故障排查

液相色谱是我们实验室十分常见且应用范围非常广泛的仪器之一，提到使用或方法开发可能各位看官都非常得心应手了，但是每当仪器出现问题时，小伙伴们想必是很头痛的吧。莫怕，今天小编就跟大家分享一个特别实用的故障排查方法——分段排查法。什么是分段排查法？分段排查法是通过分段试验，逐次缩小故障范围，直到找到故障点，该方法广泛应用于网络、交通、电路等众多领域，可以快速，便捷的诊断出故障来源，在液相色谱系统问题排查中起着十分重要的作用。接下来就跟老赵头一起来看看如何进行分段排查法进行液相色谱故障排查吧。HPLC分段排查实施步骤图一 液相色谱系统排查位置作为国产色谱柱的第一品牌，我们色谱柱的工程师经常会接到用户的反馈说柱压高了。仪器监控的压力升高，就一定是柱压高了吗？我们不能轻易做出结论，不能发现泵显示面板或工作站监控的系统压力升高就觉得是柱子堵了。系统压力监测由压力传感器完成，大多数液相色谱仪的压力传感器安装于泵头位置，系统压力通常由柱前压力、色谱柱反压、柱后压力组成。色谱实验过程中，养成良好的实验习惯，记录每天色谱柱及系统背压，当系统压力异常时可快速排查。当实验过程中压力升高时，想判断是不是色谱柱堵了还是很方便的，只需断开色谱柱连接，如图一中3和4的位置，断开3排查色谱柱，断开4排查保护柱或在线过滤器。若确定不是色谱柱及保护柱或在线过滤器堵了，可以用直通连接系统，分段排查液相色谱各模块。 01 检测器排查整个系统最末端的就是我们的检测器连接的废液管了，如图一中1位置所示。他除了排废液的作用之外，还给我们的流通池提供一定背压，防止流通池内产生气泡，长度是有要求的，请勿随意裁剪，一般装机时废液管是在实验台前端，有时关抽屉会不注意挤压到废液管或有弯折或堵塞的情况，这些情况都会造成系统压力升高，我们可以观察废液管排除此类情况。图二 背压管若废液管没有上述问题，我们进一步往前排查，断开检测器入口处接头，如图一2的位置，若压力降低，那么我们可以判断有可能是流通池堵了，进行相应的冲洗，若无法自行处理，可联系售后工程师。若断开位置2压力没有显著降低，则堵塞部位应该在其前端，我们继续往前排查。 02 柱温箱排查由于柱温箱内管路结构简单，排查比较方便，我们只需先检查下直通两端管路接头有无变形，有时peek管路使用时间久了会变形，当与色谱柱接触拧紧后会造成压力升高，此种情况，我们可以裁剪掉变形的管线即可。另外如管路堵塞，需冲洗或更换管路。 03 自动进样器排查由于市面上各品牌的自动进样器流路设计各不相同，按照样品进入样品环的方式分为两大类推注型和拉注型，拉注型自动进样器进样针在Inject状态下与进样口及其他管路组成闭合流路的，代表类型如安捷伦1260 、岛津Sil-20、赛默飞U3000等型号，这些仪器当进样针或针座堵塞时会导致压力升高，需要反冲或更换配件；而推注型的自动进样器，由于进样针将样品注入进样环后不参与进样流路切换，故进样针及针座即使堵塞也不会导致系统压力升高，代表如Wisys5000自动进样器，赛默飞AS-AP离子色谱自动进样器等。 04 泵的排查若自动进样也没有堵塞，那么堵塞的部位就是泵压力传感器之后，进样器之前的部位，此间断容易堵的部位是泵混合器、U型管等，可拆解超声清洗，必要时更换。有小伙伴可能会说单向阀、溶剂吸滤头也容易堵，是的！这些部位也是也容易堵，但他们导致的是压力低。接下来我们看看其他压力问题吧。 05 其他压力问题在液相色谱故障中涉及到压力跟泵有关系的案例还是很多的，压力升高，无压力，压力低，压力波动等。我们接下来具体看看。1. 无压力这种情况多数为不过液造成的，如管路中溶剂跑空，或单向阀处有气泡，无法正常吸液，或密封圈磨损，或是压力传感器故障或连接问题造成。防跑空小妙招：对于溶剂跑空的问题，我们有个小妙招可以解决此问题，设置泵的最小压力限值，设置数值如0.01等，另外在工作站中关注“瓶填充”中流动相瓶的容积，使设定值与溶剂实际量一致，当溶剂跑空时都会自动停泵。2. 压力低泵可以过液，但流量低于设置流量，此时多半是因为溶剂吸滤头、单向阀或泵内过滤组件堵塞造成,亦有接口位置漏液造成。3. 压力波动在流动相充分脱气后，有可能是气泡憋在单向阀位置，适当排气即可解决，或是其他位置有气泡造成，大流速purge观察效果。4.purge时高压有的小伙伴可能遇到过purge时超压报警停泵的情况，根据实际情况排查purge阀阀芯或主动阀过滤白头等位置。总结最后我们再来回顾一下当我们遇到液相系统压力高时应该如何排查，为了方便小伙伴们记忆，小编已将思维导图贴在下方。说明：本文仅针对大多数液相色谱仪的通常状况进行排查，不同品牌不同型号的液相色谱仪工作站功能及硬件结构有所不同，请参见自己使用的液相色谱仪手册或官方指导使用维护。

