过CE系统的Hb程序（D）。如上图所示，HbA1c结果分别为4.8%（29 mmol/mol，Variant II Turbo 2.0）、4.7%（28 mmol/mol，硼酸盐亲和层析系统）、4.2%（22 mmol/mol，HPLC系统）和4.6%（27 mmol/mol，CE系统）。上述HbA1c技术均未检测到异常峰值。血红蛋白分析也显示97.7%HbA和2.3%HbA2没有异常。图. MALDI-TOF MS（QuanTOF）血红蛋白分析。（A）非变异样品的质谱图显示α-链（15127 Da）、β-链（15868 Da）以及相应的糖基化α-链（15289 Da）和糖基化β-链（16030 Da）。（B） Hb-柳州的质谱图显示一个变异的α-链峰（15155Da）。QuanTOF检测的HbA1c值为4.8%（29 mmol/mol）。同时，在质谱图中发现了质量为15155da的变异链，变异链占总α链的26.4%。基因分析证实了QuanTOF的检测结果。通过Sanger测序发现在HBA1基因上存在一个新的杂合突变[HBA1:C.182A→G]，该突变导致密码子60处的编码从赖氨酸（分子量：146 Da）改变为精氨酸（分子量：174Da）。该结果与QuanTOF的检测结果一致。图.Hb-柳州Sanger序列测定结果。箭头表示杂合突变[HBA1:C.182A→G] 在HBA1基因中。该研究发现了一个新的变异株Hb-柳州，用MALDI-TOF MS代替传统的阳离子交换HPLC和CE的HbA1c检测方法，可以很容易地鉴别出是否存在Hb-柳州。研究结果表明，阳离子交换HPLC和CE法在检测新的血红蛋白变异方面面临挑战。然而，MALDI-TOF MS通过正常和变异链之间足够的质量差可以检测到变异链，可以作为鉴别和定量变异血红蛋白（hemoglobin variant）的选择方法。参考文献：Anping Xu, Weidong Chen, Weijie Xie & Ling Ji (2020): Identification of a new hemoglobin variant Hb Liuzhou [HBA1:C.182A→G] by MALDI-TOF mass spectrometry during HbA1c measurement, Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation, DOI:10.1080/00365513.2020.1783698

p　　span style="font-family: 楷体,楷体_GB2312, SimKai "回顾2017年，基于质谱的临床研究有一项突破性发现。普渡大学陶纬国教授团队在2017年3月20日的《美国国家科学院院刊》(PNAS)杂志上发表文章称，他们从人体血液中发现2400多种磷酸化蛋白。该发现首次证明了磷酸化蛋白可以作为基于液体活检的疾病标志物，能用于对癌症等重大疾病更早、更精准的非侵入性诊断，为 “液体活检”提供了全新的检测维度。近日，仪器信息网专访了陶纬国。/span/pp style="text-align: center "img title="1.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201801/insimg/a21a903c-0479-4776-9e2a-5b5c719f76fc.jpg"//pp style="text-align: center "strong普渡大学 陶纬国教授/strong/pp　　span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong磷酸化蛋白突破性发现/strong/span/pp　　通过液体活检来诊断肿瘤和癌症等疾病一直是临床科学家关注的焦点，研究对象多集中在循环肿瘤细胞(CTC)和循环肿瘤DNA(ctDNA)，但是二者都有局限性：由于CTC在血清中的浓度非常低，取少量血液对其检测难度很大 癌症有很多基因突变，而这些突变不一定会显现出来，因此基于ctDNA进行的液体活检的诊断结果只能预测患病的概率，并不能确诊。/pp　　蛋白质磷酸化是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本，最普遍，也是最重要的机制，同时，与许多疾病的发生密切相关。在众多肿瘤致病机理中，当前学术界对蛋白质磷酸化机理的研究最为清楚，80%-90%的癌症都跟蛋白质磷酸化有关。因此，许多抗肿瘤药物的研制都着眼于磷酸化蛋白。理论上，磷酸化蛋白作为相关基因突变的表达，在临床上能够帮助医生做出更明确的诊断。但是，有关基于液体活检的磷酸化蛋白研究还很少。此前，有个别报道在血液中发现几十种磷酸化蛋白，均是高丰度蛋白，生物学意义不大。“原因就是磷酸化蛋白一旦从细胞进入血液中就被肝脏分泌的磷酸酶水解了。”陶纬国解释说，“所以虽然磷酸化蛋白跟癌症关系非常密切，但人们无法对其进行检测。”/pp　　陶纬国团队是如何从人体血液中检测到大量磷酸化蛋白的呢?这要从三年前的一篇文献报道说起，当时陶纬国从这篇文章中了解到外泌体和微囊的结构，“当我看到类似于纳米微粒的外泌体、微囊结构时，我认为可能会有磷酸化蛋白被包裹在外泌体中，然后进入血液。如果真是这样，被外泌体包裹的磷酸化蛋白可能会避免被血液中的磷酸酶水解。”于是陶纬国团队对血液中的外泌体、微囊进行了超速离心分离、提取，然后用质谱进行检测。一周以后，实验结果让所有人都惊呆了，他们从中发现了几千个磷酸化蛋白。这个突破性的发现使得临床科学家们今后可以在1毫升血浆里找到几千个磷酸化的位点，并从中筛选出不同疾病的生物标志物。之后，陶纬国团队对乳腺癌病人血清中的磷酸化蛋白做了研究，发现乳腺癌病人体内的磷酸化蛋白与其病症密切相关。/pp　　那么，磷酸化蛋白液体活检何时能够应用临床呢?陶纬国回答说：“虽然现在还不好断言，但我认为3-5年内都有可能。”他进一步解释，随着质谱技术的显著提升，一些原来检测不到的生物标志物现在能够检测了，后面的工作主要是考察重复性有多好，假阳性有多低。/pp　　谈及未来的工作，陶纬国表示，一方面会继续做乳腺癌的磷酸化蛋白生物标志物确认的工作 另一方面也会做其他疾病磷酸化蛋白生物标志物找筛的工作，“还有很多其它疾病，比如阿尔茨海默病、帕金森综合征等，也都是蛋白磷酸化有关。”/pp　　span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong质谱用于生物大分子检测的思考/strong/span/pp　　陶纬国教授做蛋白组学研究至今已有十几年，用到的研究工具主要是质谱。在攻读博士期间，陶纬国师从普渡大学著名质谱专家Graham Cooks教授。博士毕业后，陶纬国加入了西雅图系统生物研究所，在Leroy Hood教授(自动DNA测序仪发明人)和Ruedi Aebersold教授(著名蛋白质组学专家)课题组继续博士后研究。从那时起，陶纬国就开始了他的磷酸化蛋白质组学检测的研究，“重回普渡教书以后，我的工作基本上是围绕着怎么去提高磷酸化蛋白分析手段来开展的。质谱在我的工作扮演着中心角色，包括方法开发，蛋白生物标志物早筛，全靠质谱来做。”首先是早筛，用质谱(Orbitrap)筛选出相关的生物标志物(磷酸化蛋白) 然后对病人的样本进行检测，用统计学的方法对检测结果进行分类 最后，分析统计学上有意义的、跟病人相关的磷酸化蛋白。/pp　　在过去二三十年里，质谱在生物大分子检测方面有几个重要的技术突破。首先，80年代末90年代初， ESI和MALDI的出现，使质谱能够用于分析生物样品 第二，近十几年来，高分辨质谱的飞跃发展，大大提升生物大分子的分析效率。“我读博士后时(2002年)，很多仪器还是低分辨的，生物样品还是挺难做的，做完一个磷酸化的蛋白，单是数据库检索就要三天，而且，相对来说，得到的数据假阳性高。现在的高分辨质谱解谱很容易，差不多半个小时就够了，假阳性也降低很多。”此外，陶纬国还说到，“UPLC与质谱的结合在技术上是很大的进步，使色谱的分离效率赶上了质谱的速度，现在一个小时能检测到几千个蛋白，非常快。”/pp　　同时，陶纬国也指出了目前利用质谱来检测生物大分子的难点。第一，生物样品基体复杂。“像我们实验室做磷酸化蛋白，它本身丰度就很低，假如样本不经过任何分离的话，谱图上将会只能看到高丰度蛋白。”第二，质谱检测假阳性比较高。“其实还是需要统计学算法方面的开发，来解决假阳性率高的问题，这也是现在很多质谱开发者在做的工作。”/pp　　现如今质谱产品更新迭代非常快，对于质谱工作者来说，是好，也是坏。