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UV分光光度计是一款常用于核酸,蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。那么在试验中UV分光光度计又是如何定量的呢?下面我们就以核酸的定量为例来讲述UV分光光度计是如何定量的。核酸的定量 核酸的定量是UV分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸,单链、双链DNA,以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长260nm。每种核酸的分子构成不一,因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸,事先要选择对应的系数。如:1OD的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算,从而得出相应的样品浓度。测试前,选择正确的程序,输入原液和稀释液的体积,尔后测试空白液和样品液。然而,实验并非是一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器,表现出的吸光值漂移越大。其实试验过程中就是这样的,常常会出现一些不确定的因素,导致试验结果的偏差,有些因素是可以避免的,然而有些因素又是不可避免的。
[size=4][font=宋体]分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸,蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。[/font][font=Arial] [/font][font=Arial] [/font][font=宋体]分光光度计的简单原理[/font][font=Arial][/font][font=Arial] [/font][/size][size=4][font=宋体]分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源,通过系列分光装置,从而产生特定波长的光源,光源透过测试的样品后,部分光源被吸收,计算样品的吸光值,从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。[/font][font=宋体]核酸的定量[/font][font=Arial][/font][font=Arial] [/font][font=宋体]核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸,单链、双链[/font][font=Arial]DNA[/font][font=宋体],以及[/font][font=Arial]RNA[/font][font=宋体]。核酸的最高吸收峰的吸收波长[/font][font=Arial]260 nm[/font][font=宋体]。[/font][font=Arial] [/font][font=宋体]每种核酸的分子构成不一,因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸,事先要选择对应的系数。如:[/font][font=Arial]1OD[/font][font=宋体]的吸光值分别相当于[/font][font=Arial]50μg/ml[/font][font=宋体]的[/font][font=Arial]dsDNA[/font][font=宋体],[/font][font=Arial]37μg/ml[/font][font=宋体]的[/font][font=Arial]ssDNA[/font][font=宋体],[/font][font=Arial]40μg/ml[/font][font=宋体]的[/font][font=Arial]RNA[/font][font=宋体],[/font][font=Arial]30μg/ml[/font][font=宋体]的[/font][font=Arial]Olig[/font][font=宋体]。测试后的吸光值经过上述系数的换算,从而得出相应的样品浓度。测试前,选择正确的程序,输入原液和稀释液的体积,尔后测试空白液和样品液。然而,实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器,表现出的吸光值漂移越大。[/font][font=Arial][/font][font=Arial] [/font][font=宋体]事实上,分光光度计的设计原理和工作原理,允许吸光值在一定范围内变化,即仪器有一定的准确度和精确度。如[/font][font=Arial]EppendorfBiophotometer[/font][font=宋体]的准确度[/font][font=Arial]≤1.0%[/font][font=宋体]([/font][font=Arial]1A[/font][font=宋体])。这样多次测试的结果在均值[/font][font=Arial]1.0%[/font][font=宋体]左右之间变动,都是正常的。另外,还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的[/font][font=Arial]pH[/font][font=宋体]值,离子浓度等:在测试时,离子浓度太高,也会导致读数漂移,因此建议使用[/font][font=Arial]pH[/font][font=宋体]值一定、离子浓度较低的缓冲液,如[/font][font=Arial]TE[/font][font=宋体],可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素:由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒,尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响,要求核酸吸光值至少大于[/font][font=Arial]0.1A[/font][font=宋体],吸光值最好在[/font][font=Arial]0.1-1.5A[/font][font=宋体]。在此范围内,颗粒的干扰相对较小,结果稳定。[/font][font=Arial][/font][font=Arial] [/font][font=宋体]从而意味着样品的浓度不能过低,或者过高(超过光度计的测试范围)。最后是操作因素,如混合要充分,否则吸光值太低,甚至出现负值;混合液不能存在气泡,空白液无悬浮物,否则读数漂移剧烈;必须使用相同的比色杯测试空白液和样品,否则浓度差异太大;换算系数和样品浓度单位选择一致;不能采用窗口磨损的比色杯;样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。[/font][font=Arial][/font][font=Arial] [/font][font=宋体]除了核酸浓度,分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度,如[/font][font=Arial] A 260 / A 280[/font][font=宋体]的比值,用于评估样品的纯度,因为蛋白的吸收峰是[/font][font=Arial] 280 nm[/font][font=宋体]。纯净的样品,比值大于[/font][font=Arial] 1.8[/font][font=宋体]([/font][font=Arial]DNA[/font][font=宋体])或者[/font][font=Arial]2.0[/font][font=宋体]([/font][font=Arial]RNA[/font][font=宋体])。如果比值低于[/font][font=Arial] 1.8 [/font][font=宋体]或者[/font][font=Arial]2.0[/font][font=宋体],表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。[/font][font=Arial]A 230[/font][font=宋体]表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,较纯净的核酸[/font][font=Arial] A 260 / A 230 [/font][font=宋体]的比值大于[/font][font=Arial] 2.0[/font][font=宋体]。[/font][font=Arial]A 320[/font][font=宋体]检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品,[/font][font=Arial]A 320 [/font][font=宋体]一般是[/font][font=Arial] 0[/font][font=宋体]。[/font][font=Arial][/font][/size][size=1][font=Arial][/font][/size]
公司欲购买微量核酸定量仪一台,请大家帮个忙,有在使用这个仪器的,可以把仪器牌子型号说一声,给俺参考下http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/brow/em09502.gif。仪器厂家销售商也可以联系15095049758