实时荧光定量基因扩增仪

[url]http://www.instrument.com.cn/news/20170525/220477.shtml[/url]　　为了解近年来PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]的技术发展趋势、市场发展行情、PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]各品牌在市场中的占有率以及重点应用领域等内容，同时，为各PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]厂商在以后的仪器销售和市场推广活动中做指导，仪器信息网特组织了“中国PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]市场调研”活动。此次调研，面对的调研对象包括仪器信息网相关注册用户、PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]制造、应用领域专家以及部分PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]生产厂商等。　　《中国PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]市场研究报告(2017版)》内容包含了PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]产业概述、新品盘点、主要制造商地区分布及零部件供应商、销量与售价分析（地区）、销量与份额分析（品牌）、营销渠道分析、市场发展趋势、产业研究总结。　　《中国PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]市场研究报告(2017版)》的完成得到了广大用户、企业以及业内专家的大力支持。在前期调研过程中，咨询了业内相关专家30余位，超过1500家实验室用户参与了此次PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]的调研，在此，谨对他们表示最衷心的感谢！　　报告链接：[color=#00b0f0][b][url=http://www.instrument.com.cn/survey/Report_Census.aspx?id=134]中国PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]市场研究报告(2017版)[/url][/b][/color][color=#00b0f0]　　[color=#000000][b][color=#000000]欢迎感兴趣的网友和我们联系购买报告事宜，[/color][color=#000000]联系电话：010-51654077-8049[/color][/b][/color][/color][b]节选[/b]第一章 PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]产业概述1.1 PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]定义及分类　　PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是一种在体外特异性扩增靶DNA序列的的技术，通过多个循环的变性、退火和延伸，能够使微量的遗传物质在几小时内得到几百万倍的扩增。其基本过程为变性、退火和延伸，这三步需要不同的温度条件。PCR仪是指为PCR反应提供所需要的温度循环条件的仪器。根据工作原理和功能可以分为六种：普通PCR仪、梯度PCR仪、实时荧光定量PCR仪、原位PCR仪、数字PCR仪、恒温PCR仪、高速PCR等。一般原理有相似的地方，但在结构和配件方面还存在一些差异。来源：《生物化学与生物物理进展》，中国科学院和中国生物物理学会，2017年5月1.2 不同类型PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]销量份额[img]http://img1.17img.cn/17img/images/201705/insimg/7392dd08-91c1-4c09-875a-640ff8fd94a7.jpg[/img]图1.3 2016年不同类型PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]销量份额（台）来源：抽样统计，2017年5月　　我们通过对相关企业的长期跟踪调研，同时统计分析了超过*家PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]用户。2016年国内PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]销量在*~*台。2016年普通PCR和梯度PCR市场销量总和大约是荧光定量PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]的*倍。2014年数字PCR中国市场销量不足*台，2016年数字PCR中国市场销量不足*台。1.3 PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]使用单位分布表1.1 PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]使用单位一览表[table][tr][td=1,1,74][b]单位类别[/b][/td][td=1,1,386][b]具体单位[/b][/td][/tr][tr][td=1,1,74]工业企业[/td][td=1,1,386]生物制药、食品加工、基因测序等企业[/td][/tr][tr][td=1,1,74]政府机构[/td][td=1,1,386][color=#333333]食药监、质监局、疾病控制中心、血液中心、公安局、出入境检验检疫局等[/color][/td][/tr][tr][td=1,1,74]医疗系统[/td][td=1,1,386]医院、康复中心、特殊病防治院/所等[/td][/tr][tr][td=1,1,74]教学/科研[/td][td=1,1,386]大学高校、研究院/所、中学等[/td][/tr][/table]来源：仪器信息网产业研究部，2017年5月　　2016年国内PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]采购用户中，其中教学/科研用户数量超过*，高校和研究院/所主要选用进口品牌*的相对较新型的高精度仪器，也会有部分初、高中采购PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]用于教学实验，主要品牌为国产的*。政府机构为*大类的用户，表现比较抢眼的是各地的*等。本次调研数据显示，医疗系统占2016年PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]市场销量份额的*，其中用户基本上都是*，涉及*批量采购的倾向更为明显。企业用户主要以*为主。第二章 PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]新品盘点　　为了跟踪PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]技术发展方向和各个厂商的最新产品动态，本章对2016年在中国上市的PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]进行了一个系统梳理。据不完全统计，2016年，中国市场上一共上市了5款PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]，其中1款普通PCR，1款梯度PCR，3款荧光定量PCR。3款进口新品，2款国产新品。第五章 PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]销量与份额分析（品牌）5.1 主要品牌PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]销量及市场份额[img=,489,367]http://img1.17img.cn/17img/images/201705/insimg/cac447df-a97c-4407-9f3b-27f57c47c89b.jpg[/img]图5.1 2016年主流企业销量市场份额来源：抽样统计，2017年5月　　2016年中国PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]市场规模*台，销售总额为8亿人民币左右。总的来说，国内PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]市场现在的格局是基本被国外厂商垄断，国外厂商的市场占有率在*%以上。但因为[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]技术门槛较低，参与低端市场竞争的企业非常多，2016年中国市场上有产品销售的厂商多达40多家。国外厂商包括赛默飞、伯乐、罗氏、耶拿、艾本德、安捷伦、丹纳赫、圣欧（SensoQuest）、凯杰（QIAGEN）、威泰克(Wealtec)等，国内厂商包括博日、东胜、天隆、朗基、力康、达安基因、六一、安杰思等。第七章 PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]市场发展趋势7.1 2017-2022年PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]市场预测[img]http://img1.17img.cn/17img/images/201705/insimg/0da11d31-d94d-4538-9114-33bc02c11ca7.jpg[/img]图7.1 2017-2022年中国PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]销量（台）及增长趋势来源：仪器信息网产业研究部，2017年5月[b]正文目录[/b]第一章 PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]产业概述... 11.1 PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]定义及分类... 11.2 不同类型PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]销量份额... 41.3 PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]使用单位分布... 41.4 普通PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]产业链结构... 61.5 PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]产业概述... 7第二章 PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]新品盘点... 82.1 普通PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]... 82.1.1 赛默飞自动化PCR仪（ATC）... 82.2 梯度PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]... 92.2.1 耶拿Biometra TOne梯度[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]... 92.3 荧光定量PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]... 102.3.1 耶拿qTOWER3G touch荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]... 102.3.2 天隆Gentier 96E 实时荧光定量PCR检测系统... 112.3.3 枫岭FTC-8000 实时荧光定量PCR仪... 12第三章 PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]和主要制造商地区分布及零部件供应商... 133.1 主要PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]生产企业生产基地分布... 133.2 PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]部分主要零部件供应商... 15第四章 PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]销量（地区）与售价分析... 164.1 2016分地区销量分析（台）... 164.2 2016售价分析... 18第五章 PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]销量与份额分析（品牌）... 205.1 主要品牌PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]销量及市场份额... 20第六章 PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]营销渠道分析... 236.1 PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]营销渠道现状分析... 236.2 PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]营销渠道特点及其发展趋势... 24第七章 PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]市场发展趋势... 257.1 2017-2022年PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]市场预测... 257.2 2017-2022年PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]销量（台）份额预测... 26第八章 PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]产业研究总结... 28