“新产品的确扫描速度更快了，精度更高。但是，也给质谱工作者带来了不小的压力。特别是像我们这种使用高分辨大仪器的，没有那么多钱换来换去。可是如果你想要紧跟前沿，这些新仪器又十分必要。”陶纬国说，这是目前质谱工作者普遍面临的两难境地。/pp　　span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong整合临床大数据/strong/span/pp　　2017年，陶纬国作为海外高层次人才被东南大学引进回国。谈及回国的初衷，陶纬国表示，国内拥有更多、更丰富的病人样本，这是他选择回国的原因之一。此外，国内对于高分辨质谱等大型仪器的投入力度也更大，有助于前沿研究的开展。谈到选择东南大学的原因，陶纬国说到：“东南大学的生物医学工程学院有转化医学，有生物，然后又有工程，包括产业化，比较适合我。”/pp　　现在国内，整合医学大数据来服务大健康的概念很热，“在全国，包括南京，都已经有相关工作在开展”。从临床检测这个角度来说，陶纬国希望找到办法来整合DNA检测，microRNA检测，磷酸化蛋白检测几个维度的数据，从而获得更为精准的临床诊断结果。“比如检测一个肿瘤，通过对DNA、mRNA、磷酸化蛋白、糖基检测多维度数据的不断积累，数据会越来越多，结合人工智能、计算机算法，检测结果会越来越精准。 我回来能赶上这个机会也是不容易。”陶纬国如是说到。/pp　　目前，医学大数据的采集方式主要为第二代、第三代测序。“但是，质谱也是很重要的一块儿。”陶纬国指出，“比如乳腺癌，基因突变仅仅代表一种患病的可能性，但是到底有没有癌症还是要通过蛋白检测来确定，所以用质谱来检测蛋白的存在、活性、功能，比基因层面更可靠。所以，质谱检测肯定会慢慢跟上来。”/pp　　陶纬国在东南大学生物医学工程学院的新实验室是电子生物国家重点实验室。对于自己的工作重心，陶纬国表示，现在是过渡时期，未来会逐步将重心转至国内。“国内实验室刚刚开始，看起来前途光明。”/pp　span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong　热衷学界公益事务 出任CASMS主席/strong/span/pp　　作为质谱生物大分子检测方面的专家，陶纬国于2017年6月份当选北美华人质谱学会(CASMS)主席。该学会汇聚了众多顶尖的华人质谱学者，已经成为质谱学界重要的华人力量。在一年一度的“美国质谱年会(ASMS)”期间举行“北美华人质谱学术会议”已经成为CASMS的传统。据陶纬国介绍，CASMS已有二三十年的历史，目前注册人数在800人左右，覆盖了北美地区绝大部分优秀的华人质谱学者。ASMS每年参会人数6000-7000人，相当一部分是华人，中国面孔越来越多。“在美国，有很多华人学者做了非常出色的工作，但他们并没有获得相匹配的影响力和威望。” 陶纬国说，“我们学会的宗旨就是提升华人质谱学者在世界质谱领域的影响力。当然， 中国本身的国际地位的重要性是显而易见的。”/pp　　CASMS的另一个宗旨是促进世界华人质谱界的互相交流。每两年召开一次的“世界华人质谱学术研讨会”是全世界华人的质谱盛会，汇聚了中国内地、台湾、香港、新加坡和北美地区的质谱学者，CASMS是该会议4个主办方之一。2016年，CASMS主办了第六届“世界华人质谱学术研讨会”，这是该会议首次在美国召开，恰逢该会议召开十周年。“我认为非常有意义，促进了两岸三地华人质谱学者的交流合作。我的亲身体会是通过这个会议结识了很多优秀学者，而在此前很多同仁相互间是不认识的。”/pp　　未来，除了重要的线下会议组织工作，陶纬国希望通过加强线上日常交流，来使学会内部联系更为紧密。/pp　　span style="font-family: 楷体,楷体_GB2312, SimKai "strong后记：/strong临床质谱技术被认为是医学诊断的下一个“基因测序”，应用前景被普遍看好。质谱用于临床检验具有灵敏度高、特异性高、重现性好的优点，可在临床多个领域对传统诊断方法学进行替代。陶纬国教授团队的磷酸化蛋白研究进一步提升了临床质谱应用的含金量。基于该研究，临床科学家们将会找到更多可靠的疾病标志物，从而实现癌症等重大疾病的早期发现和精准诊断。/span/pp style="text-align: right "采访编辑：李博/p

质谱流式细胞术可在数百万个单细胞中同时采样并量化分析50多种蛋白质或蛋白质修饰水平。应用质谱流式可从全新的角度判别细胞种类、细胞表型，评估其功能状态和异质性以研究疾病发生和发展的机制。然而，作为一种新兴单细胞蛋白组方法，质谱流式因其技术特性也存有一些功能上的不足之处。目前该技术最大的瓶颈在于其灵敏度的极限，在单细胞中的每种抗原表位需要累积上百个金属标签标记的抗体才可在质谱流式分析中检测到特异性信号。灵敏度不足的问题，使得一些在人类疾病中至关重要的低丰度蛋白，如大量的转录因子、一部分细胞表面受体蛋白以及某些与特定功能相关的磷酸化位点难以被准确分析。在对小体积细胞，例如免疫细胞和微生物细胞的研究中，质谱流式在技术上则更具挑战性。而之前在多个不同实验室进行的放大质谱流式信号的尝试由于信噪比低、放大效果不强、可控性差等问题并没有获得显著效果。如何在不影响信噪比的情况下对质谱流式进行信号放大是一直以来亟待解决的问题。2024年7月29日，哈佛大学Wyss研究所尹鹏教授团队（伦小康博士、盛宽玮博士为共同第一作者）等在 Nature Biotechnology 期刊发表了题为：Signal amplification by cyclic extension enables high-sensitivity single-cell mass cytometry 的研究论文。该研究开发了一种名为循环延伸扩增（Amplification by Cyclic Extension，ACE）的信号放大技术，通过设计DNA动态探针实现对质谱流式技术（mass cytometry）中抗原表位金属同位素标记信号的高效放大，解决了质谱流式分析中的灵敏度瓶颈问题。ACE技术可同时放大30种以上蛋白表位信号。应用在悬浮质谱流式和成像质谱流式（imaging mass cytometry或IMC）中，ACE皆可大幅提升低丰度蛋白信号检测的灵敏度及准确性。在这项最新研究中，研究团队运用独特的DNA动态探针设计方法，创立了单链DNA循环延伸信号放大（Amplification by Cyclic Primer Extension，ACE）技术，实现了同时对多通道抗原表位信号的高信噪比高效放大，并应用于质谱流式技术上以大幅提高其灵敏度。ACE利用超短DNA序列作为起始探针（initiator）标记抗体并对胞内靶蛋白进行染色（图1）。在低温条件下，反应体系内的延伸探针（extender，含有两个相邻的起始探针互补序列）可互补结合在起始探针上，体系中的DNA聚合酶应用延伸探针为模版延长起始探针。提高体系温度后，延伸探针从延长过起始探针上解离，此时一个反应循环结束。当体系温度再次降低时，下一个延伸循环开始，起始探针进一步被延长。通过对起始探针序列的温控循环延伸，ACE可快速复制金属检测探针（detector）结合位点，引入检测探针后，单个抗体所携带的金属同位素标记物数量大幅提升。为提升DNA结构的热稳定性，该团队又结合3-cyanovinylcarbazole phosphoramidite (CNVK) 紫外交联方法将携带金属标记的检测探针共价结合在延伸后的起始探针上，使得检测探针在质谱流式仪内高温环境中不易解离（图1）。线型ACE（linear ACE）信号放大技术可平均提升信号13倍（图2）。但当分析极低丰度蛋白的单细胞信号或微生物单细胞蛋白信号需要更强信号时，可在线型ACE基础上应用分支ACE（branching ACE）以达到对抗原信号的500倍以上的放大。为配合质谱流式多维度蛋白表位分析特点，该团队通过设计正交DNA探针序列实现了对33种蛋白表位互不干扰的同时信号放大。图1. ACE技术流程示意图图2. 应用ACE逐级提高质谱流式抗原表位信号ACE技术建立后，研究团队首先将其应用与分析上皮-间质转化（EMT）和间质-上皮转化（MET）过程中的分子调控机制。通过对32个上皮和间质标记物、信号分子和转录因子的单细胞分析，将单个小鼠乳腺癌细胞从上皮状态到间质状态再回到上皮状态的转化过程进行时间重构，精准的展示细胞如何通过调节关键转录因子如Zeb-1和Snail/Slug的数量变化来驱动了EMT和MET分子程序。在第二个应用中，团队聚焦于单个T细胞胞内磷酸化信号网络。