p 　　若要针对一个不同尺寸的柱调整一种美国药典(USP)方法或满足未能满足的系统适应性标准，在没有重新确认方法的情况下可进行何种程度的修改? br/ /p p 　　一位同事最近要我为“LC故障排查”写一篇最新报道，论述美国药典公约现行方法液相色谱法(LC)专业人员谈话时，这都是一个关于研究范围的热门话题。当前所讨论的指导准则源自美国药典第621章(由美国药典[USP]进行简化，此处为& lt 621& gt )(1)。美国药典至少每两年更新一次，因此最好查阅最新版本查看是否有任何变化。我在此处使用的是2017年5月1日生效的“美国药典40-国家处方集35”(USP 40-NF 35)(1)。 !--621-- !--621-- /p p 　　首先我要指出一种我经常遇到的错误观念。由于USP& lt 621& gt 已经成为色谱法调整规则的事实标准，许多使用者认为这意味着所有方法。事实上，& lt 621& gt 仅适用于美国药典中公布的专著所述方法。这意味着其不适用于实验室中开发和验证的方法、科学文献中获取的方法或从其他来源得到的方法。综上所述，大多数指导准则都可作为其他许多类型的方法的调整依据。例如，您可以将其用作自有实验室方法调整标准操作规程(SOP)的依据，但在此种情况下，它们只是您自己的指导准则，而非美国药典公约指导准则。最后，当前论述中的指导准则解释完全基于我自己的观点，而非美国药典公约或他方的官方意见。 !--621-- !--621-- !--621-- !--621-- /p p 　　 strong 系统适用性 /strong /p p 　　良好的系统适用性测试是任何液相色谱法可靠运行的关键。此项测试有助于验证整套方法的效果是否好到足以产生精度和准确度均满足要求的分析结果。系统适用性测试通常要对保留时间、柱效率、分辨率、峰拖尾、检测器响应值、精确度和准确度等特征进行一定程度的评估。因此，美国药典对系统适用性的密切关注也就不足为奇(1)： /p p 　　 i 指定色谱系统可能需要进行调整，以满足系统适用性要求。为满足系统适用性要求而对色谱系统进行的调整不是为了弥补柱故障或系统运行失常。只有当调整或换柱所得色谱符合官方程序规定的所有系统适用性要求时，调整才能得到认可。 /i /p p 　　我对这句话的理解是：若调整未超出推荐范围，且经调整后通过了系统适用性测试，则调整将获得认可。若要继续使用该方法，我只需对调整进行文件记录(并满足我公司所有内部要求)，无需进行重新验证。若超出调整限值，调整将被视作方法修改或更高，因此需要进行一定水平的重新验证。 /p p 　　接下来让我们探讨一下USP& lt 621& gt 所列各种调整情形。部分调整可适用于等度或梯度方法，而其他调整则不具普适性。我将各种调整情形总结于表1中。表1最好连同下列论述一同解读，因为下列论述考虑了调整的细微差别。我对此无法找出具体陈述，但表1所列各种变化适用于反相分离，因此我假设这就是意图。 !--621-- !--621-- /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201802/insimg/49e12fb5-0fcf-4d96-9a17-17aed7b5f760.jpg" title=" 表1.jpg" / /p p 　　 strong pH /strong /p p 　　如表1所示，流动相缓冲液pH容许调整范围为± 0.2单位。乍一看，这就像是一个合理容限。但实际上，大多数实验室在使用pH计时都会考虑± 0.05-0.1pH单位的标准实验室变化。因此应将标准变化量乘以二。例如，标称pH为2.5的方法可在“2.3≤pH≤2.7”范围内进行调整。应用这些指导准则时必须特别仔细-我收集的一副色谱中一个分辨率较高的峰对退化成了pH变化仅为0.1单位的两个几乎没有任何区别的凸起。其他有关pH调整的注意事项参见最新出版的“LC故障排查”pH部分(2)。 /p p 　　 strong 缓冲液浓度 /strong /p p 　　USP指导允许缓冲液浓度存在± 10%的变化幅度。我对此没有异议，但我怀疑您可能无法观察到反相法中如此微小的变化，除非该方法此时缓冲液不足或者位于饱和点附近。回想上月刊(3)表1相关正交影响的论述，缓冲液浓度的双倍变化在反相条件下不会改变选择性。