分型

近日，湖南大学谭蔚泓院士团队与浙江大学医学院附属第一医院黄河教授团队开发了一种基于核酸适体的质谱流式技术，用于单细胞的细胞表面蛋白分析，旨在为疾病的精准分子分型提供一个新的平台技术。该方法不仅能够实现培养细胞的分子分型和分类，还能结合机器学习，实现临床样本亚型的分类。该方法极大地扩展了核酸适体的应用领域，并为疾病的分类和诊断提供了新方法。　　背景介绍：　　高度异质性是恶性肿瘤的重要特征，同一疾病的不同亚型可能对临床治疗有着完全不同的反应。因此，疾病的精准分子分型对其诊疗研究具有重要意义。虽然基因组测序和转录组测序已经成为最常用的分类策略，但它们无法提供蛋白质的表型和功能数据。单细胞水平的膜蛋白分析将为疾病分型提供重要信息。流式细胞术提供了高通量的单细胞测量技术。然而，由于荧光光谱重叠问题，限制了荧光流式细胞术的多元分析能力。质谱流式作为一种先进的替代方法，具有信号重叠小和细胞背景噪声低等优点，已展现出在一次实验中同步测量超过40个细胞参数的能力。尽管质谱流式技术在多路复用单细胞分析中的巨大潜力，但其在肿瘤分类中的潜力受到识别探针种类不足的限制。　　核酸适体作为一种新型的识别配体，具有特异性高、合成简单、免疫原性低、修饰方便等优势。此外，以完整的活细胞为筛选对象，可以通过Cell-SELEX（指数富集配体进化技术）获得大量能够特异性识别细胞膜蛋白标志物的核酸适体。　　本文亮点：　　基于以上研究背景，湖南大学谭蔚泓院士团队联合浙江大学医学院附属第一医院黄河教授团队设计、合成了一种由二乙烯三胺五乙酸（DTPA）基元组成的聚合物，用于螯合多个金属离子。然后，选择了一系列识别不同细胞表面生物标志物的核酸适体，每个适体分别与螯合了不同金属离子的聚合物偶联（Apt-MICP）。最后，评估了基于Apt-MICP的细胞表面蛋白分析在培养细胞和临床样本中用于血液恶性肿瘤（HM）精确分类的潜力（图1）。图1. 基于核酸适体的质谱流式分析技术用于血液恶性肿瘤的分子分型作者首先对聚合物进行了设计与合成，并通过点击化学将其与核酸适体相连（图2a）。利用琼脂糖凝胶电泳和高效液相色谱对产物进行表征，证明了sgc8c-MICP的成功合成（图2b，c）。同时，在核酸适体上修饰上荧光基团，利用荧光流式验证了sgc8c-MICP仍然能够靶向CEM细胞，而不会结合Ramos细胞（图2d，e）。图2. sgc8c-MICP的合成与表征　　在证明了该策略的有效性之后，作者挑选了15条相关的核酸适体，将其连接上螯合了不同金属离子的聚合物，得到15条Apt-MICP。将15条核酸适体联用，依次对8种血液恶性肿瘤细胞系进行结合，通过质谱流式进行分析。将得到的结果进行归一化，并用热图进行展示（图3a）。利用viSNE降维分析方法对分型结果进行分析，实现8种细胞的区分（图3b）。结合无监督的主成分分析方法，实现血液恶性肿瘤细胞系更精确的区分（图3c）。图3. 血液恶性肿瘤细胞系的细胞表面特征分析及分类　　利用上述合成的15条Apt-MICP，结合五种相关的抗体，实现了31例血液恶性肿瘤临床样本（包括AML、ALL、B淋巴瘤以及CML四种亚型）的分子分型（图4a）。由于临床样本的异质性高，作者利用机器学习的方法进行PLS-DA建模，并成功将四种亚型的样本区分开来（图4b），总体准确率达到了100%（图4c）。图4. 临床样本训练集的分子分型和分类　　为了进一步验证该模型的有效性，作者又收集了15例临床样本，得到了分子图谱（图5a）。将分型结果输入到模型当中，实现对每个样本亚型的判定，总体准确率达到了80%（图5b）。图5. 临床样本测试集的分子分型和分类　　总结与展望：　　综上所述，该研究开发了一个基于核酸适体的质谱流式检测平台，用于精确的癌症分类。作者合成了一系列核酸适体-金属标签探针，并证明了它们在细胞类型特异性结合以及质谱流式检测方面的良好性能。通过用15个核酸适体探针分析细胞表面特征，可以很好地区分8个HM细胞系。此外，通过结合机器学习（PLS-DA），对HM临床样本的四个亚型构建了一个高质量的分类模型，在训练集中分类总准确率为100%，在测试集中分类总准确率为80%。基于这些结果，基于核酸适体的质谱流式平台有望在其他疾病的分类和诊断中得到广泛应用。该工作以Research Article的形式发表在CCS Chemistry。