由于T细胞体积较小，在单细胞分辨率下每种磷酸化位点的表位数量有限，所以此前针对单个T细胞信号网络反应异质性的研究一直较难开展。团队应用ACE同时放大T细胞受体（TCR）信号网络内的30种关键磷酸化位点（图3），研究样本中T细胞在受到外部信号刺激时的胞内磷酸化网络特异性激活状态是如何分别调控介导应激、炎症、细胞增殖等反应的。应用该技术，团队分析了“组织损伤诱导T细胞麻痹”的分子信号机理，利用从手术患者获取的“术后引流液”（POF）样本刺激T细胞，并捕捉TCR信号网络的动态特征，揭示出导致部分CD4+ T细胞停止分裂并引起免疫抑制的胞内信号网络变化。图3. 应用ACE技术分析T细胞胞内信号网络动态变化最后，团队使用ACE结合成像质谱流式（Imaging mass cytometry，IMC）对人体肾脏组织切片中的蛋白表位进行高维度空间分析。通过检查从一名多囊肾病患者获得的肾皮质切片并对经信号放大后的20种肾脏标记物的空间表位分析，团队发现了存在于肾皮质部位细胞和组织结构的新病理特征：与组织修复相关的干细胞标记物Nestin在肾小球中的不均匀表达可能意味着组织的不同部位可能同时经历不同的病理阶段。ACE质谱流式信号放大技术是单细胞蛋白分析中一项革命性的突破。这套独特的生物技术在生物医学的各个层面都有着广泛的应用前景，尤其可将单细胞高维蛋白表位定量分析扩展到之前由于技术限制而从未涉及到的低丰度蛋白组。另外，结合成像质谱流式IMC，可在未来实现基于ACE信号放大的超分辨率空间蛋白组学成像分析。

近年来，随着人们对医疗健康行业需求的不断增长，生物制药行业也在随之蓬勃发展。近两年的新冠疫情quan球大流行，在改变人们日常生活的同时更是催生了生物制药行业对于先进分析技术的需求。蛋白质分离、纯化和分析是生物zhi疗药物开发中的关键组成部分，但该过程可能复杂且极具挑战性。而全柱成像等电毛细管电泳（whole column imaged capillary isoelectric focusing, WC-iCIEF）技术，可以根据蛋白质的等电点（isoelectric point, pI）差异将其分离，在此基础上，将iCIEF与高分辨质谱联用，可以借助质谱的高灵敏度、高分辨率和高质量精度使各种蛋白质变异体的鉴定更容易、更准确。从2021年6月开始，我们与蛋白质成像技术专家 Advanced Electrophoresis Solutions Ltd (AES)宣布达成协议，将蛋白质分离技术与质谱相结合，通过简化表征来推进zhi疗性蛋白质药物的开发。 到目前为止，通过将iCIEF技术与高分辨质谱联合使用，我们已经对单抗、ADC和融合蛋白等多种产品进行了各种层面的表征。下图1~3展示了iCIEF技术对单抗\ADC\融合蛋白的分离结果，可见对于不同种类的重组生物zhi疗性产品，均可根据pI差异将其电荷变异体进行分离，且系统具有优异的稳定性与重现性。图1 iCIEF-UV分析帕博利珠单抗电荷变异体，8针平行进样（点击查看大图）图2 iCIEF-UV分析恩美曲妥珠电荷变异体，3针平行进样图3 iCIEF-UV分析依那西普电荷变异体，3针平行进样我们使用的CEInfinite iCIEF平台（AES）除了高质量的iCIEF-UV功能外，还可以与高分辨质谱直接在线串联，直接测定电荷变异体的分子量，无需额外转换接口。下图4展示了我们使用iCIEF-MS直连技术分析帕博利珠单抗的结果，可见即使是pI仅差0.02的碱峰B1和主峰，也可以在iCIEF上得到基线分离，随后的高分辨质谱分子量测定结果显示该碱峰与主峰相比，主要差异是其中一条重链的N端未发生焦谷氨酸环化。另外观察原始质谱谱图不难发现，得益于Orbitrap高分辨质谱的灵敏度，即使是强度比主峰低2~3个数量级的碱峰B3，仍可得到糖型分布清晰的谱图。图4 iCIEF-MS在线直联分析帕博利珠电荷变异体。上，iCIEF-UV分离图谱。中，碱峰B1与主峰解卷积结果镜像图对此。下，主峰与所有碱峰原始质谱图对比。（点击查看大图） 与市面上其他供应商相比，AES的CEInfinite iCIEF平台具有一个独特优势：可以实现全自动的馏分收集。我们选择了帕博利珠单抗，对其电荷变异体的每个峰离线收集后进行酶解，随后上样至高分辨液质联用平台进行肽图分析。图5展示了酸/碱峰中各种CQA含量的变化，可见轻重链末端、重链糖型和侧链常见PTM的变化趋势。另外通过表1中分离之前/之后特定CQA含量对比可以很明显的发现，经iCIEF分离后，酸/碱峰中特定修饰的比率有明显zhen高，可见基于pI差异，将生物zhi疗性产品的电荷变异体进行分离后，接下来采用肽图进行深入表征的分析策略，能够帮助研究人员将导致电荷异质性的修饰精确定位到氨基酸位点的层面。

近年来，随着人们对医疗健康行业需求的不断增长，生物制药行业也在随之蓬勃发展。近两年的新冠疫情全球大流行，在改变人们日常生活的同时更是催生了生物制药行业对于先进分析技术的需求。蛋白质分离、纯化和分析是生物治疗药物开发中的关键组成部分，但该过程可能复杂且极具挑战性。而全柱成像等电毛细管电泳（whole column imaged capillary isoelectric focusing, WC-iCIEF）技术，可以根据蛋白质的等电点（isoelectric point, pI）差异将其分离，在此基础上，将iCIEF与高分辨质谱联用，可以借助质谱的高灵敏度、高分辨率和高质量精度使各种蛋白质变异体的鉴定更容易、更准确。从2021年6月开始，我们与蛋白质成像技术专家 Advanced Electrophoresis Solutions Ltd (AES)宣布达成协议，将蛋白质分离技术与质谱相结合，通过简化表征来推进治疗性蛋白质药物的开发。到目前为止，通过将iCIEF技术与高分辨质谱联合使用，我们已经对单抗、ADC和融合蛋白等多种产品进行了各种层面的表征。下图1~3展示了iCIEF技术对单抗\ADC\融合蛋白的分离结果，可见对于不同种类的重组生物治疗性产品，均可根据pI差异将其电荷变异体进行分离，且系统具有优异的稳定性与重现性。图1 iCIEF-UV分析帕博利珠单抗电荷变异体，8针平行进样（点击查看大图）图2 iCIEF-UV分析恩美曲妥珠电荷变异体，3针平行进样（点击查看大图）图3 iCIEF-UV分析依那西普电荷变异体，3针平行进样（点击查看大图）滑动查看更多我们使用的CEInfinite iCIEF平台（AES）除了高质量的iCIEF-UV功能外，还可以与高分辨质谱直接在线串联，直接测定电荷变异体的分子量，无需额外转换接口。下图4展示了我们使用iCIEF-MS直连技术分析帕博利珠单抗的结果，可见即使是pI仅差0.02的碱峰B1和主峰，也可以在iCIEF上得到基线分离，随后的高分辨质谱分子量测定结果显示该碱峰与主峰相比，主要差异是其中一条重链的N端未发生焦谷氨酸环化。另外观察原始质谱谱图不难发现，得益于Orbitrap高分辨质谱的灵敏度，即使是强度比主峰低2~3个数量级的碱峰B3，仍可得到糖型分布清晰的谱图。图4 iCIEF-MS在线直联分析帕博利珠电荷变异体。上，iCIEF-UV分离图谱。中，碱峰B1与主峰解卷积结果镜像图对此。下，主峰与所有碱峰原始质谱图对比。（点击查看大图）与市面上其他供应商相比，AES的CEInfinite iCIEF平台具有一个独特优势：可以实现全自动的馏分收集。我们选择了帕博利珠单抗，对其电荷变异体的每个峰离线收集后进行酶解，随后上样至高分辨液质联用平台进行肽图分析。图5展示了酸/碱峰中各种CQA含量的变化，可见轻重链末端、重链糖型和侧链常见PTM的变化趋势。另外通过表1中分离之前/之后特定CQA含量对比可以很明显的发现，经iCIEF分离后，酸/碱峰中特定修饰的比率有明显增高，可见基于pI差异，将生物治疗性产品的电荷变异体进行分离后，接下来采用肽图进行深入表征的分析策略，能够帮助研究人员将导致电荷异质性的修饰精确定位到氨基酸位点的层面。图5 iCIEF-MS离线收集馏分，酶解肽图分析酸/碱峰中各种CQA含量的变化。上，末端修饰变化。中，重链糖基化修饰变化。下，侧链修饰变化（点击查看大图）表1 iCIEF分离前/后特定CQA含量变化情况对比（点击查看大图）这部分工作已经在2021年的美国质谱年会上发表，有兴趣的读者扫描一下二维码下载原文：在精zhun医疗概念兴起的推动下，对生物治疗性产品表征的需求不断增长，将高分辨质谱与基于电荷异质性的iCIEF蛋白质分离技术相结合，将支持我们的客户实现更精确的分析，在持续开发生物治疗性产品的进程中发挥重要作用。如需合作转载本文，请文末留言

