钠钾离子通道

p 　　记者从中国科学技术大学获悉，该校田长麟教授研究组与德国莱布尼茨分子药物所Adam Lange及孙涵课题组合作，应用固体核磁共振、单通道电生理及分子动力学模拟等方法揭示了NaK离子通道的离子选择性新机制。该研究成果已发表在《自然· 通讯》上。 /p p 　　离子通道是细胞膜上的一类特殊亲水性蛋白质微孔道，在细胞膜上形成动作电位和梯度电位，决定细胞的兴奋性和传导性。绝大多数离子通道对不同的离子有选择性的通透，但仍有一部分离子通道可以非选择性地通过几种离子。研究人员在KcsA钾离子通道结构基础上，提出了“钾离子通道通过选择过滤器中主链C=O形成水合离子配位方式实现离子选择性”的静态机制模型，获得了广泛认同。但是，近年来高分辨率X-射线晶体结构显示NaK离子通道在结合不同离子时其静态通道结构完全一致，这无法解释其如何识别和通透这些离子。 /p p 　　田长麟课题组以非选择性通道NaK为研究对象，将其重组装到磷脂双分子膜内(还原离子通道所存在的细胞膜环境)，并与Adam Lange组合作，通过魔角旋转固体核磁方法获得高分辨固体NMR谱图，并获得了不同金属阳离子条件下谱峰归属。NMR谱图数据表明，NaK在生理环境下通道存在两种构象，钾离子选择结合其中一种，而钠离子选择另一种。双方进一步通过固体核磁对原子间距离测量勾画出了两种构象的结构差别，并用分子动力学模拟的方法验证了两种构象分别对K+和Na+有高度的选择性。 /p p 　　这一研究成果提出了离子通道选择性的新机制。 /p

p 　　7月20日，生命中心颜宁研究组在《细胞》(Cell)期刊在线发表题为《来自电鳗的电压门控钠离子通道Nav1.4-β1复合物结构》(Structure of the Nav1.4-β1 complex from electric eel)的研究论文，首次报道了带有辅助性亚基的真核生物电压门控钠离子通道复合物可能处于激活态的冷冻电镜结构。该成果是电压门控离子通道(voltage-gated ion channel)的结构与机理研究领域的一个重要突破。 br/ /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201708/noimg/006bf0f0-14f4-4b4b-9249-e21d7cbe96f4.jpg" title=" 1.jpg" width=" 460" height=" 329" style=" width: 460px height: 329px " / /p p style=" text-align: center " 图1. 电压门控钠离子通道Nav1.4-β1复合物结构示意图 /p p 　　电压门控钠离子通道(以下简称“钠通道”)位于细胞膜上，能够引发和传导动作电位，参与神经信号传递、肌肉收缩等重要生理过程。顾名思义，钠通道感受膜电势的变化而激活或失活。对于可激发的细胞，细胞膜两侧由于钠离子、钾离子、钙离子、氯离子等离子的不对称分布，产生跨膜电势差。在静息状态下，细胞膜内电势低，膜外电势高，3-5纳米厚的细胞膜两侧电势差大概为-70毫伏左右。通常情况下，钠通道在细胞膜去极化状态，也就是细胞内相对电势升高时激活(即钠通道中心通透孔道打开，钠离子由高浓度的胞外侧流向胞内)，从而引发动作电位的起始 而其又具备特殊的结构特征，使之在激活的几毫秒内迅速失活，从而保证通过与钾离子通道的协同作用结束动作电位，以及由钠钾泵介导的静息电势的重建，为下一轮的动作电位产生做好准备。 /p p 　　真核生物的钠通道主要由负责感受膜电势控制孔道开闭进而选择性通透钠离子的α亚基和参与调控的β亚基组成。在人体中共有9种钠通道α亚型(分别命名为Nav1.1-1.9)和4种β (β1-4)亚基，特异分布于神经和肌肉组织中。由于其重要的基本生理功能，钠通道的异常会导致诸如痛觉失常、癫痫、心率失常等一系列神经和心血管疾病。至今为止，已经发现了1000多种与疾病相关的钠通道突变体。另一方面，很多已知的包括蝎毒、蛇毒、河鲀毒素在内的生物毒素以及临床上广泛应用的麻醉剂等小分子均通过直接作用于钠通道发挥作用。钠通道是诸多国际大制药公司研究的重要靶点，其结构为学术界和制药界共同关注。 /p p 　　颜宁研究组十年来一直致力于电压门控离子通道的结构生物学研究，取得了一系列重要成果，包括来自细菌中的钠通道NavRh的晶体结构 (Zhang et al., 2012)。而近两年更是相继报道了与钠离子通道有同源性的世界上首个真核电压门控钙离子通道复合物Cav1.1 (Wu et al., 2016 Wu et al., 2015)以及首个真核钠通道NavPaS (Shen et al., 2017)的高分辨率冷冻电镜结构，为理解真核电压门控离子通道的结构与功能提供了重要基础。 /p p 　　在该最新研究中，颜宁研究组首次报道了真核钠通道复合物Nav1.4-β1的冷冻电镜结构，整体分辨率达到4.0 ，中心区域分辨率在3.5 左右，大部分区域氨基酸侧链清晰可见。该蛋白来自于电鳗(Electrophorus electricus)，它具有一个特化的肌肉组织称为电板(electroplax)，在受到刺激或捕猎时能够放出很强的电流 电流产生的基础即为钠通道的瞬时激活。因而该器官富集钠通道，其序列与人源九个亚型中的Nav1.4最为接近，因此命名为EeNav1.4。值得一提的是，电鳗中的钠通道正是历史上首个被纯化并被克隆的钠通道，已经具有半个世纪的研究历史，是钠通道功能和机理研究的重要模型，因此该蛋白一直以来也是结构生物学的研究热点。 /p p 　　在本研究中，研究组成员利用特异性的抗体从电鳗的电板组织中提纯出Nav1.4-β1复合物，通过对纯化条件和制样条件的不断摸索和优化，获得了性质稳定且均一的蛋白样品，并进一步制备出优质的冷冻电镜样品，最终利用冷冻电镜技术解析出其高分辨三维结构。与此前解析的钠通道NavPaS相比，该结构展示了三大新的结构特征： /p p 　　1)该结构中带有辅助性亚基β1，首次揭示了辅助性亚基与α亚基的相互作用方式，有助于更好的理解β亚基对钠通道功能的调控机制 /p p 　　2)与钠通道快速失活相关的III-IV 连接片段的位置与之前在Cav1.1和NavPaS结构相比有一个十分显著的位移，特别是与快速失活直接相关的IFM元件插入到了中间孔道结构域的内外两层之间。这一新的结构刷新了我们之前对钠通道失活机制的理解，却与历史上大量基于电生理的突变体分析十分吻合。本论文就此提出了一个解释钠通道快速失活的新的变构阻滞机制(allosteric blocking mechanism) /p p 　　3)该结构特征与预测的激活态基本吻合，极有可能揭示了首个处于开放状态的真核钠通道的结构，实属意外之喜。由于钠通道蛋白在提纯后会很快失活，理论上处于开放状态的结构是极难甚至不可能捕捉到的。进一步分析电子密度发现，有一团疑似去垢剂分子的密度堵在胞内门控区域，帮助稳定了钠通道的开放状态。因此该结构整体呈现的极有可能是完全没有预料到的激活态。这一难得的构象有助于更好地理解电压门控离子通道最基本的机电耦合机理问题(electromechanical coupling mechanism)。除此之外，该结构还为基于结构的药物设计和功能研究提供了全新的模板。 /p p 　　颜宁教授为本文的通讯作者。清华大学医学院博士后闫浈、医学院副研究员周强、生命学院博士生王琳、生命学院博士毕业生吴建平为本文的共同第一作者 清华大学冷冻电镜平台雷建林博士指导数据收集。本研究获得了清华大学冷冻电镜平台工作人员李小梅和李晓敏的大力支持。国家蛋白质科学中心(北京)清华大学冷冻电镜平台和清华大学高性能计算平台分别为本研究的数据收集和数据处理提供了支持。生命科学联合中心、北京市结构生物学高精尖创新中心、膜生物学国家重点实验室、科技部、基金委为本研究提供了经费支持。(来源：生命科学联合中心) /p p 　　原文链接：http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(17)30758-4 /p p br/ /p