请问什么是基因扩增仪（PCR）？可能是个很幼稚的问题。

我们公司计划买进一台PCR[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url],不知道哪种型号目前最好,有知道的朋友请告知一声.谢了!

美国ABI9700PCR基因扩增仪相对其他公司（包括国内外品牌）的普通PCR仪有哪些优势？谢谢各位老师！！！

仪器简介PCR是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内In Vitro的大量合成，它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制。目前常用的技术，可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。根据DNA扩增的目的和检测的标准，可以将PCR仪分为普通PCR仪，梯度PCR仪，原位PCR仪，实时荧光定量PCR仪四类。PCR技术原理该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆列举部分仪器的个别参数，仅供参考：技术参数：样品台容量:96X0.2ml PCR管、 96孔PCR板、8排/12排PCR管工作原理：TE半导体系加热致冷技术屏幕：彩色触摸屏（5.7英寸）温度控制范围：4℃-105℃ 升降温速度：≥4.0℃/秒 温度均匀性：≤0.3℃ 温控精度：≤0.1℃ (@55℃) / ≤0.2℃(@90℃以上)温度显示精度：0.1℃程序温控方式：Block模式和Tube模式变温速度可调范围：0.1-4.0℃程序可储存数：最大可存250个程序，可通过U盘扩展存贮最大循环数：99循环，可套嵌两级，可做巢式PCR实验时间递增/递减：0-9分59秒，可做Long PCR实验温度递增/递减：0.1-9.9℃，可做Touch down实验断电保护/暂停功能：有Soak功能：有运行状态显示功能：[color=