云检医学集团（以下简称“云检医学”）宣布，阿斯利康中金医疗产业基金完成对公司B1轮的独家投资。本轮融资主要用于进一步扩充公司妇幼产品线及癌症检测产品研发管线，并持续推进各产品线在中美两地的注册生产、商业化落地和国际市场的开拓。云检医学是新一代基于蛋白和代谢组学标记物发现技术的平台公司。自2015年成立以来，公司建立了独特的由医学假设驱动，基于质谱蛋白组学与大数据驱动的分析平台，缩短了传统方法发现疾病标记物的周期，并根据标记物特点适配相应的临床诊断平台，实现了快速产品化的闭环路径。目前，公司正在中美日等地快速推进女性及孕期健康、儿童罕见疾病检测，癌症精准诊断和复发监测和代谢类疾病创新检测领域IVD/LDT产品的注册和商业化。云检医学的平台技术创新来源于斯坦福大学医学院背景的研发团队逾19年的积累。创始团队具有在药物开发、疾病生物标志物发现、临床转化和诊断、大数据疾病模型和数据安全等领域丰富的经验。目前，公司已在美国马里兰州、加州、上海、天津、成都等地建立中美双研发中心和GMP工厂，并在马里兰州拥有由美国病理学家学会和美国临床实验室委员会双认证的CAP/CLIA临床实验室。同时，天津云检医学检验实验室取得了国内医疗机构执业许可证，通过双盲对比实验，相关检测项目达到CAP 同等的检测质量水平。在刚刚结束的无锡太湖湾生命健康未来大会上，云检医学宣布与阿斯利康在蛋白质组学和代谢组学领域开展探索性研究合作，包括但不限于基于质谱靶向技术检测药物开发中常见的创新药物靶点。云检医学将为阿斯利康提供质谱驱动的创新药物开发伴随诊断检测，助力精准确定更有效的患者群体和优化临床试验方案。云检医学联合创始人兼首席执行官陈利民先生表示：“作为一家以创新为驱动内核的高科技企业，云检医学始终致力于严肃医疗领域为临床、为患者提供更好的医疗产品和服务。云检医学依托斯坦福大学团队的技术积累和在海外成功运营经验，已经构建了深厚的技术基础和丰富的产品管线，致力于在全球范围内提供妇幼及癌症筛查检测跟踪解决方案。站在新始点，云检医学不仅追求商业化的成果，更致力于探索和实践‘人工智能+多组学检测’的中国路线，让各管线产品融入‘健康中国行动’的大战略。衷心感谢阿斯利康对云检医学的信任和支持，我们希望与投资人以及合作伙伴携手前行，共同成长。”云检医学完成B1轮融资，推进质谱蛋白组学与大数据驱动开发平台阿斯利康中金医疗产业基金董事总经理，阿斯利康中国副总裁、战略合作与业务发展部负责人陈冰先生表示：“尽管质谱平台已在海外科研领域成功商用多年，其在中国临床诊断领域的应用大多限制在传统标志物，市场渗透率也受制复杂的前处理流程。云检医学基于其在组学数据和疾病模型领域的多年积累，搭建的‘质谱蛋白组学与大数据驱动的开发平台’使传统的科研型质谱平台重新焕发了生命力。云检医学美国研发团队已与阿斯利康全球转化医学团队多次合作，我们对公司与阿斯利康中国即将开展的探索性研究合作非常期待。“中金资本总裁，阿斯利康中金医疗产业基金执行事务合伙人委派代表单俊葆先生表示：“云检医学拥有先进的技术、强有力的团队和丰富的产品管线。公司发展至今，已有足够的能力为临床提供精准可及的多种解决方案。我们相信，在科学家团队的带领下，公司将持续引领‘人工智能+多组学检测’行业的发展，造福更多的肿瘤、妇幼等多疾病领域的患者。我们相信云检的国际视野，学术前瞻性，和研发实力将为临床源源不断输出更多更好的诊断工具，使更多患者受益。非常荣幸参与本轮融资，我们将充分调动基金的产融资源，全方位支持公司未来的发展。”关于阿斯利康中金医疗产业基金阿斯利康中金医疗产业基金是由阿斯利康与中金资本联合发起，专注于医疗健康产业投资的私募基金。融合阿斯利康全球的产业优势以及中金资本丰富的资本运作经验，基金聚焦于生物医药、医疗器械、诊断服务、数字医疗等投资领域，致力于汇聚产融资源，为企业及投资伙伴提供双向全周期赋能，共同助力中国医疗健康产业创新发展。

大家好，本周为大家分享一篇本课题组发表在Journal of Pharmaceutical Analysis上的文章，Integrated top-down and bottom-up proteomics mass spectrometry for the characterization of endogenous ribosomal protein heterogeneity [1]，文章的通讯作者是中山大学药学院的李惠琳教授。　　蛋白质的合成过程是生物体内最重要的生命活动之一。在细胞中，核糖体是信使RNA翻译合成蛋白质的细胞机器。核糖体高度复杂，它主要由特化的RNA和几十个蛋白组成。这些蛋白和RNA组装成两个不同大小的核糖体亚基即大亚基和小亚基。近年来，多项研究表明，核糖体与多种疾病的发生密切相关，包括恶性肿瘤、阿尔兹海默病和帕金森病等，这些过程中除发生rRNA合成异常和核糖体蛋白表达失调外，还伴有核糖体蛋白基因突变、RNA剪切、翻译后修饰(PTMs)变化所形成的核糖体蛋白异质体(proteoforms)的异常表达和调节。本文中，作者整合了Top-down及Bottom-up蛋白质组学质谱全面表征了核糖体蛋白异质性，为发现疾病特异型proteoform生物标志物或靶点提供了方法。　　首先，作者采用E.coli 70S核糖体在Waters SYNAPT G2-Si MS仪器上建立了Top-down检测方法(图1)。50S核糖体大亚基蛋白质L7和L12具有相同序列，其差别在于L7在N-端含有乙酰化修饰而L12无N-端非乙酰化修饰。实验发现，L7和L12在Top-down分析中取得了良好的分离，并且L7和L12的峰放大图显示二者除含有其对应野生型外，它们都具有甲基化的proteoforms，而Bottom-up仅能检测到甲基化的肽段(图2)。L7/L12在蛋白质生物合成过程中参与和翻译因子的相互作用，是肽链终止所必需的。L7/L12发生异常会降低蛋白质的合成速度和准确性。本研究中，作者采用Top-down方法对L7/L12的PTMs和proteoforms进行了全面分析，并结合Bottom-up定位了甲基化位点。同时，该结果也反映出Bottom-up方法固有的缺陷，即从小肽推断出的有限的序列信息往往不足以鉴别proteoforms。　　图1. Top-down和Bottom-up蛋白质组学表征E.coli 70S核糖体总览　　图2. Top-down和Bottom-up蛋白质组学表征E.coli 50S核糖体亚基蛋白质L7/L12　　随后，作者采用建立好的方法分析了HeLa 80S核糖体蛋白。如图3A所示，实验检测到大量Methionine剪切伴随的N-端乙酰化、40S RP S10和S25上的二甲基化、40S RP S23上的hydroxyproline、60S RP L8上的hydroxyhistidine、乙酰化和甲基化等多种修饰。值得关注的是，Top-down结果显示多种蛋白存在截短型的truncated proteoforms。分子完整性是保证蛋白质生物学功能的重要因素之一。分子完整性的缺失，特别是由于选择性剪接或蛋白质水解而导致的截短，已成为一个重要的问题。作者在排除蛋白质提取过程造成的影响、色谱柱上酶切和质谱源内裂解等因素后，认为截短型的proteoforms很大程度上与生物过程相关。RP L19是一个从60S亚基突出并跨越到40S亚基的长螺旋蛋白质，L19的C端螺旋在pre-translocation状态下扭结，在亚基旋转时动态地改变构象，在post-translocation状态下变为线性(图3B)。这种构象转变导致蛋白质L19带正电的Arg172和Arg176侧链与18S rRNA核苷酸G909和G910的磷酸根之间形成盐桥。本文中，作者观察到C端部分序列缺失的截断型L19。除此之外，其他截短型的蛋白质如图C所示。目前研究发现，核糖体蛋白质除了在细胞翻译和蛋白质合成中发挥核心作用外，还具有核糖体外功能，参与细胞增殖、分化、凋亡、DNA修复、调节细胞迁移和侵袭等细胞过程。以截短型形式观察到的许多核糖体蛋白，都与血液、代谢、心血管疾病和癌症的发展与进展有关，核糖体蛋白proteoforms的全面表征为发现潜在疾病生物标志物或靶点提供了前题条件。　　图3. 利用Top-down蛋白质组学方法鉴定HeLa 80S核糖体蛋白质PTM及proteoforms　　总的来说，本文整合了Top-down及Bottom-up蛋白质组学质谱方法，全面表征了E.coli 70S核糖体和HeLa 80S核糖体蛋白质。尽管这些proteoforms和疾病的相关性还需要深入挖掘，但实验提供了一种先进的方法来确定疾病特异性proteoforms或靶点。