【科学背景】随着对生物膜电活动的研究不断深入，科学家们对电压门控钠（Nav）通道的关注日益增加。Nav通道在维持细胞膜兴奋性和传递神经信号中起着关键作用，因此对其结构和功能的理解至关重要。在细胞的静息状态下，Nav通道处于非导电状态，而在膜电位去极化时则被激活。这种电压门控机制是维持神经元和肌肉细胞正常功能的关键因素之一。然而，尽管Nav通道的重要性已经被广泛认识，但对其结构与功能之间的关系仍存在许多未解之谜。特别是，在不同的功能状态下Nav通道的结构差异，以及这些结构变化如何影响其电生理特性，是当前研究的关键问题之一。此外，Nav通道的异常功能与多种疾病的发生和发展密切相关，因此解析Nav通道的结构与功能关系对于疾病治疗和药物开发具有重要意义。为了解决这些问题，清华大学/深圳医学科学院颜宁团队利用人类Nav1.7作为模板，通过有针对性的突变设计和结构分析，尝试揭示Nav通道不同结构状态之间的关系。研究人员关注于导电孔道结构域（PD）和电压感应结构域（VSDs）之间的相互作用，并通过解析Nav1.7的变异体结构，探索了不同突变对通道结构和功能的影响。最终，该研究解决了Nav通道结构与功能之间的关系，并提供了对Nav通道不同功能状态的结构描述。通过这些结构分析，研究人员揭示了Nav通道在不同状态下的结构差异，为进一步理解Nav通道的电生理机制奠定了基础。此外，通过揭示Nav通道的结构与功能之间的关系，该研究为相关疾病的治疗和药物开发提供了重要的参考依据。【科学图文】图1概述了研究者对Nav1.7变体的有理设计，以探究其结构与功能之间的关系。图中展示了人类Nav1.7（M11）的11个点突变的分布图，其中PD的九个位点被替换为来自NavPaS的相应残基，生成了变体M9。通过对Nav1.7变体的激活和静态失活I-V曲线进行右移的分析，研究者发现，在引入VSDI和VSDII两个额外突变的情况下，Nav1.7-M11的曲线右移更为显著。根据这些I-V曲线，研究者推测在没有膜电位的情况下，纯化的M11可能呈现出一个封闭状态失活（CSI）的构象。实际上，M11-class I的结构与野生型通道相比存在显著差异，表现为PD紧密关闭和第一个重复（VSDI）中完全向下的VSD。此外，VSDII朝胞内一门控电荷的方向移动。整体而言，Nav1.7-M11或M11指的是M11-class I的结构。对Nav1.7-M9进行了Cryo-EM分析，得到了与β1亚基复合的三维电子显微镜重建，分辨率为2.9 &angst 。结构比较显示，M9的PD、VSDIII和VSDIV的胞外环（ECLs）与WT和M11的结构一致。然而，M9的构象处于WT和M11之间的中间状态，其PD几乎与M11相同，而VSDI和VSDII与WT相似。M9的总体构象在很大程度上类似于M11的第II类构象，除了其VSDII完全上升。HOLE计算揭示，M9细胞内门的狭窄点半径几乎与M11相同，比WT窄约1.5 &angst 。M9中PD的收缩与之前的分析一致，即引入更大的疏水残基在窗孔中增加了打开孔道的能垒。这观察结果与M9激活的I-V曲线右移一致。图1. 我们对Nav1.7变异体的理性设计概述。研究者通过图2的结构比较揭示了Nav1.7-M9与Nav1.7-WT之间的结构差异。尽管在整体结构上VSDs相似，但是在VSDI和VSDII中存在轻微的构象偏离。在M9中，VSDI呈向上的构象，而VSDII完全向上。与此同时，在M9中，S4-5I段向中心轴移动，S4-5II和S5II之间的连接发生显著变化，肘部的形态由未卷曲的锐利弯曲转变为弯曲的螺旋。这些结构差异导致了S6II中部的α到π螺旋转变。尽管M9与WT之间VSDs的整体相似性，但PD区域发生了显著的结构偏离，包括S6II和S6IV片段的α到π转变，以及S4-5I与相邻的S4-5II和S5II的协同运动。这些发现深化了我们对Nav1.7通道不同构象状态的理解，为进一步揭示Nav通道的结构与功能关系提供了重要线索。这有助于我们更好地理解Nav通道的生理功能，并为未来设计更有效的药物靶点提供了理论基础。图2. Nav1.7-M9和Nav1.7-WT之间的结构差异。研究者进行了图3的实验，旨在检查Nav1.7的两种变体Nav1.7-M2和Nav1.7-M4的构象是否与野生型（WT）相似。图3显示了Nav1.7变体的电生理特征和其结构。在图3A中，研究者解释了为何减少PD中的突变数量，以减少对通道整体结构的影响。