什么是PCR技术？ PCR（Polymerase Chain Reaction）技术，中文译为聚合酶链式反应，是一种在体外（试管、切片…）扩增核酸的技术。PCR的基本反应包括以DNA为模板的反应和以mRNA为模板的反应。 PCR技术是模拟体内天然DNA（脱氧核糖核酸）的复制过程。以扩增DNA为例，其基本原理是在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。

供应ABI PCR基因扩增仪 电话：18920118658 （李俊玲）QQ：1242391475

1971年Kleppe等人在Journal of molecular biology上发表文章首次准确、精炼、客观的阐述了PCR方法，1976年一种从嗜热水生菌(Thermus aquaticus)分离得到的热稳定的DNA依赖的DNA聚合酶的应用大大增加了PCR的效率。而现今所发展出来的PCR则是源于由Saiki和Mullis等人于1988年发表在Science上的一篇论文，Mullis当时服务于Perkin Elmer（PE）公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。后来PE被Applied Biosystems Inc.（ABI）公司收购、分拆、再转卖，而PCR的专利和倍受信赖的PCR仪器生产和销售就留在ABI名下。到如今，PCR方法愈发趋向自动化，并从中衍生出更多的新技术方法，可以说，PCR技术是支撑现代分子生物学发展的一块重要基石。这种技术的广泛应用催生了一个庞大的市场，多个公司均有各种类型的商品化PCR仪出售。PCR的专利目前依然掌握在ABI和Roche（罗氏）两大公司手中，去年业界颇为引人瞩目ABI诉MJ公司侵犯侵犯PCR仪知识产权案最终以MJ败诉并宣布破产、最终被Bio-rad收购暂告一段落。其后还会不会有后继的故事还需拭目以待。 PCR原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶的作用下，以单链为模版，根据碱基互补配对原则复制成新的单链，与模版配对成为双链分子挎贝。在体外实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计与模板DNA的5’端结合的两条引物，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制，多次重复“变性解链—退火—合成延伸”的循环就可以以几何级数大量扩增特定的基因。 发现耐热DNA聚合酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该类酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。 从PCR原理可以看出，PCR仪的关键是升降温的步骤。现在偶尔还能听到一些前辈们笑谈早年的PCR实验如何在3个水浴锅中完成的趣闻。经过不断改进，今天的PCR已经越来越完善和智能化。出于市场推广的战略需要，各厂家的PCR仪型号不同，着力宣传的技术指标和参数也不尽统一，编者在这里简单列出选购时我们认为应该考虑的常用指标，希望有助于大家选购PCR仪的选购技巧。PCR仪介绍及其选购 PCR仪的种类总体来说可以分为两大类：PCR扩增仪和实时荧光定量PCR仪，普通的PCR扩增仪又衍生出带梯度PCR功能的梯度PCR仪、和带原位扩增功能的原位PCR仪等等。1996年由ABI公司首先推出将扩增和检测融为一体的实时荧光定量PCR仪，此后很多公司如Eppendorf、ROCHE、Corbett、MJ等等都先后推出不同款式的定量PCR仪。

问题描述：荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]扩增效率低的原因？解答：[align=left][font=宋体][color=black]可能的原因有：[/color][/font][/align][align=left][font=宋体][color=#262626][back=white]（[/back][/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=#262626][back=white]1[/back][/color][/font][font=宋体][color=#262626][back=white]）反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。[/back][/color][/font][/align][align=left][font=宋体][color=#262626][back=white]（[/back][/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=#262626][back=white]2[/back][/color][/font][font=宋体][color=#262626][back=white]）反应条件不够优化，可适当降低退火温度或改为三步扩增法。[/back][/color][/font][/align][align=left][font=宋体][color=#262626][back=white]（[/back][/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=#262626][back=white]3[/back][/color][/font][font=宋体][color=#262626][back=white]）反应体系中有[/back][/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=#262626][back=white][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp]PCR[/url][/back][/color][/font][font=宋体][color=#262626][back=white]反应抑制物，一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，以减少抑制物的影响。[/back][/color][/font][/align]以上内容来自仪器信息网《PCR实战宝典》