p　　近日，英国皇家学会院士、美国科学院外籍院士、英国皇家化学会候任主席、牛津大学Doctor Lee冠名教授Carol Robinson教授在上海交通大学做客第95期大师讲坛，为交大师生带来题为“Mass spectrometry-from folding proteins to rotating motors”的精彩报告。/pp style="text-align: center "img width="350" height="473" title="001.jpg" style="width: 350px height: 473px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/9c5b334e-bdec-4b44-ae4d-2e6ca2dbdf7e.jpg" border="0" vspace="0" hspace="0"//pp　　质谱分析是目前蛋白质研究的最重要工具之一。Carol Robinson教授介绍了质谱的原理和自己探寻质谱研究的历程，阐述了她领导的团队在strong质谱技术优化和应用质谱分析百万道尔顿级膜蛋白研究方面的进展/strong。关于质谱在生物领域的应用，她介绍了2002年诺贝尔化学奖获得者J. B. Fenn和K. Tanaka做出的贡献。在蛋白质的结构研究方面，她强调了对受体膜蛋白性质的研究在药物设计和研发领域的重要地位。/pp　　strongCarol Robinson教授介绍，她的研究团队将膜蛋白溶入洗涤剂溶液，并通过毫微电喷雾电离汽化质谱技术对膜蛋白与脂类小分子之间的相互作用及计量性质和其自身在小分子稳定作用下的折叠过程进行了探索和研究。/strong在结合诸如离子淌度法、核磁共振法等其它技术后，进一步提取出更多关于折叠膜蛋白的拓扑结构信息和性质。Carol Robinson教授团队从1993年开始应用质谱分析证实了蛋白质折叠与伴侣分子稳定效果的关系，并于2008年使用质谱分析研究疏水膜蛋白并取得突破。最近，她的团队对螺旋低聚膜蛋白在界面脂分子作用下的稳定效果进行量化，取得的成果发表在Nature及Science系列期刊上。她展示了原始的质谱分析例图，讲解了如何使用图谱判断样品蛋白是否折叠，并讲解了在旋转马达ATP合成膜蛋白内部的亚单位相互作用及折叠机制。/pp　　Carol Robinson教授总结，质谱分析对膜蛋白方面的研究意义重大，具有独特性和创新性。她指出，自己在最初决定进行这方面研究时遇到了很大困难和阻力，并因此鼓励年轻人不必拘泥形式，要敢于设计实验。/pp　　在提问环节中，Carol Robinson教授回答了研究中遇到的困难、质谱与冷冻电镜等分析方法在生物结构研究方面的应用和蛋白质在真空中折叠的机理与现实环境中的区别等问题。Carol Robinson教授还和同学们探讨了如何平衡家庭和学术事业等话题。/pp　　大师讲坛学生组委会向 Carol Robinson教授赠送了精心制作的泥塑人像作为纪念品，以表达交大学子对她到访由的衷感谢和诚挚祝福。/pp　　【嘉宾介绍】/pp　　Carol Robinson，英国皇家学会院士、美国科学院外籍院士、英国皇家化学会候任主席。现担任牛津大学化学系Doctor Lee冠名教授，牛津大学埃克塞特学院教授会员。她1982于剑桥大学获得博士学位，先后在基尔大学、牛津大学、剑桥大学工作。她2001年晋升为剑桥大学历史上第一位女教授，2011年被英国皇家学会授予跨领域奖，2013年在新年授勋中被授予大英帝国爵级司令勋章，2015年获得世界杰出女科学家成就奖。/pp　　【背景介绍】/pp　　质谱是一种通过ESI和MALDI等方法电离分子并根据其质荷比进行记录的分析方法，在化学及结构生物领域有着广泛的应用。使用质谱法分析膜蛋白质要求电离蛋白质分子，同时不破坏其分子结构。/pp　　Carol Robinson教授长期从事质谱相关领域的研究。她在对生物高分子配合物进行汽化以用于质谱法分析领域进行了大量突破性研究，并在使用质谱研究例如膜蛋白等大配合物结构方面做出了杰出贡献。Carol Robinson教授以第一作者或通讯作者在Nature和Science等杂志上发表了一系列文章，是质谱在化学、生物等领域研究方面的权威学者。/pp /p

质谱仪器作为一种质量检测仪器，被应用到各个学科领域中，尤其是在化学化工、环境能源、医药、生命及材料科学等领域发挥着重要作用。在常规质谱分析中，被分析物质首先被离子化，随后各种离子被引入真空中的质量分析器，在分析器中的电场或磁场作用下，离子的运动特性随其质荷比不同而产生差异，因而造成时空上的分离，并由检测器依次检测出来。而在这种原理下，质谱仪测量的是离子的质荷比（m/z)，而不是质量本身。利用质谱仪器对样品的分析过程中，样品的雾化过程十分关键。目前，常用的电喷雾技术原理是由John Fenn提出的电喷雾电离（ESI）技术，这一理论也获得了2002年的诺贝尔化学奖。通常对蛋白质这种大分子来说，ESI质谱中都会呈现多种价态的谱峰群，群落中的每一组为某个电荷态该蛋白质的各个同位素峰、盐峰以及加合物峰等。由于电荷态z通常是连续的整数分布（例如z = 11，12....21,22...)，人们可以通过计算不同电荷数对应的群落m/z的间隔来推算各组的电荷数z，进而求出实际的质量m的分布，也可以使用软件进行解卷积得到m分布。这种分析手段对于分析分子量较小（分子量在5万以下）、简单纯净的蛋白样品还是很有效的。然而，在实际应用中对天然蛋白和病毒颗粒的分析却不那么简单。随着分子量上升，分子结构越来越复杂，各种翻译后修饰使被测蛋白的分子量出现差异化，很宽的质量分布（可达上千Da）使得不同价态的峰群连接在一起。如图1所示，这种缺少电荷状态以及同位素峰的“死亡驼峰”，我们很难通过解卷积的形式进行分析。并且，对于很多糖蛋白，分子量超过3、4万就出现峰群交叠，无法用解卷积软件来获得分子量的分布信息。因此，对于大生物分子的质谱分析，仅靠提高仪器的分辨率是无济于事的。在这种情况下，电荷检测质谱（CDMS）技术便成为了我们的“救命稻草”。电荷检测质谱（CDMS）通过同时测量单个离子的质荷比和电荷数，进而计算获得离子质量m。因此，相较于其他类型质谱，CDMS技术的关键是如何准确地测量单个离子的电荷。目前，电荷检测质谱技术还没有现成的商品化仪器，只有能够自己开发质谱仪器硬件，或自己改编FTMS软件的专家才能进行这样的实验。而在今年的ASMS会议上，赛默飞公司重磅推出了直接分析质谱技术（DMT），并将其结合在了Orbitrap上，这使得超大分子量的复杂蛋白的直接质谱检测成为了可能。直接分析质谱技术其原理是：在Orbitrap中检测来自离子沿中心电极的中心轴旋转的轴向频率，进而确定离子的m/z信息；与此同时，来自外电极上的感应电荷振幅也会被检测，从而确定离子的电荷z的信息。直接分析质谱技术模式为 Orbitrap 质量分析仪增加了电荷检测功能，能够同时测量数百个单个离子的质荷比 (m/z) 和电荷数 (z)。这使得 Orbitrap 质量分析仪可以直接计算分析物的质量，而不需要根据 m/z 去卷积。根据 m/z 去卷积的方法依赖于测量结果中已分辨的电荷状态和/或同位素分辨的信号。直接分析质谱技术模式提高了分辨率，并且扩展了动态范围，提高了可获得的质量测量结果的上限，同时由于单个离子测量的灵敏度较高，可以从浓度明显较低的样品中采集到更有价值的数据。

