推荐厂家
暂无
暂无
【序号】:3【作者】:平措卓嘎1,2王剑利1徐燕【题名】:自体造血干细胞移植治疗多发性骨髓瘤的疗效评价及影响因素:单中心真实世界研究【期刊】:西安交通大学学报(医学版). 【年、卷、期、起止页码】:2023,44(03)【全文链接】:https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7ioT0BO4yQ4m_mOgeS2ml3UD1jEw1SpgmMwojC3DSx7U3rDsqM34rgpF1W6HZ22weu&uniplatform=NZKPT
[size=15px][b][font=&][color=#0070c0]1[/color][/font][font=宋体][color=#0070c0]、[/color][/font][font=&][color=#0070c0]GA[/color][/font][font=宋体][color=#0070c0]诱导[/color][/font][font=&][color=#0070c0]KRAS[/color][/font][font=宋体][color=#0070c0]降解[/color][/font][font=&][color=#0070c0][/color][/font][/b][/size][size=15px][font=宋体]作者首先通过筛选了一个自制的化合物库,用含有[/font][font=&] KRAS[sup]G12A[/sup][/font][font=宋体]突变的[/font][font=&]MM[/font][font=宋体]细胞系[/font][font=&]MM.1S[/font][font=宋体]和[/font][font=&]RPMI 8226[/font][font=宋体]鉴定可以降低[/font][font=&]KRAS[/font][font=宋体]水平的化合物,发现藤黄酸([/font][font=&]Gambogic acid[/font][font=宋体],[/font][font=&]GA[/font][font=宋体],)处理可降低两种细胞系中[/font][font=&]KRAS[/font][font=宋体]的水平,而其他化合物没有表现出相似或较弱的效果。进一步实验表明,[/font][font=&]GA[/font][font=宋体]可以以浓度和时间依赖性方式降低两种细胞系中[/font][font=&]KRAS[/font][font=宋体]的水平,以及[/font][font=&] KRAS[/font][font=宋体]的下游[/font][font=&]p-ERK[/font][font=宋体]([/font][font=&]MAPK[/font][font=宋体]通路)和[/font][font=&]p-AKT[/font][font=宋体]([/font][font=&]PI3K[/font][font=宋体]通路)。此外,[/font][font=&]q[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]显示[/font][font=&]GA[/font][font=宋体]不会改变[/font][font=&]KRAS[/font][font=宋体]的转录水平,表明[/font][font=&]GA[/font][font=宋体]可能在转录后水平降低[/font][font=&]KRAS[/font][font=宋体]。[/font][font=&][/font][/size][size=15px][font=宋体]进一步使用蛋白酶体抑制剂[/font][font=&]MG132[/font][font=宋体]发现[/font][font=&]MG132 [/font][font=宋体]部分挽救了[/font][font=&]GA[/font][font=宋体]诱导的[/font][font=&]KRAS[/font][font=宋体]蛋白下调,表明[/font][font=&] KRAS [/font][font=宋体]蛋白降解与泛素[/font][font=&]-[/font][font=宋体]蛋白酶体途径有关,此外,我们采用放线菌酮([/font][font=&]CHX[/font][font=宋体])测定评估显示[/font][font=&]GA[/font][font=宋体]处理后,[/font][font=&]KRAS[/font][font=宋体]的半衰期显著缩短。这些数据表明[/font][font=&]GA[/font][font=宋体]可以诱导[/font][font=&]KRAS[/font][font=宋体]的蛋白酶体降解,进而损害[/font][font=&]MM[/font][font=宋体]细胞中的下游信号转导[/font][font=宋体] [size=15px][b]2、鉴定USP2作为GA的新靶标[/b][/size][size=15px]为了确定GA诱导KRAS降解的靶标,作者合成了生物素标记的GA,发现它保留了在MM细胞中诱导KRAS降解的能力,进一步利用该探针开展Pulldown+MS,鉴定到的互作蛋白中,HSP90和USP2这两种与蛋白质降解相关。HSP90是一个已知的GA靶点,作为伴侣蛋白,它可以调节各种蛋白的稳定性,然而HSP90抑制剂STA9090处理不能降低MM.1S细胞中KRAS的蛋白水平,表明KRAS不是 HSP90的底物。因此,作者更加关注USP2,一种新型的GA互作蛋白。通过Pulldown+WB、免疫荧光共定位、竞争实验、CETSA、DARTS实验共同证实了USP2是GA的直接相互作用蛋白。