METHODS 25, 402–408 (2001)Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2－△△CT MethodKenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen¶,1*Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and ¶ Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy,Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534原文下载摘要：现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。2－△△CT方法是实时定量PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。另外，在本文中我们还介绍了两种2－△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量 实时PCR Taqman反转录 PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（1 - 3 ）。实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（4 ,5 ）。实时定量 PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。通过实时 PCR 进行绝对定量已有多篇报道（6 - 9 ），包括已发表的两篇研究论文（10,11 ）。在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。显然，我们说 X 基因在经过某种处理後表达量增加 2.5 倍比说该基因的表达从1000 拷贝/ 细胞增加到2500 拷贝/ 细胞更加直观。用实时PCR 对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的验证。2－△△CT方法可用于定量PCR 实验来计算基因表达的相对变化：2－△△CT公式的推导，以及实验设计，有效性评估在Applied Biosystems User Bulletin No.2（P/N4303859）中有介绍。用2－△△CT方法分析基因表达数据在文献中也有报道（5,6）。本文介绍了该方法的推导、假设以及应用。另外，本文还介绍了2－△△CT两种衍生方法的推导和应用，它们在实时定量PCR 数据分析中都可能被用到。1. 2－△△CT方法1.1. 2－△△CT方法的推导PCR 指数扩增的公式是：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054042.jpg这里，Xn 是第 n 个循环後目标分子数，X0 是初始目标分子数，Ex 是目标分子扩增效率，n 是循环数，C T 代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数。因此：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054008.jpgX T 是目标分子达到设定的阈值时的分子数。C T,X 是目标分子扩增达到阈值时的循环数。Kx 是一个常数。对于内参反应而言，也有同样的公式：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054009.jpg用XT 除以RT 得到：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054010.jpg对于使用 Taqman 探针的实时扩增而言， XT 和 RT 的值由一系列因素决定：包括探针所带的荧光报导基团、探针序列对探针荧光特性的影响、探针的水解效率和纯度以及荧光阈值的设定。因此常数K 并不一定等于1 。假设目标序列与内参序列扩增效率相同：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054011.jpg http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054018.jpg或：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054019.jpgXN 代表经过均一化处理过的初始目标分子量；△CT表示目标基因和内标基因CT值的差异（CT,X－CT,R ）整理上式得：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054020.jpg最后用任一样本q 的XN 除以参照因子（calibrator, cb）的XN得到：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054021.jpg在这里http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054023.jpg对于一个少于150bp 的扩增片断而言，如果 Mg2+ 浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于1 。因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是http://tong.dxy.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054022.jpg