罗氏454测序在HLA分型方面的应用由来已久。最近，奥地利一实验室对临床样本通过GS Junior测序实现了高分辨率分型，该平台已经于去年底通过欧洲认证，将在纳入奥地利的医疗保险体系，用于病人移植前配型。 负责该实验的研究人员表示通过GS Junior可以高效、低价以及高分辨率对HLA基因进行分型，结果可用于移植前的配型。该实验室自主建立了测序前样本制备自动化方案，测序实验方案，以及测序后的生物信息分析流程，结合GS Junior的高通量单克隆测序，可以达到现有的Sanger测序HLA分型准确性，而又拥有成本和价格方面优势，足以代替原有方法。 在目前的实验中，一次GS Junior实验可10个样本、每个样本17个外显子同时测序，这些测序位点既包括常用的HLA基因分型测序外显子如HLA I类、II类基因的第2、3外显子，而且为进行高分辨率判断，还包括了额外的部分内含子和外显子区域如HLA-C基因的第7外显子。 文库制备的自动化方案依靠Hamilton的自动化移液平台实现，仅需要一个实验员2个小时的手工操作时间，就可以满足该平台的通量需求，因而保证了GS Junior平台的临床应用。数据分析方面，采用了Conexio公司的一款基于454测序数据而开发的软件，实验室成功建立对大量数据有效数据分析流程。 该实验室在2012年的这一实验平台对172个病人进行分型，这些病人已有Sanger测序数据以及部分亲属的Sanger测序结果。比较后，发现GS Junior的结果与Sanger结果一致，部分结果甚至达到了更高的HLA基因型分辨率，从而获得了平台认证。 454平台之外，该实验室曾尝试使用其他二代测序平台进行HLA测序，但从目前的数据结果来看其他平台的数据还不能到达HLA分型的要求，主要原因在HLA分析对读长要求高，只有在足够长的读长下才可以保证分型判断的准确性。 除了该实验室自主开发的这一测试之外，罗氏也有基于454平台的HLA分型试剂盒GType HLA Kit可进行高分辨率及中分辨率的分型，此外也有其他实验室在利用454平台开发自己的实验流程。随着更多这类试剂盒及自动化方案的推出，相信将为临床等相关应用提供更多参考信息。

什么是KASPKASP (kompetitive allele specific PCR，竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应) 是一种基于单核苷酸多态性(SNP) 的新型基因分型技术。该技术基于PCR 反应结束后的荧光读取，每孔采用双色荧光检测一个样本一个位点可能的两种基因型，是目前最为高效和经济的基因分型手段之一。下面我们来看看如何通过盘古qPCR仪进行KASP基因分型检测。KASP 工作流程第一步：设计对应的探针与引物，引物一共是三条，两条带有荧光接头的分型上游及一条通用下游（下图A）。探针一共是四条，两条荧光探针和两条淬灭探针（下图B），荧光探针与淬灭探针是互补的，且荧光探针是与特异性上游引物的接头部分序列(tag sequence)一致。第二步：通过qPCR仪进行PCR扩增。在第一轮PCR扩增中，等位基因特异引物(3'末端能配对的)就可识别特定等位基因模板，完成等位基因识别，反向通用引物也会结合并完成整个PCR过程，在此阶段，荧光标记的探针仍与其互补的淬灭探针结合，并且不会产生荧光信号。从第二轮PCR扩增开始，产物中出现携带通用标签序列(tag sequence)的模板，这步完成把通用标签序列引入与SNP对应的PCR产物中。随后携带荧光的探针通过与tag互补的DNA链结合而添加到PCR产物中，因此不再与其互补的淬灭探针结合，从而产生荧光信号。PCR过程中如何保证探针和引物都能按照预期进行结合呢?因为设置了降落PCR的程序，可以保证探针及引物的分开结合。当退火温度高时，引物因为Tm值高，会先与模板进行特异性的结合，然后在Taq酶作用下进行扩增，从而增加探针扩增的原始模板。随着退火温度降低，探针开始结合模板，然后产生荧光信号。第三步：盘古qPCR检测运行后，在SNP分析菜单下获取KASP数据。盘古快速荧光定量PCR系统助力KASP基因分型检测&bull 升温速度可达8.5℃/s，一次快速完成96个基因分型反应并出具结果，产物得率高，特异性好&bull 温控精度±0.1℃满足KASP对扩增温度的严苛要求，确保识别单个碱基差异的特异性&bull 支持12列温度梯度功能，便于快速优化KASP扩增所需条件&bull 光波导顶部检测，无边缘效应和光程差，无需校准&bull 6色检测通道，支持各种常用荧光标记，兼容常用KASP分型试剂盒KASP应用KASP技术具有灵活、便宜、准确等特点，相比于其他技术，具有一定的灵活性，更容易实现高通量和自动化检测。另外，KASP采用的是通用探针，可以与各种不同的基因特异引物配合使用，而不需要针对每个特定的位点进行探针合成，这极大降低了实验的试剂成本。该技术目前已在动植物育种、种质资源鉴定、遗传图谱构建和种子纯度鉴定等领域得到了广泛的应用。