我认为缓冲液浓度为25mM的方法在色谱不发生明显变化的情况下无法在10-50mM范围内进行调整。就反相液相色谱而言，± 10%的限值范围对我没有任何意义。尽管如此，离子相互作用较为重要时(例如离子交换色谱法或亲水作用色谱法(HILIC))，缓冲液浓度能够发挥重要作 因此，我们不能说缓冲液浓度永远不会改变色谱分离。 /p p 　　 strong 流动相的组成 /strong /p p 　　表1所列流动相组成相关说明似乎有些令人困惑：流动相微量组分± 30%相对变化，但不超过± 10%。几个实例便可将其解释清楚。首先考虑50:50A-B的流动相，其中“A”表示液体部分(缓冲液或水)，“B”表示有机物(通常为乙腈或甲醇)-50%的30%是15%，由于15%大于10%，溶剂浓度辩护不能超过10%。因此，我们可以从40:60 A-B转变为60:40 A-B。这是一项简单的计算，但变化对我而言有些极端-您什么时候见过流动相乙腈变化达± 10%时仍能正常运行?要谨记最近关于保留的论述中所提出的“三倍法则”(4)，流动相有机部分变化10%可使保留系数(或良好保留峰的保留时间)变化三倍左右。因此，在使用美国药典流动相调整指导准则时务必小心仔细。 /p p 　　A和B的浓度存在显著差异会出现何种情况(例如：5%的缓冲液和95%的已经)?此种情况下，缓冲液浓度的30%等于1.5%，远低于± 10%的限值。此时的容许范围为3.5:96.5~6.5:93.5 A-B 看起来是一个合理的容许范围。 /p p 　　三元流动相的计算稍微复杂一些：例如，有35：5:60 A-B-C组成的流动相，其中C是指第二种有机溶剂。该例中，30%的30%等于10.5%，因此A的变化限值为10%。我们可使用上文针对B计算得出的1.5%调整率。容许调整可以是A的35± 10%与B的5± 1.5%以及C剩余部分的任意组合。您会发现这里允许存在相当明显的变化-再次提醒大家注意这些变化。 /p p 　　 strong 紫外检测器波长 /strong /p p 　　检测器波长指导准则有点儿领人费解。检测器波长不容改变，但如果第二个检测器超出校准值3mm以内，则可投入使用。那么，如果我不想使用当前的波长，我会使用一个无法正常运行的检测器吗?当然不会!调整说明就像来自检测器标定还是一种常见问题的时代的“古董”。如今使用的大部分紫外(UV)检测器在启动后都可自动校准检查，并在过程中进行自校准。我已经20年没有见到过紫外探测器校准问题了，估计只有掉落或其他误用情形才会导致检测器出现校准问题。 /p p 　　 strong 柱长和颗粒尺寸 /strong /p p 　　经允许的柱相关修改是美国药典做出最大改变以改善应用灵活性的领域之一。直到2012年(USP 35-NF 30)，允许发生的变化还十分有限。例如，柱长L可改变+70%，这看起来幅度相当大。您可以将150mm柱换成250mm柱(250/150=± 67%)或将柱长从150mm调整为100mm(-33%)或50mm(-67%)，似乎都不会有什么问题。您还可以将颗粒尺寸dp减小50%，但不能增加。因此，5 sub μ /sub m(-40%)，但不要改的过小。上述推荐做法存在一个明显缺陷，就是：其忽略了柱长和颗粒尺寸对色谱柱塔板数以及分辨率的影响。此外，这些推荐做法无法将5 sub μ /sub m颗粒柱调整为≤2 sub μ /sub m颗粒的超高压LC(UHPLC)柱，或将UHPLC方法调整为更强大的日常作业用5 sub μ /sub m颗粒。因此，尽管这些容限已使用多年并可实现极具实用性的变化(例如：从旧式250mm 105 sub μ /sub m柱转换为目前广泛使用的更标准的150mm 5 sub μ /sub m柱)，但它们并不适合如今的实验室环境。 /p p 　　但现在有一种更加灵活的容限，其采用更加严密的科学依据，核心内容是确保色谱柱塔板数和相应的分辨率具备相当高的稳定性。由于板数是柱长度与粒径之商的函数，L/dp比在这里是一项关键因素。只要L/dp保持恒定，便可改变柱长和粒径 该结果中的容许变化范围为-25%~+50%，其具有一定的意义，用为市售产品的离散柱长和粒径数量有限。 /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201802/insimg/1a7648b5-dbe1-4770-afa2-b252c2f642d8.jpg" title=" 表2.jpg" / /p p 　　表2内容摘自美国药典现行版本(1)，包含部分可实现更改的实例。