仪器信息网讯 据WHO官网数据显示，截至2021年8月6日，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)已致全球2亿人感染，425万人死亡，这是本世纪最为严重的全球公共性卫生事件。　　刺突蛋白(Spike, S)是病毒表面重要的标志蛋白，是一种三个相同亚基以非共价键结合成同源三聚体 同时刺突蛋白存在多个N-糖基化位点，糖基通过共价键与蛋白相连组成糖蛋白，而大量糖基的存在则可通过糖基化改变蛋白质分子的空间结构而封闭或破坏抗原表位，从而抑制机体产生免疫应答，对病毒起到保护作用。刺突蛋白的序列主要包括N端结构域(N-Terminal Domain,NTD)、受体结合结构域(Receptor Binding Domain,RBD)、融合肽段(Fusion peptide，FP)、2段七肽重复序列(Heptad Repeat，HR)、中央螺旋(Central Helix，CH)、连接域(Connector Domian,CD)、跨膜结构域(Transmembrane Domain,TD)等。　　SARS-CoV-2通过高度糖基化的刺突蛋白(Spike, S)上的受体结合域(RBD)与人受体蛋白血管紧张素转换酶(ACE2)结合，进而入侵人体细胞，因此刺突蛋白糖基化在改变病毒结合/功能和感染性方面起着关键作用。然而由于传统自下而上糖蛋白组学方法分析完整糖型面临挑战，因此在刺突蛋白受体结合域(S-RBD) 上揭示新O-聚糖的分子结构和聚糖异质性仍是个难题。　　基于此，2021年7月，威斯康星大学葛瑛教授团队在《美国化学会志》(Journal of the American Chemical Society, JACS)上发表了最新的成果，题为“Structural O‑Glycoform Heterogeneity of the SARS-CoV‑2 Spike Protein Receptor-Binding Domain Revealed by Top-Down Mass Spectrometry”。该研究利用自上而下蛋白质组学方法，提供了刺突糖蛋白不同O-糖型的高分辨率蛋白质解析图，为揭示其 O-聚糖的功能作用奠定了强大的分子基础。这种蛋白质解析方法可用于揭示新出现的 SARS-CoV-2 S-RBD 变体以及其他O-糖蛋白的结构O-糖型异质性。　　该工作中，研究人员通过利用捕集离子淌度 (TIMS)-四极杆飞行时间质谱法和超高分辨率傅里叶变换离子回旋共振质谱法解析了完整的 O-聚糖蛋白型的完整结构。自上而下的 TIMS-MS/MS 分离 S-RBD 的蛋白质构象异构体以揭示其气相结构异质性，而自上而下的 FTICR-MS/MS 提供深入的糖型分析，以明确识别聚糖结构和他们的糖基。　　该工作内容首次在结构上阐明了总共八种O-糖型及其相对分子丰度。该发现表明，这种自上而下的混合质谱分析方法可以提供S糖蛋白的不同 O-糖型的高分辨率蛋白质型解析图，这为揭示其 O-聚糖的功能作用奠定了强大的分子基础。这种蛋白质型解析方法可用于揭示新出现的 SARS-CoV-2 S-RBD 变体以及其他 O-糖蛋白的结构 O-糖型异质性。　　研究团队: https://labs.wisc.edu/gelab/　　葛瑛教授

最近发表的论文显示，新型质谱平台正在显著增强单细胞蛋白质组学实验的覆盖深度。研究人员在单细胞实验中发现，使用Bruker timsTOF Ultra和Thermo Fisher Scientific Orbitrap Astral仪器后，检测的蛋白质数量增加了一倍多。这两种仪器都在6月份的美国质谱学会年会上（ASMS 2023）首次亮相。timsTOF Ultra是Bruker timsTOF系列的最新产品，它提高了现有timsTOF SCP对小样本的分析能力，还可以对较大样本进行高性能分析。（新产品详情了解）Orbitrap Astral标志着赛默飞世尔公司进军一项新技术，即Astral（用于不对称轨道无损）分析仪，该分析仪与飞行时间（TOF）分析仪一样，测量离子沿仪器内轨道的行进及其到达探测器表面的情况。（新产品详情了解）哥本哈根大学的研究人员于11月发布在BioRxiv预印本上的文章首次展示了Astral在单细胞蛋白质组学研究中的分析能力。在这项研究中，科学家们能够在单个HeLa细胞中识别出5000多种蛋白质。他们指出，这是之前单细胞实验通常达到数量（约2000种蛋白质）的两倍多。哥本哈根大学Novo Nordisk基金会蛋白质研究中心教授兼副主任、预印本资深作者Jesper Olsen表示，Astral “真正改变了游戏规则”，并指出Astral分析仪“提供了极高的灵敏度”。东北大学（美国）生物工程副教授、专注于单细胞蛋白质组学研究的PTI所长Nikolai Slavov表示：“我们注意到单细胞蛋白质的分析性能大幅提高，而新仪器占据了主要原因。”并表示，新的质谱仪器能够准确地定性定量多种肽和蛋白质。维也纳分子病理学研究所蛋白质组学技术中心负责人Karl Mechtler认为，如果没有新的仪器，很难进行单细胞的最近研究。他说：“通过和单细胞领域的研究者讨论，我们都认为新仪器是向前迈进的重要一步。”Mechtler的实验室拥有Ultra，并计划购买Orbitrap Astral，这两种仪器都将用于单细胞实验。在ASMS上，Mechtler展示了Ultra的研究数据。在250pg（大约相当于单个细胞中的蛋白质量）中，他和同事测量了约6000个蛋白质组，中位变异系数（CV）为10%，而使用旧的timsTOF SCP，测量约5000个蛋白质组，CV为12%。在研究实际的单个HeLa和K562细胞（与标准细胞相反）过程中，他们分别鉴定了3803和3221种蛋白质。Mechtler说，自从安装Ultra以来，实验覆盖深度略低，比在ASMS报告的数字下降了5%-10%。由于该系统只使用了六个月，他和同事们将继续优化其性能。在Slavov及其同事在11月发表的BioRxiv预印本中，研究人员将timsTOF Ultra用于单细胞实验，每个细胞量化了3000-3700种蛋白质。Slavov表示，虽然这两种仪器都能大幅提高单细胞研究的分析能力，但timsTOF Ultra更具优势。与Orbitrap Astral相比，Ultra的捕获离子迁移率（TIMS）使仪器能够分离和破碎更大的离子。但是Orbitrap Astral灵敏度更好，尤其是在产生少量离子的单细胞实验中。Slavov补充说，在用于单细胞和大块蛋白质组学实验的数据独立获取（DIA）实验中，通过一系列m/z分离窗口循环，在给定的时间点分解m/z窗口中存在的所有前体离子。Ultra利用TIMS对离子的释放进行计时，以匹配当时碎片化的m/z窗口。但在Astral中不能以这种方式计时，因此在特定时间点被碎片化的m/z窗口外的离子将无法进行分析。Ultra收集的离子迁移率数据提高了检测的特异性。Olsen同样指出，Astral能够分析样本产生的一小部分（约1%）离子束。尽管如此，该系统“与我们以前使用过的任何仪器相比，仍然具有极高的灵敏度。”他和他的同事通过Astral进行单细胞实验时，调整了隔离窗和喷射时间，以便吸收更多的离子进行分析。在批量实验中，通常使用2个Thompson隔离窗。他们将该窗口的大小和允许的最大注射时间都增加了一倍。他认为现在是单细胞蛋白质组学研究的最佳时刻，并且握在自己手中。Olsen指出，Astral还能够在单细胞水平上分析翻译后修饰（PTM）。这在传统上是困难的，因为小尺寸单细胞样本在没有富集的情况下很难识别PTM，而富集方法又会导致样本丢失，这使得单细胞PTM分析具有很大挑战。样本制备流程的改进也推动了分析仪器行业的发展。Olsen的团队使用Evosep最近发布的ProteoCHIP EVO 96平台进行单细胞研究。该平台是Evosep与Cellenion合作设计，允许研究人员使用Cellenion的CellenOne X1平台分离单个细胞并将其分配到EVO 96平台中；最多可以并行处理96个细胞，然后转移到Evosep的Evotip分离设备中，并在该公司的Evosep One LC系统上运行。该系统的集成使样品制备过程几乎没有损失，并指出这是“提高质谱分析灵敏度的关键”。Slavov也使用CellenOne系统进行样品制备。这种方法被称为nPOP，在载玻片上以液滴形式制备单个细胞，可以同时制备数千个。研究人员表示，这种方法可以在一到两天内制备3000多个细胞。Mechtler还与Cellenion合作开发了单细胞样品制备的工作流程，以最小的样品损失同时处理大量单细胞。通量仍然是单细胞蛋白质组学面临的最大挑战。最近发布的仪器在一定程度上解决了这一问题，但许多工作流程仍然局限于每天分析几十个左右的细胞。Slavov说：“我们希望每天能够以分析每一个细胞的工作量去分析数千个细胞。我们目前在timsTOF Ultra上使用PTI继续开发plexDIA方法，该方法将样本复用与独立于数据的采集质量规范相结合，以实现更高通量的实验。”Olsen同样指出，“通量是我们目前的主要问题。”他说，实验室每天可以运行大约40个单细胞，但只要“稍作调整”，可以实现每天运行100个细胞。他和他的同事们正在探索多种复用方法，这些方法可以进一步提高通量，但“现在说它能起多大作用还为时过早。”---------------------------------------------------------------------------------------------------------------2023年，仪器信息网联合北美华人质谱学会（CASMS），于12月12-15日联合举办第十四届质谱网络会议（iCMS 2023），本届会议新增单细胞质谱技术及应用新进展专场，聚焦单细胞质谱新技术及最新研究进展。（点击了解相关质谱仪器专场）部分报告预告点击浏览  》》》会议报名点击下图