在基因扩增仪的几种类型中，荧光定量PCR 因操作方便、运行速度快、实验结果准确，受到越来越多的分子生物学研究者青睐。 　　实验者要购买一款合适的荧光定量PCR，需要考虑各方面的因素，首先要分析实验室目前乃至将来的需求、平衡实验室的预算，更要详细研究各种各样的宣传资料。 　　面对各种不同性能的产品，我们该如何选择呢? 　　首先建议大家走出认识荧光定量PCR的两个误区： 　　误区一：荧光定量PCR仪无需梯度功能 　　对于使用染料法的定量PCR反应，虽然有各种各样的PCR引物设计软件或者经验公式计算熔解温度(Tm值)，但运用的公式不同、引物序列不同，Tm值的差异会很大。 　　引物的熔解温度决定了退火温度。而且模版中碱基的组合千变万化，对于特殊片断，经验公式得到的数据不一定能得出准确的结果，退火温度细微的差异对结果都可能产生决定性的影响，因而“摸条件”一度是让人很头疼的问题。 　　梯度PCR的出现部分解决了一些问题——在反应过程中每个孔的温度控制条件可以在指定范围内按照梯度变化，根据结果，一步就可以摸索出最适合的反应条件。 　　不单是退火温度，连变性温度和延伸温度都可以优化——对于多种聚合酶混合酶扩增如Invitrogen、Clontech、Promega的多数高保真Taq酶来说这个非常重要，因为Taq和校正酶的最佳反应温度可能有显著差异，优化延伸温度就显得很重要。 　　使用有梯度功能的荧光定量PCR可以一次完成以往多次实验才能完成的优化过程，简化了摸索 PCR反应条件的繁琐实验，既节省实验时间提高效率，又节省实验成本。 　　误区二：仪器通道越多越好 　　随着PCR技术的成熟运用，多重扩增越来越热闹，荧光定量PCR仪也不能幸免。 　　从最初ABI公司推出的单通道荧光定量PCR仪发展到如今各个厂家都推出4通道、5通道甚至6通道荧光定量PCR仪，眼花缭乱的选择让人无所适从，就有人一不小心走进了“通道越多越好”的误区。 　　在使用有些厂家5通道的荧光定量仪时，为了确保实验结果的精确性和准确性都要在实验中使用ROX(一种荧光染料)或专用的Reference dye ，这些荧光染料都必须单独使用一个检测通道。 　　所以，真正能检测多重PCR荧光信号的有效通道只有4个，而且使用校正染料可能会增加后期的使用成本。 　　有的荧光定量PCR的检测通道是只为自已厂家的专用的荧光染料或试剂开放的，有效检测通道也绝非像宣传资料中宣称的那么多。 　　在购买前确认荧光定量PCR仪器的有效检测通道尤为重要，不能单单只听宣传。 　　考虑多重荧光定量PCR的通道数的时候也应该从实验室实际情况出发，多重PCR并非人人适用、人人可用，因为它使实验复杂化了。 　　当我们看清误区，在选择一款最适合自己需求的荧光定量PCR仪时，我们又该关注些什么呢?

根据DNA扩增的目的和检测的标准可以将PCR仪分为普通PCR仪，梯度PCR仪，原位PCR，实时荧光定量PCR仪等几类。 普通PCR仪一般把一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪，称之为普通PCR仪。如果要用它做不同的退火温度则需要多次运行。主要是用作简单的，对目的基因退火温度的扩增。主要应用于科研、教学、临床医学、检验、检疫等。梯度PCR仪一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件（通常12种温度梯度）的称之为梯度PCR仪。因为被扩增的不同的DN***段其最适合的退火温度不同，通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR扩增就可以筛选出表达量高的最适合退火温度进行有效的扩增。主要用于研究未知DNA退火温度的扩增，这样既节约时间，也节约经费。在不设置梯度的情况下亦可当做普通的PCR用。正真的梯度，是每一排管都有精确的加热控温探头，2009年为止只有美国ABI公司可以做到。其他的都是从两头的热传递来设计控温。梯度PCR仪多应用于科研、教学机构。原位PCR仪（有些品牌的PCR仪具有普通PCR、梯度PCR、原位PCR的功能，通过替换模块进行多用途开展实验工作）是用于从细胞内靶DNA的定位分析的细胞内基因扩增仪。如病原基因在细胞的位置或目的基因在细胞内的作用位置等。可保持细胞或组织的完整性，使PCR反应体系渗透到组织和细胞中，在细胞的靶DNA所在的位置进行基因扩增。不但可以检测到靶DNA，还能标出靶序列在细胞内的位置。于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转变有着重大的实用价值。实时荧光定量PCR仪在普通PCR仪设计基础上增加荧光信号激发和采集系统和计算机分析处理系统，形成了具有荧光定量PCR功能的仪器。其PCR扩增原理和普通PCR扩增原理相同，在PCR扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统，得出量化的实时结果输出。荧光定量PCR仪有单通道，双通道和多通道之分。当只用一种荧光探针标记的时候，选用单通道；有多种荧光标记的时候使用多通道。单通道也可以检测多荧光的标记和目的基因表达产物，因为一次只能检测一种目的基因的扩增量，需多次扩增才能检测完不同的目的基因片段的量。多通道利于做多重PCR，实现一次检测多种目的基因的功能。实时荧光定量PCR仪主要应用于临床医学检测、生物医药研发、食品行业、科研院校等。

