细胞坏死

韩国学者日前宣布，一项大学间的共同研究阐明了抑制TNF因子活性的一种机理，从而为风湿性关节炎、遗传性过敏性皮炎、哮喘乃至肝硬化、糖尿病、冠心病等炎症或免疫性疾病的预防和治疗开辟了全新方向。 被称为“肿瘤坏死因子”的TNF因子是一种具有多种生物活性的炎性或组织损伤介质，参与了多种复杂疾病的发病过程和病情进展过程。此前医学界已经知道，降低组织内的TNF因子水平将对这些疾病的治疗具有重要价值。但是到目前为止，有关降低TNF水平的研究均围绕着TNF抗体和TNF免疫拮抗剂进行。 此次韩国学者发表的研究结果显示，细胞组织内一种称为Smad7的蛋白质能够抑制或阻断TNF因子的受体传导信号，从而影响TNF的活性。“Smad7”蛋白质增加，将与组成TNF因子信号传导路径的蛋白质TAB2以及TAB3结合，并通过这一结合体阻断TNF因子传导信号，从而减低其活性。在相反的情况下，Smad7蛋白质减少，则TNF受体传导信号受到较少的阻断。 有关研究人员表示，这一成果为临床医疗技术的发展指出了全新方向。Smad7可以中和TNF活性，抑制TNF在组织内的超表达，能够诱导Smad7蛋白质的物质将成为下一步的开发重点。 韩国加川医科大学和成均馆大学的研究人员共同做出了上述发现。这一成果同时将发表在《自然免疫学》杂志网络版上。 TNF被认为是一种致炎性介质，有TNF—α以及TNF—β两种类型，分别来自单核巨噬细胞和活化T细胞。TNF—α具有致炎性、引发细胞坏死和新血管形成等作用。此外，一些研究认为，由于TNF—α可促进内皮素的产生并引起血管壁损伤，表现出促进动脉硬化形成的作用,所以TNF—α还参与了冠心病的诱发过程并影响病程。

一、实验目的1、掌屋凋亡细胞的形态特征 　　2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的特征。相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正常细胞。细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA中，使坏死细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。Hoechst33342是一种活性荧光染料且毒性较弱，它是双苯并咪唑的一种衍生物。与DNA特异结合（主要结合于A-T）碱基区），显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。三、实验用品1、试剂：三尖杉酯碱（HT），300μg/ml，100mmol/L Tris-HCl（pH7.5），5mol/L EDTA缓冲液、碱性裂解液：0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸钠：3mol/L KAc（pH4.8）；异丙醇；70%乙醇；溴酚蓝，蔗糖指示剂。TBE电泳缓冲液，1%琼脂糖，溴乙锭。PI母液：500μg/ml；Ho33342母液：2mmol/L。 　　2、仪器设备：荧光显微镜，电泳仪，电泳槽，微量加样器（1ml，100μl）0.5、1.5ml离心管，载玻片，盖玻片。四、实验材料人早幼粒白血病HL-60细胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培养基在37℃，5%CO2条件下培养。五、方法步骤 1、三尖杉酯碱诱发HL-60细胞凋亡 　　（1）实验前约24小时，接种两瓶HL-60细胞，标记①、②，每瓶含约6ml培养液，置37℃，5%CO2培养箱培养。 　　（2）实验前约2.5小时，当细胞密度达到70%，①号瓶加入三尖杉酯碱200μl，使终浓度为1μg/ml，②号瓶中加入同等量PBS（pH7.4）作对照。共同放入培养箱中继续培养2.5小时。2、Ho33342和PI双重染色鉴别三种细胞 　　（1）染色：将瓶中的细胞摇匀取200μl于1.5ml的离心管中，加入Ho33342母液2μl，PI 20μl，染色15分钟。 　　（2）滴片：取一载玻片用双面胶围成一小室，从离心管中各取以上染色后的细胞悬液10μl，加入小室内盖上盖玻片，荧光镜下用紫外激发光，高倍镜下观察，区别三种细胞，并注意三者比例。六、注意事项1、诱导培养HL-60细胞时间要准确；　　2、荧光显微镜下观察细胞时，由于荧光易碎灭，观察时要尽量快。

最近我养细胞发现小黑点现象很严重，原来对“黑胶虫”一说嗤之以鼻，认为那不过是自欺欺人的借口，觉得怎么也不会发生在自己身上。但是真的就碰上了：要来的细胞传代以后就出现细胞间黑点，细胞空泡化，很多类似凋亡、坏死的细胞，最终细胞漂浮，完全死亡。上述现象很像所谓的“黑胶虫”。我感觉实际是支原体感染以后细胞生长不好造成的碎片和感染原虫的混合体。这种现象的直接原因是支原体等原虫感染，间接表象是小黑点，被以讹传讹成为了“黑胶虫”。光镜下看不到支原体，但是可以看到支原体感染的终末现象——细胞凋亡坏死，释放出大量碎片，看起来就像小黑虫子。查找类似的帖子——很多人是更换血清后出现这种问题；说空气传播的可能是一个培养箱的人都用了同一种血清，而不是可以通过培养箱空气传播；感染最可能是牛源性的支原体，通过产道或血行感染，所以兽用的泰乐菌素比较有效。用plasmocin等抗支原体的药物有效;用巨噬细胞共培养有效（吞噬支原体）；很多人更换进口血清就好了。感染也有个疾病谱，在质和量上从低烈度到高烈度，所谓“细胞生长不受影响”，其实是感染的烈度不高而已；烈度高的感染就出现细胞大量空泡形成，细胞间空旷地带出现大量黑点，细胞最终凋亡、坏死，漂起来。有些国产血清写着建议灭活，其实是挂羊头卖狗肉，那个56度30分钟更多的是为了杀杀支原体的。实际上也有杀不死的。但可以降低产品的风险。我用阿奇霉素（有针对支原体衣原体功效）75-100ug/ml的浓度洗了细胞和加入培养基中，小黑点确实明显抑制。不过我想根治就很难了。据说invivogen公司的plasmocin可以根治，不过就成本来说不如直接更换血清。以上是自己个人总结的一点看法。建议不要总拿子虚乌有的“黑胶虫”来说事。多考虑看不到的支原体，不要还停留在培根时代——只相信自己眼睛看见的。