大家好，本周为大家介绍一篇本课题组发表在ACS Chem. Biol.上的文章，Insights into Phosphorylation-Induced Protein Allostery and Conformational Dynamics of Glycogen Phosphorylase via Integrative Structural Mass Spectrometry and In Silico Modeling1。变构调节在自然界中广泛存在，可以用于调控细胞过程。糖原磷酸化酶（GP）是第一个被鉴定出的与变构调节相关的磷酸化蛋白。GP是一个分子量约196kD的同源二聚体蛋白，是糖代谢中重要的组分，也是2型糖尿病及癌症的靶点。AMP结合以及Ser14的磷酸化介导了GP的变构调节，使其构象从非活化的T-state GPb（未磷酸化状态）转变为活化的R-state GPa（磷酸化状态）。即使目前X-射线晶体学法解析出了GP的原子级蛋白结构，但受限于较大分子量，其结构动态性的检测较为困难，因此与GP变构调节相关的结构动态变化过程仍较为模糊。核磁共振（NMR）谱及分子动力学（MD）模拟等是探究蛋白质结构动态性的常用方法，但NMR分析存在分子量上限，且样品消耗量大，MD模拟的时间尺度和力场准确度有限。质谱（MS）法具有快速、灵敏的特点，是蛋白质结构、动态性以及构象变化分析中强有力的一款技术。氢氘交换质谱（HDX-MS）通过监测蛋白骨架酰胺氢原子与溶液中氘的交换来反映蛋白质构象动态性，因此适用于探究由配体、蛋白结合或共价修饰引起的蛋白质构象变化。同时，多个软件实现了由HDX-MS数据计算保护因子（PFs）和吉布斯自由能，从而提取残基水平的蛋白动态性信息。此外，在先前的工作中2, 3，我们整合了native MS和top-down方法（native top-down，nTD-MS技术），成功实现了多个蛋白复合物的一级序列到高阶结构等多方面信息的检测（包括测序、翻译后修饰、配体结合、结构稳定性、朝向等）。整合多种结构质谱法（整合结构质谱法）可以有效填补传统生物物理法中结构到动态性联系中的空缺，更好地表征变构调控现象。本文整合了HDX-MS、nTD-MS、PF分析、MD模拟以及变构信号分析检测了磷酸化介导的GP变构调控的结构和动态性基础，为GP的变构调控过程提供了见解。根据X-射线晶体学结构报道（图1a），T-state GPb转变为R-state GPa时，二聚体界面中N-末端尾部、α2、cap’（图1b）以及tower-tower helices区（图1c）发生了明显的结构重排，导致催化位点开放，从而底物磷酸吡哆醛（PLP）可以结合。尽管有晶体学报道，但与变构调控关联的构象动态性仍有待探寻。图1.（a）磷酸化介导T-state GPb（PDB：8GPB）向R-state GPa（PDB：1GPA）的构象转变；亚基相互作用界面：（b）C端区域和（c）tower-tower helices，GPb为蓝色，GPa为绿色。首先我们通过nTD-MS进行了检测。如图2a、b，谱图中观察到了GPb的单体和二聚体信号，其中二聚体为主要形式；GPa除了单体和二聚体外，谱图中还存在少量四聚体，但仍以二聚体为主要形式。当增加sampling cone（SC）电压时，GPb、GPa保留了其二聚体形式（图2c、d）。随后我们选择离子（29+）并在trap池中进行了碎裂（图2e、f、g、h），谱图低质荷比区GPa的碎片相对峰强度较GPb高，说明GP的二聚体互作界面较为稳定，且GPb亚基结构较GPa稳定。nTD-MS不仅能够探究GPb、GPa的结构差异，也能够为接下来的HDX-MS实验做好前期样品质量检查工作。图2.不同活化条件下GPb、GPa的nTD-MS谱图。（a、b）SC=40V；（c、d）SC=150V；（e、f）SC=150V、trap=100eV；（g，h）SC=150V、trap=200eV。左侧为GPb，右侧为GPa。随后我们进行了HDX-MS实验。图3a中展示了五个时间点的HDX heat map。图3b为通过PyHDX软件计算产生的PF值。其中N-端（1-22）以及tower helix前的loop区域（256-261）的氘代值较高、PF值较低，说明这些区域较为柔性或是结构较为无序。此外我们发现，tower-tower helices（262-276）区域的氘代值较低、PF值较高，表明helices的旋转可能是由前端可塑性铰链区触发的，而非helices本身的变形和重塑引起的，这些发现在晶体结构数据中均有吻合之处。除这两个区域外，GPa和GPb基本保持了稳定的整体结构。而从1μs原子级MD模拟计算得到的均方根波动（RMSF）和溶剂可及表面（SASA）中我们也发现（图3c），这两个区域数据与HDX-MS信息有所吻合，但MD模拟中部分区域未和HDX-MS相吻合的区域可能跟序列覆盖不足相关。图3. （a、d）GPb和GPa在不同标记时间下的氘代热图并映射到结构中（PDB: 1GPA）。（b、e）基于HDX-MS数据计算得到的PF值并映射到晶体结构中。（c、f）MD模拟中RMSF和SASA值并映射到结构中。从氘代差异图（图4a）中可以看出，4个区域呈氘代降低趋势（红色方框），多个区域呈氘代上升趋势（蓝色方框）（GPa-GPb）。而PF差的变化趋势与氘代变化趋势基本一致（图4b）。由数据可知，N-端和tower-tower helices的变化说明磷酸化介导的变构稳定了这两个区域，α1-cap-α2区域的动态性轻微下降。除此之外多个区域（尤其是tower-tower helices序列后的区域）均表现为PF值下降，说明相比于GPb，GPa催化位点附近的区域动态性增强了。接下来我们根据HDX kinetic plot特征将其进行了分类，并详细讨论了所属区域的变化。图4.（a）GPa-GPb HDX-MS的氘代差异图。（b）GPb到GPa PF的变化。 首先是N-端和C-端的变化（图5）。N-端残基1-22表现氘代下降，这说明N-端具有一定可塑性。受N-端区域磷酸化和结构变化影响，C-端区域也产生了一定的变化。此外，残基30-50（cap区）和残基111-117（α4back-loop）区表现氘代下降，而103-109（α4front）表现氘代上升。根据晶体结构推测，cap区和α4back-loop的氘代变化受N-末端变化影响，原有的残基相互作用被打破，形成新的残基间相互作用，同时这两个区域也经历了结构重排，因此表现出较明显的氘代变化。残基88-99（β2-α3）和残基125-141（β3-L-α6）氘代上升。总的来说，磷酸化使得cap′/α2界面互作增强了，同时磷酸化基团和精氨酸残基的静电相互作用是cap区产生变化的主要原因，而α1和α2起到锚定作用，其相对位置基本保持不变。图5.GPb（a）和GPa（b）的N-端和C-端区域的局部结构和HDX动力学曲线（c）。 此外，tower-tower helices（α7，残基262-278）区的变化同样值得关注（图6）。250s loop是表面暴露区域，未与其他区域发生接触，其氘代下降可能是因为自身结构的收缩。而肽段262-267和268-274氘代下降提示该区域可能发生了低周转率或强互作的结合反应。280s loop区氘代值上升。这些变化均说明，tower-tower helix的角度的改变不仅影响了二聚体界面结构，而且还影响了其靠近催化位点的周围区域。因此我们结合晶体结构推测，磷酸化和N-端相对位置的改变，使250s loop自身结构收缩，从而打破了Tyr262' -Pro281和Tyr262-Tyr280′之间的相互作用，导致两个亚基的tower helices发生相对滑动，倾斜角度增加。图6.GPb（a）和GPa（b）tower helix区域的局部结构和HDX动力学曲线（c）。 最后是催化位点、PLP结合位点和糖原存储位点的变化情况（图7）。催化位点周围多数区域均表现氘代上升趋势。我们推测，随着Pro281、Ile165和Asn133间的相互作用被打破，Arg569与Ile165、Pro281、Asn133间的互作也随之打破，因此催化位点和PLP结合位点周围的残基溶剂可及性上升，局部区域结构变得更为灵活，催化位点开放并转变为活化构象。糖原储存位点位于GP表面，距离催化位点30Å，除了α23（残基699−708）外，HDX-MS在糖原存储区没有观察到明显的变化。图7.GPb（a）和GPa（b）的催化位点和PLP（橙色）结合位点的局部结构和HDX动力学曲线（c）。结合以上所有数据，我们对磷酸化调节的动态机制进行了推测（流程图1）。