荧光定量PCR简介荧光定量PCR检测技术诞生至今已10多年的时间，而其应用一直都没广泛展开，究其原因，无外乎受制于相关仪器、试剂和技术的发展。近期，尤其是08年以来，仪器和试剂是遍地开花，这也使科研人员均跃跃欲试，都想借此技术使自己的研究能突飞猛进，发展势头通过查找每年所发表的文章数可一目了然。据有关统计，在 Medline 数据库中，用“Taqman” 或 ”real time PCR” 作为关键词检索，1996 年是19 篇，1999 年157 篇，到2003 年就高达2984 篇，2009年会是多少呢？我们不得而知。但其迅猛的发展势头却是不可更改的，本公司真诚希望能和众多研究人员共同努力，抓住这一大好时机，为科研事业的发展贡献自身的力量。基于这一目标，本公司长期以来对荧光定量PCR，无论是技术还是多年来的产品，均进行了深入地研究，并及时推出更加优异的荧光定量 PCR技术服务。荧光定量PCR原理荧光定量PCR最早称TaqMan PCR，后来也叫Real-Time PCR，是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能的。其原理：随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，根据最终的 PCR 产物量也不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT值（如下图所示）。荧光域值（threshold）是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光域值的缺省设置是PCR反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍，即：threshold。http://www.biomart.cn/upload/asset/2011/01/25/1295364674.jpgCt 值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。Ct值与起始模板的关系：研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值如下图所示。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。http://www.biomart.cn/upload/asset/2011/01/25/1295364675.jpg荧光定量检测荧光定量检测根据所使用的标记物不同可分为荧光探针和荧光染料。荧光探针又包括Beacon技术（分子信标技术，以美国人Tagyi为代表）、 TaqMan探针（以美国ABI公司为代表）和FRET技术（以罗氏公司为代表）等；荧光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料，非饱和荧光染料的典型代表就是现在最常用的SYBR GreenⅠ；饱和荧光染料有EvaGreen、LC Green等。嵌合荧光染料法（SYBR GreenⅠ）SYBR Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，与双链DNA非特异性结合。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，其荧光增加1000倍。所以，一个反应发出的全部荧光信号与出线的双链DNA量呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。http://www.biomart.cn/upload/asset/2011/01/25/1295364672.gifSYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合双链DNA结合染料的优点：实验设计简单，仅需要2个引物，不需要设计探针，无需设计多个探针即可以快速检验多个基因，且能够进行熔点曲线分析，检验扩增反应的特异性，低的初始成本，通用性好，因此国内外在科研中使用比较普遍。荧光探针法（Taqman 技术）：PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR 仪检测不到荧光信号； PCR扩增时（在延伸阶段），Taq 酶的 5' － 3' 切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步，这也是定量的基础所在。其过程如下图所示http://www.biomart.cn/upload/asset/2011/01/25/1295364673.gif荧光定量PCR的应用分子生物学研究1、核酸定量分析。 对传染性疾病进行定量定性分析，病原微生物或病毒含量的检测 , 比如近期流行的甲型H1N1流感， 转基因动植物基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等。2 、基因表达差异分析。 比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证3 、SNP 检测。检测单核苷酸多态性对于研究个体对不同疾病的易感性或者个体对特定药物的不同反应有着重要的意义，因分子信标结构的巧妙性，一旦SNP 的序列信息是已知的，采用这种技术进行高通量的 SNP 检测将会变得简单而准确。4、 甲基化检测。