此外,GA在体外相对特异性地抑制USP2的去泛素化活性( [/size][size=15px][b]3、半胱氨酸284对于GA与USP2的共价结合至关重要[/b][/size][size=15px]然后,作者研究了GA和USP2之间的相互作用模式,发现碘乙酸(IAA,一种半胱氨酸烷化剂)与USP2的预孵育完全抑制了GA与USP2的结合,表明GA可能与USP2的半胱氨酸共价结合,这与之前的报道一致,即GA可以通过半胱氨酸残基与其靶标共价结合。接着,通过USP2蛋白与GA一起孵育后质谱鉴定,发现Cys284残基被GA共价修饰。此外,通过构建USP2的两个突变体(C276S、C284S),发现GA 与 USP2(C276S)结合,而不是USP2(C284S),表明GA可以与USP2的Cys284残基特异性形成共价键。结合动力学显示GA 以剂量和时间依赖性方式与 USP2 共价结合,分子对接显示P565和 R289对于形成GA与USP2结合的口袋至关重要。同样通过蛋白点突变实验发现P565 和 R289对GA-USP2相互作用至关重要 [/size][size=15px][b]4、USP2调节KRAS的稳定性[/b][/size][size=15px]前面发现GA降低MM细胞中KRAS蛋白水平并抑制USP2活性,表明USP2可能调节KRAS的稳定性。作者利用CRISPR/Cas9敲除MM.1S和RPMI 8226细胞系中的USP2,发现敲除USP2导致KRAS蛋白水平降低,mRNA水平不变, KRAS的下游效应子p-ERK水平也显著降低。此外,敲除诱导的KRAS下调可被两种细胞系中的蛋白酶体抑制剂MG132挽救。结果表明USP2可以增强KRAS的蛋白质稳定性。进一步研究发现USP2与KRAS互作并使KRAS去泛素化,表明KRAS是USP2的底物 [/size][size=15px][b]5、USP2敲除抑制MM细胞的增殖[/b][/size][size=15px]鉴于KRAS在MM细胞增殖和存活中的关键作用,作者假设USP2敲除可能会使KRAS不稳定,从而导致MM细胞增殖抑制。结果显示USP2敲除显著抑制MM.1S和RPMI 8226细胞系的增殖,诱导这两种MM细胞系凋亡。此外,MM.1S 细胞的异种移植 MM 模型发现,USP2敲除显著抑制肿瘤生长,免疫组化染色也显示USP2敲除组的KRAS水平降低,这些数据共同表明USP2在MM细胞的增殖和存活中起着关键作用 [/size][size=15px][b]6、GA通过靶向USP2和破坏KRAS的稳定性来诱导MM细胞凋亡[/b][/size][size=15px]据报道,GA通过抑制PI3K/Akt/mTOR、[i]NF-κ[/i]B 和其他信号通路诱导MM细胞凋亡。作者发现GA处理可以以剂量依赖性方式降低MM.1S和RPMI 8226细胞的活力并促进细胞凋亡。此外,过表达USP2的细胞对GA诱导的活力降低和KRAS降解表现出部分抗性,且GA处理可以提高 KRAS的泛素化水平。KRAS[sup]G12C[/sup]的过表达可以部分消除USP2敲除诱导的细胞生长抑制。这些数据表明,GA在 MM 细胞中诱导的细胞毒性至少部分归因于其靶向USP2,这降低了KRAS的稳定性。[/size][size=15px]最后,作者探讨了USP2在MM中的临床意义。通过GSE13591数据集发现MM患者骨髓样本中的USP2 mRNA水平明显更高。此外,作者发现原发性骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞系中USP2的蛋白水平高于正常外周血单核细胞(PBMC)和正常骨髓活检,且高USP2水平的MM患者的总生存期降低,这些结果共同表明USP2表达增加与MM中较差的结局之间存在很强的相关性,表明USP2可能是MM治疗的有前途的靶点。[/size][/font][font=&][/font][/size]
名 称:骨髓细胞的提取目的:分离并培养骨髓间充质干细胞原理:先分离出单核细胞然后再通过培养分离出骨髓间充质干细胞内容:步骤一:小鼠骨髓细胞的获取1. 断颈处死小鼠(7-12周,雌雄均可),投入盛有250ml左右的0.1%新洁尔灭或75%酒精中浸泡3-5分钟,拎出后将小鼠仰面翻铺于超净台上一个消毒托盘上。2. 用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤,用眼科剪小心剪开皮肤,并分离两下肢的皮肤,往下在脚踝处剪断,往上在髋关节处剪断,这样可以游离出小鼠的两条下肢。将它们放入另外一个消毒托盘中,并换一套新的剪子和镊子。手术器械事先均必须消毒。3. 小心剥离肌肉,分别剪下Femurs and Tibias, 剪去两端软骨,露出红色的骨髓腔。注意尽可能少的剪走骨髓腔。4. 拿两支5ml无菌注射器,每支吸取5ml IMDM(10%FBS, 50/50u/ml Pen/Strep),换装一个4号针头(又称皮针)或1ml注射器的针头,并用无菌的针头套管将之轻轻拧弯。轻轻插入骨髓腔,对准一个无菌15ml离心管,将细胞冲出。每根骨用2.5ml IMDM培养液左右即可基本冲下骨髓腔内的细胞。5. 300C下离心,1200转/10分钟,去上清,但留1ml,以便用于在振荡器上悬浮细胞。6. 加进氯化铵溶液(NH4Cl: 8.99g/L, KHCO3: 1g/L, Na4-EDTA: 0.037g/L ,过滤灭菌, 40C储存)裂解红细胞,按1: 9比例,即1ml 细胞悬液,加进9ml氯化铵溶液,混匀,冰上10分钟。 7. 300C离心,1200转/10分钟,去上清。步骤二:淋巴细胞分离液分离小鼠骨髓细胞1. 按步骤二方法采集小鼠骨髓细胞,并破红细胞2. 细胞用4ml培养液悬浮,缓慢留置于8ml淋巴细胞分离液液面上,2000rpm for 20min.3. 小心吸取云雾状底层的基质细胞约1.5ml的体积,置于1个盛有1ml无菌细胞培养用PBS的15ml离心管中,颠倒混匀,1200rpm for 10min, 去上清4. 如果是注射用细胞,则用5ml PBS洗涤细胞2次;5. 离心沉淀下来的细胞用50-200ul PBS,计数细胞,并计算所需细胞体积数铺板培养