美国药典许多专著方法已相当落后，规定的柱规格为250mm× 4.6mm，10-μmdp(L/dp=25000)。您可以将该方法轻松升级为150mm× 4.6mm，5 sub μ /sub mdp(L/dp=30000) 如此一来，L/dp可增加20%，未超出限值范围。若倾向于使用较小的颗粒，则可使用100mm× 4.6mm，3 sub μ /sub mdp(L/dp=33000) 注意，我在这里为方便陈述而对数值进行了四舍五入。您甚至可以使用UHPLC以及装满1.7 sub μ /sub m颗粒的50mm管柱(L/dp=29400)，且仍不超出限值范围。上述所有管柱均提供大致相同的板数，因此可实现相同的分离效果。此种情况的假设条件是所有管柱都具备相同的化学性质(具有相同的键合相 来自相同制造商 采用相同包装品牌)。然而，我们不需要过于担心化学变化，因为：若要满足要求，方法还须通过系统适用性测试，任何无法接受的化学变化都会导致系统适用性试验失败。 /p p 　　若使用相同类型颗粒(最常见的颗粒类型是完全多孔颗粒TPP)，L/dp方法效果极佳。尽管如此，从TPP转换为应用日益广泛的表面多孔颗粒(SPP)时，此项技术会出现分化。SPP所提供的板数通常对应尺寸更小的颗粒，因此，采用L/dp方法时粒径可能会产生误导。例如，2.7 sub μ /sub m dp SPP柱具有~3 sub μ /sub m dp SPP柱的背压，但板数却更接近~1.8 sub μ /sub m dp SPP柱。因此，上例中50mm，2.7 sub μ /sub m SPP柱的L/dp=18500：若从250mm，10 sub μ /sub m柱攥起，则剧减26%，但与150mm，5 sub μ /sub m柱相比降低近40%。根据L/dp结果放弃SPP柱并无科学意义 相反，在存在一种可选容限，规定板数N应在相同的-25℃~+50℃范围内保持恒定。此种情况下，SPP柱将是一种可接受的替代技术(假设已经通过系统适用性测试)。 /p p 　　 strong 柱径和流量 /strong /p p 　　只要流量F调整时确保流动相线速度保持恒定，柱径dc便可更改。理论上讲，最大柱效对应线速度随着粒径的改变出现反向增加。针对粒径而调整线速度时最好参照降低的速度。我们当中大多数人都不会担心这种额外的调整，但其包含于方程1(1)中，使所需调整简单明了。除基于方程1而允许进行的更改之外，流量最大调整幅度为± 50%。 /p p 　　 img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201802/noimg/58875b88-b77f-4ce3-9e31-9a9a616735ee.jpg" title=" 1.jpg" / /p p 　　其中，下标标识原柱1和新柱2的变量。 /p p 　　表2所列实例描述了250mm× 4.6mm，10 sub μ /sub m柱以150mm柱一半的流量运行。假设初始流量为1.0mL/min，我们会将流量减小至0.5mL/min，以获得相同的较低速度。尽管如此，较低流量与较大柱长的组合会导致运行时间过长 因此，我们大多数人都会保持1mL/min的流量(容许附加调整范围为± 50%)，以实现更短的运行时间和合理的压力。表2还列示了新柱相对于原柱的压力和运行时间的估算值。 /p p 　　美国药典论述对粒径变化进行了附加详细说明：若板数减少量不超过20%，则传统LC条件(≥3 sub μ /sub m dp)转变为UHPLC(& lt 3 sub μ /sub m dp)(反之亦然)时允许对流量作进一步调整。只要通过系统适用性测试，此种方法可实现一定的灵活性(可能会受到其他限制)。 /p p 　　最后要注意的是，柱尺寸、粒径和流量调整仅适用于梯度方法。虽然可针对此类变化适当调整梯度方法，它们并未含入现行版美国药典 因此，在决定调整梯度方法时必须进行一定的再验证。 /p p 　　 strong 进样量和柱温 /strong /p p 　　只要作用方法正常运行，进样量便可增加或减少。若要大幅增加进样量，一定要注意谱带增宽过度和保留时间变化的情况。减少进样量时一定要确保有足够的信号提供可接受的精确度和准确度。高于和低于拟用新进样量进行的多次进样有助于验证(并记录)变化的鲁棒性和适用性。 /p p 　　柱温变化幅度为± 10℃，但要记住，温度没变化1℃，等度保留时间就会缩短约2%。选择性随温度变化而改变，特别是样本中存在可电离化合物时。改变柱温时务必保证样本临界峰的分离不受影响。 /p p 　　 strong 结论 /strong /p p 　　正如我们所见，美国药典为LC方法调整提供了合理的指导准则。这些容许范围适用于等度方法，但对于梯度方法，其可能会被禁止或不推荐使用，我会再次回到我最开始提出的问题。美国药典指导准则仅适用于美国药典所包含的专著方法的调整。我们认为指导准则不使用于非美国药典规定方法，因此在违反相应规范的情况下不允许更改其他方法。最后，许多公司对美国药典和其他规范性文件都有自己的解释 因此，在决定调整LC方法时必须查阅内部标准操作规程和其他规范性指导。切记：“调整和更改应以文件记录为依据”，因此必须适当保存相应记录。 /p p style=" text-align: right " 【本文由LC/GC杂志供稿，作者：John W.Dolan，LC故障排查编辑】 /p

p style=" text-indent: 2em line-height: 1.5em " span style=" font-family: 微软雅黑 " 在加入实验室的前三天，小A经历了魔鬼般的入职特训，顺利拿到色谱柱状态通关神器，还惊喜地发现可以远程监控仪器状态，约会不再烦恼。就这样，忙碌且充实的生活在不知不觉中往前走了一个月。 /span /p p style=" text-indent: 2em line-height: 1.5em " span style=" font-family: 微软雅黑 " 出来上学工作，不知不觉离家这么久，也不知道爸妈身体怎么样了，是不是也在挂念着我？想念母亲的饭菜，父亲洪亮的声音，心酸的小想念萦绕在小A的脑海中? /span /p p style=" text-indent: 2em line-height: 1.5em " span style=" font-family: 微软雅黑 " 不管怎么样，还是要以饱满的热情投入到实验中的！一定要控制住自己的思念 /span /p p style=" text-indent: 2em line-height: 1.5em " span style=" font-family: 微软雅黑 " “呲呲呲”，咦？这是什么声音？“没事，只是气相色谱漏气了”，说罢，同事像往常一下拿起肥皂泡开始检漏。 /span /p p style=" text-indent: 2em line-height: 1.5em " span style=" font-family: 微软雅黑 " 没想到在先进的分析实验室中还看到了如此传统的检漏方式，在今日份伤感的心情下，眼前这一幕仿佛很熟悉！这不就是爸爸给自行车胎检漏的样子吗？思绪飞扬，多年前和父亲的时光历历在目。 /span /p p style=" text-indent: 2em line-height: 1.5em " span style=" font-family: 微软雅黑 " 都说每逢佳节倍思亲，在异地开始了新的工作和生活，早已不能陪伴在父母身边。躲得过传统佳节难以与亲人团聚的心情，没想到实验室的点点滴滴也饱含着儿时的回忆。真是年度思亲不易躲，平日伤情更难逃！想家的感情再也无法抑制，泪水夺眶而出。 /span /p p style=" line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: center " script src=" https://p.bokecc.com/player?vid=62FDB2965DA6D6739C33DC5901307461& siteid=D9180EE599D5BD46& autoStart=false& width=600& height=490& playerid=2BE2CA2D6C183770& playertype=1" type=" text/javascript" /script br/ /p p style=" text-indent: 2em line-height: 1.5em " span style=" font-family: 微软雅黑 " 日常的分析工作中，最恼人、最耗时的工作当属宕机时的故障排查，操作繁琐，尤其对于实验室新手，更是无从下手。如何快速的故障排查？告别复古式修复方式？ /span /p p style=" text-indent: 2em line-height: 1.5em " span style=" font-family: 微软雅黑 " 安捷伦全新一代8890系列气相色谱系统，内置多种自引导式智能检漏，一键触发，简单、便捷地完成相应部位的测试，将宕机尽可能地扼杀在摇篮里。为实验室仪器的正常运行保驾护航。 /span /p p style=" text-indent: 2em line-height: 1.5em " span style=" font-family: 微软雅黑 " 在小A进入实验室的一个月里，超大工作强度、色谱柱的神秘状态、连续加班以及色谱漏气，每个问题都像一个关卡立在面前。 span style=" font-family: 微软雅黑 color: rgb(84, 141, 212) " strong 扫描图片小程序码 /strong /span /span span style=" font-family: 微软雅黑 text-indent: 2em " ，一起回顾小A在实验室中的烦恼！ /span /p p dir=" ltr" style=" line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: center " img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/d9ff041a-08c5-4269-9295-3997ad3876cb.jpg" title=" 小A奇遇记小程序二维码.png" alt=" 小A奇遇记小程序二维码.png" width=" 468" height=" 312" style=" width: 468px height: 312px " / /p p dir=" ltr" style=" line-height: 1.5em text-indent: 2em " span style=" font-family: 微软雅黑 text-indent: 32px " 好在最终每个问题都迎刃而解，也相信在今后的实验中小A会与8890合作更加紧密，如同挚友一般攻坚克难。 /span /p p style=" text-indent: 2em line-height: 1.5em " span style=" font-family: 微软雅黑 " 小A的实验室烦恼系列故事到此就告一段落了，希望看完本期小A烦恼，同时也思念起父母亲人的你，也赶快表达下对他们的想念吧~8890帮您告别了超大工作强度和加班的烦恼，有更多的时间常回家看看。& nbsp /span /p p style=" white-space: normal line-height: 1.75em text-indent: 2em " span style=" font-family: 微软雅黑 " 相关链接： /span /p p style=" white-space: normal line-height: 1.75em text-indent: 2em " span style=" font-family: 微软雅黑 " 想了解更多？点击查看 a href=" https://www.instrument.com.cn/netshow/C315133.htm" target=" _self" style=" color: rgb(79, 129, 189) font-weight: bold " Agilent 8890 气相色谱系统 /a strong span style=" color: rgb(79, 129, 189) " /span span style=" color: rgb(79, 129, 189) " /span /strong 产品详情 /span /p p style=" white-space: normal line-height: 1.75em text-indent: 2em " a href=" https://www.instrument.com.cn/Buyer/" target=" _self" style=" color: rgb(79, 129, 189) font-family: 微软雅黑 " strong 仪采通 /strong /a span style=" font-family: 微软雅黑 " ，一键直达，快速发布采购需求 /span /p