甲基化同人类的许多疾病有关，特别是癌症， Laird 报道了一种称作 Methylight的技术，在扩增之前先处理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影响，用特异性的引物和 Taqman探针来区分甲基化和非甲基化的 DNA ，这种方法不仅方便而且灵敏度更高。医学研究1、 产前诊断：人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗，到目前为止，还只能只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止各类遗传性疾病的发生，如为减少X连锁遗传病患儿的出生，从孕妇的外周血中分离胎儿DNA，用实时荧光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法，易为孕妇所接受。2、 病原体检测：采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。3、 药物疗效考核：对乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析显示：病毒量与某些药物的疗效关系。HCV高水平表达，干扰素治疗作用不敏感，而HCV低滴度，干扰素作用敏感；在拉米夫定治疗过程中，HBV- DNA的血清含量曾有下降，随后若再度上升或超出以前水平，则提示病毒发生变异。4、 肿瘤基因检测：尽管肿瘤发病的机理尚未清楚，但相关基因发生突变是致癌性转变的根本原因已被广泛接受。癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期就可以出现。实时荧光定量 PCR不但能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病WT1基因、肿瘤 ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction ， PCR）自诞生之日起就决定了它不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法，而且也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具。随着分子生物学技术研究的不断进展，定量PCR技术取得了突飞猛进的发展，不仅建立了一系列的方法，而且也诞生了许多与这些方法相匹配的新型热循环仪和实验材料。实时定量PCR(real-time quantitative PCR)技术便是一种具有革命性意义的定量PCR技术，所谓实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量。目前它作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域，仅2000-2001年，收录在Medline上的以real-time PCR为关键词的文章就达一千多篇。实时PCR技术较之与以前的以终点法进行定量的PCR技术具有无与伦比的优势。首先，它不仅操作简便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特异性。其次，由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定，大大降低了污染的可能性并且无须在扩增后进行操作。另外，它还可以通过不同的引物设计在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增，即多重扩增。本文将对实时定量PCR目前的应用状况、仪器应用、新材料进展以及实验条件的优化作一综述。实时定量PCR的应用现状实时定量PCR技术自1996年诞生以来，由于它显著的优越性，不仅广泛的应用于分子生物学的各个研究领域，而且也开始作为一种诊断手段应用于临床。其应用涉及到的范围包括DNA、mRNA和病毒荷载量的定量，核酸多态性分析，基因突变分析等多个领域。Giulietti 等人对用实时定量PCR测定细胞因子基因的表达作了详细的描述。细胞因子是一种调节蛋白，它对免疫反应、炎症反应具有重要的调节作用，其量的改变常常与一些疾病，如炎症反应、自身免疫性疾病、移植排斥有密切的关系。由于所得到组织样本常常因为太小而不能满足在蛋白质水平的检测，另外，通常用的蛋白质检测方法（如ELISA）的灵敏度也难以完成对极微量的蛋白产物的检测，所以应用PCR定量进行基因诊断就显得十分有意义。众所周知，cDNA微排列和差异表达PCR技术是对基因表达变化分析的两种关键技术，但是这两种技术只能对基因表达变化进行定性分析，而不能进行定量分析。Rajeevan等人利用实时定量PCR技术却成功地将基因表达的变化进行了量化，不仅有效地证明了上述两种方法的有效性，而且提供了一种具有高通量的对基因表达变化进行检测的新技术。实时定量PCR技术的出现不仅增强了有关对基因量变化的研究方法，而且也增强了对基因质所发生变化方面的研究。例如Laird和他的同事们建立了一种被称作Methylight的实时定量PCR方法，它能通过特异的引物和/或Taqman探针检测基因CpG岛的胞嘧啶是否发生了甲基化。由于实时PCR的敏感性和特异性，使得这种方法对胞嘧啶的过度甲基化常常具有极高的灵敏度。最近有研究表明这种方法可以从食管癌病人的食管粘膜中检出含有发生了过度甲基化基因的细胞。