磷酸化后，N-端尾部残基与acidic patch的互作被打破，也导致N-端尾部的有序化以及C-端尾部的无序化以及伴随的其他结构变化。通过在pSer14和Arg69和Arg43′之间形成新的盐桥，N-端残基被重定位，随之带来的是Asp838和His36′间的盐桥断裂。随着三级和四级结构的转变，250s loop收缩并发挥类似“门环”的作用，当其收缩时，Tyr262′-Pro281与Tyr262-Tyr280′之间的相互作用、276-279区与162-164区之间的氢键也被打破，导致tower helix发生相对滑动，tower-tower helices之间的作用被打破，同时将结构变化传递到催化位点。最后，280s loop和催化位点以及PLP结合位点附近的残基松动，通往催化位点和底物磷酸盐识别位点的通道打开，酶得以活化。流程图1.GP变构调节过程中，被打破（蓝色）或新形成的（红色）关键残基相互作用。 本文整合nTD-MS、HDX-MS、PF分析和MD模拟检测了GP磷酸化变构调节过程的结构和动态基础，通过该整合结构手段揭示了GP构象柔性、局部动态性以及长程变构调控构象变化中值得关注的信息。各个方法具有各自的优势，但也在一定层面存在局限，我们期待将HDX-MS信息与计算模拟信息进行更深度的整合以实现二者对蛋白质结构更精确的分析。撰稿：罗宇翔编辑：李惠琳原文：Insights into Phosphorylation-Induced Protein Allostery and Conformational Dynamics of Glycogen Phosphorylase via Integrative Structural Mass Spectrometry and In Silico Modeling李惠琳课题组网址：https://www.x-mol.com/groups/li_huilin参考文献1.Huang, J. Chu, X. Luo, Y. Wang, Y. Zhang, Y. Zhang, Y. Li, H., Insights into Phosphorylation-Induced Protein Allostery and Conformational Dynamics of Glycogen Phosphorylase via Integrative Structural Mass Spectrometry and In Silico Modeling. ACS Chem. Biol. 2022.2.Li, H. Nguyen, H. H. Ogorzalek Loo, R. R. Campuzano, I. D. G. Loo, J. A., An integrated native mass spectrometry and top-down proteomics method that connects sequence to structure and function of macromolecular complexes. Nat. Chem. 2018, 10 (2), 139-148.3.Li, H. Wongkongkathep, P. Van Orden, S. L. Ogorzalek Loo, R. R. Loo, J. A., Revealing ligand binding sites and quantifying subunit variants of noncovalent protein complexes in a single native top-down FTICR MS experiment. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2014, 25 (12), 2060-8.

阿尔兹海默症（Alzheimer’s diseases，AD）是最常见的一种神经退行性疾病，临床表现为渐进性记忆损伤，认知功能障碍，语言障碍等精神症状。我国现有1000多万AD患者，是世界上患者数量最多的国家。且随着人口老龄化，这个数字还在急剧增加，据预测到2050年中国AD患病人数将超过4000万，给我国社会经济以及患者家庭带来极大负担。阿尔兹海默症主要特点为病人脑组织中β淀粉样蛋白（Aβ）的异常产生和累积。Aβ形成的前体蛋白APP（amyloid protein precursor）是一种高度糖基化修饰的糖蛋白。蛋白质糖基化是一类重要的蛋白质翻译后修饰，参与蛋白稳定表达，蛋白加工剪切，细胞间的靶向识别及相互作用等生理过程。越来越多的研究表明糖基化对APP的加工及Aβ的产生具有关键的调控作用，精准判定APP糖基化修饰信息，对深入理解app蛋白在AD疾病发生中的作用和疾病早期诊断方法开发上具有重要意义。 近日，上海交通大学系统生物医学研究院张延课题组与严威课题组联合开发了一种基于质谱多碎裂方式组合靶向完整O-糖肽的质谱解析方法（Targeted MS combined Multi-fragment strategy，TMMF）。 该方法精准描绘出APP蛋白的O-糖基化修饰位点和糖链结构。为从蛋白质糖基化修饰水平理解app的分子功能与AD的发病机制，发现AD治疗靶点以及开发AD早期诊断策略提供了新的思路。该成果以“Comprehensive analysis of O-glycosylation of amyloid precursor protein (app) using targeted and multi-fragmentation MS strategy”为标题发表在国际著名生物化学与生物物理学期刊（BBA-General Subjects）上。(生物谷Bioon.com）

一、项目基本情况1、项目编号：豫财招标采购-2023-272、项目名称：阜外华中心血管病医院国家区域医疗中心设备（高分辨蛋白组质谱成像仪）采购项目3、采购方式：公开招标4、预算金额：8,800,000.00元最高限价：8800000元序号包号包名称包预算（元）包最高限价（元）1豫政采(2)20230060-1阜外华中心血管病医院国家区域医疗中心设备（高分辨蛋白组质谱成像仪）采购项目880000088000005、采购需求（包括但不限于标的的名称、数量、简要技术需求或服务要求等）5.1 采购货物名称及数量：高分辨蛋白组质谱成像仪 1台5.2 标包划分：一个标包5.3 采购货物技术性能指标：具体参数详见招标文件第五章“采购需求”5.4 核心产品：/5.5 采购范围：高分辨蛋白组质谱成像仪的供货、运输、保险、装卸、安装、检测、调试、试运行、验收交付、培训、技术支持、售后保修及相关伴随服务5.6 资金来源：财政资金，已落实5.7 交货期：20日历天5.8 交货地点：采购人指定地点6、合同履行期限：/7、本项目是否接受联合体投标：否8、是否接受进口产品：是9、是否专门面向中小企业：否二、获取招标文件1.时间：2023年02月13日 至 2023年02月17日，每天上午00:00至12:00，下午12:00至23:59（北京时间，法定节假日除外。）2.地点：河南省公共资源交易中心网站（http://www.hnggzy.net/）3.方式：投标人凭企业CA 数字证书登录河南省公共资源交易中心网站市场主体登录系统，并按网上提示自行下载投标项目所含格式(.hnzf)的招标文件。4.售价：0元三、投标截止时间及地点1.时间：2023年03月06日09时00分（北京时间）2.地点：通过“河南省公共资源交易中心（http://www.hnggzy.net/）”电子交易平台加密上传。逾期送达的投标文件，电子招标投标交易平台将予以拒收。四、开标时间及地点1.时间：2023年03月06日09时00分（北京时间）2.地点：河南省公共资源交易中心远程开标室(一)-2，郑州市经二路12号（经二路与纬四路向南50米路西）。五、发布公告的媒介及招标公告期限本次招标公告在《河南省政府采购网》、《中国政府采购网》、《河南省公共资源交易中心网》上发布， 招标公告期限为五个工作日。六、其他补充事宜无七、凡对本次招标提出询问，请按照以下方式联系1. 采购人信息名称：阜外华中心血管病医院地址：河南省郑州市郑东新区阜外大道1号联系人：何芸联系方式：0371-586800922.采购代理机构信息（如有）名称：河南省信人工程造价咨询有限公司地址：河南省郑州市金水区文化路9号永和国际1702室联系人：张振辉联系方式：0371-638991563.项目联系方式项目联系人：张振辉联系方式：0371-63899156