通过实验发现，PD中的某些突变会导致结构的显著变化，而其他突变则不会引起这种变化。图3B展示了不同Nav1.7变体的激活和稳态失活曲线。通过比较这些曲线，研究者能够评估不同突变对通道活性的影响。结果显示，单点突变L866F或G1454C导致激活曲线向右移动，而T870M则导致向左移动。当这些突变组合在一起时，如在Nav1.7-M2中，激活曲线的移动更为显著。此外，图3B还表明，Nav1.7-M2的静态失活曲线与WT几乎相同，这表明其构象可能与WT相似。最后，图3C展示了Nav1.7-M2和Nav1.7-M4的结构与WT的对比。结果显示，尽管这些变体具有不同的突变，但它们的结构与WT几乎相同。这意味着尽管进行了这些突变，但通道的整体结构并未发生明显变化。图3. 两个Nav1.7变体的构象与WT相同。研究者通过对Nav1.7-M9和Nav1.7-M11的结构分析，展示了它们的构象异质性相较于Nav1.7-M2和Nav1.7-M4的增加，并将结果呈现在图4中。图4分为两个部分（A、B），突出显示了Nav1.7-M9和Nav1.7-M11的构象异质性和S6片段的结构变化。在图4A中，研究者利用最终的3D重构粒子的百分位数来表示构象的异质性。结果显示，Nav1.7-M9和Nav1.7-M11比Nav1.7-M2和Nav1.7-M4具有更高的异质性，表明这些突变体在结构上更加灵活。这些发现为理解Nav1.7通道的结构动态提供了重要线索。在图4B中，研究者观察到S6片段的α→π转变与突变数目的增加相关联，这表明突变引起了PD的收缩。具体地，对于Nav1.7-M9和Nav1.7-M11，S6II和S6IV的中间螺旋转变为π型，导致PD的紧缩。而对于Nav1.7-M2和Nav1.7-M4，尽管将S6IV建模为α螺旋，但局部密度的模糊性暗示着存在另一种构象，这与存在调节剂毒素的情况下对Nav1.7进行的3D重构中观察到的情况类似。综上所述，图4的结果揭示了Nav1.7-M9和Nav1.7-M11的构象异质性及其与突变引起的PD紧缩之间的关联。这为进一步理解Nav通道的结构动态和功能调控机制提供了重要线索，有助于指导相关药物设计和疾病治疗的研究。图4. Nav1.7-M9和Nav1.7-M11的构象异质性增加。研究者通过对五种Nav1.7变异体（WT、M2、M4、M9和M11）的性质和冷冻电子显微镜分析，深入探讨了钠通道的结构和功能关系。在WT通道中，PD呈现放松的构象，具有四个窗孔和一个类固醇样密度。对这种构象的描述为放松的PD。相比之下，M9和M11中的S6II和S6IV经历了α到π的螺旋转变，导致中央腔体体积减小，窗孔减少，细胞内门密封，不再容纳脂质，形成了紧密的PD。至于M2和M4，尽管构象与WT相似，但由于密度较短，GDN的分配变得具有挑战性。研究者发现，突变数量的增加与S6片段的α到π转变呈正相关，即PD的紧致度增加。结合不同变异体的结构特征，研究者提出PD可以呈现放松、中间和紧密三种状态。这一研究揭示了非导电PD可能对不同构象存在多样性。在研究电压门控离子通道的结构中，研究者通常难以将功能状态明确地分配给结构。通过系统的电生理和冷冻电子显微镜表征，研究者为理解电压依赖激活和静态失活的I-V曲线提供了新的见解。通过预测Nav变异体在静息状态下的结构，研究者为捕获静息态结构提供了指导，认为这些结构将具有类似于M9和M11的紧密PD构象。图5. Nav通道PD的结构-功能关系。【科学结论】本文揭示了电压门控离子通道（Nav）的结构与功能之间的关系，特别是与膜电位变化相关的通道构象的变化。通过系统地分析人类Nav1.7的突变体，研究人员阐明了通道在不同功能状态下的结构差异，并提出了多种可能的通道构象，包括放松状态、中间状态和紧密状态。这些发现不仅深化了对电信号传导的理解，而且为开发新型Nav通道药物靶点提供了重要线索。此外，本研究强调了电生理特性与结构构象之间的密切关联，为将来设计更准确的离子通道药物提供了启示。这一研究方法和结果对于理解其他类型的电压门控离子通道以及其他膜蛋白的结构和功能关系也具有指导意义。原文详情：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2322899121