又如Sevall等人证明可以用实时定量PCR方法区分含有突变的等位基因。这是利用两种不同的荧光报告基团标记Taqman探针，该探针既可同野生型基因又可同突变型基因发生杂交，由于探针的杂交效率及随后的切割是由杂交决定的，所以如果出现一种信号强于另一种信号则表明两条基因具有同源性，若两种信号都增强则表明为异源性。目前实时定量PCR在临床诊断方面的应用主要体现在对感染组织或细胞负载病毒的定量测定上，这一技术对DNA和RNA病毒都可以检测，目前已有标准的操作手册供人们使用，但是必须明确，国际上既没有统一的病毒荷载的标准，也存在着对其标准曲线和定量准确性的各种争论。这里值得一提的是一种称为NASBA（nucleic acid sequence-based amplification）的技术，它是一种利用电化学以光的等温PCR反应，在反应过程中能产生一种与靶RNA反极性的RNA扩增子，分子beacon常用于这种技术 ，这种方法常常用于对逆转录病毒的定量测定。常用的热循环仪对PCR产物进行实时定量的测定之所以能成为现实，并且应用如此广泛，其中一个重要的原因就是新的热循环仪的研制与推广。目前，国内外常用的热循环仪主要有以下几种：一、PE公司生产的Applied Biosystem系列1、 ABI Prism 7700 Sequence Detection System (SDS)是第一种作为商业用途的实时PCR测定仪，它由激光激发荧光，并且可在500-660nm范围内调节波长，可以用于基于水解探针、双链DNA结合染料、分子beacon原理的分析。一次可以测定96个样本，并且速度较快，一批样本的完成只耍要2小时。但是它不能实时对扩增结果进行分析，而只能在全部扩增结束后才进行数据分析。2、Gene Amp 5700 SDS: 它的基本工作原理和操作与ABI Prism 7700 SDS相同，但是它是利用卤素灯为激发光源，而且只设计了一个检测波长。3、ABI Prism 7900 SDS: 这是一种为实现高通量检测而设计的仪器，其基本构成与ABI Prism 7700 SDS相同，但程序设计完全实现自动化要求，而且有两种样品盘可供选择（96孔和384孔）。如果加上一个装载辅件，可以在24h之内完成84个384孔板的样本测定。二、Roche 公司生产的Lightcycler热循环仪，它以能装载20-25ul的毛细硅管作为反应管进行扩增，光源选用冷光源系统，可以减少光源对样本的影响。由二极管发射蓝光激发荧光，并提供三个滤光片，可利用荧光分光测定的原理，同时对一个反应体系的多种荧光进行检测，所以它完全可以进行多重PCR.由于Lightcycler使用了其独特毛细管反应体系和空气快速热循环系统，使样本能在非常短的时间内有效地实现温度变化，从而能在20-30min内快速完成30-40循环，达到样本扩增的目的。Lightcycler通常使用的实验材料主要是SYBRI Green I荧光染料和Taqman荧光探针和杂交探针。虽然Lightcycler有相当多的优点，但是这也有一些不足之处，由于它只提供一个32孔的样品盘，这使得不能在一次进行较多的样本测定。三、Bio-rad 公司生产的iCycler iQ：这种仪器提供连续的检测波长调节，程序满足实时数据处理，可以同时在一个反应体系中检测四种荧光信号，由于一批能完成96个样本的测定，所以能提供相对较快的扩增反应。四、Strategene公司的MX4000 Multiplex: 这种仪器的检测波长可在350-750nm范围内进行调节，以卤素灯作为激发光源，常选用的实验材料包括Taqman探针、杂交探针和分子信标（molecular beacon），其样品盘的规格有多处可供选择，包括96孔盘、8联管或单管，其程序也提供实时数据分析。五、Cepheid公司的Smart Cycler System: 这种仪器正如其名一样具有强大的功能，它有16种反应模式可供选择，而且每种模式都有各自的程序，任一模式不仅能同时检测四种荧光信号，而且不同的使用者可对同一批样品同时运行不同的模式进行检测。Smart Cycler System的这种设计虽然有其优点，但是其缺点也是显而易见的，由于其将样品盘分得过细，所以不利于同时进行较多样品的分析。六、Corbert Research 公司的Rotor-Gene: 这种仪器与Lightcycler相比，属于中心型热循环仪，即从反应体系内部进行热变化；其具有双光源系统，蓝光在470nm处激发荧光，绿光在530nm波长激发荧光；具有两种样品盘（32孔和72孔）供选择；可以对多种荧光材料进行测定

今天遇到个难解的困惑： 做某个基因荧光定量标曲的时候，感觉什么指标都很好了，如稀释度间的间距、重复性、溶解曲线、标准偏差值等等都基本满意了，但是扩增效率却怎么也上不去，重复了一次还是如此情况，跟前面其它几个基因的相比，大多数指标数据的并没有大的差异，但就是不知怎么今天做的这个基因扩增效率显示这么低。。。诚向各路高手请教，不知你们是否曾经遇到过类似的情况呢？可能的原因是什么呢？求帮忙分析下下。。谢谢各位了！

方法 酶免法 　 设备名称 经济型 A [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增仪[/color][/url][/color][/url]FX990（DA620）1台（可选） PCR扩增仪（2700） ABI PCR扩增仪（9700） ABI PCR扩增仪（TC-25/H） 杭州 PCR扩增仪（TC-48/Ht） 杭州 PCR扩增仪（TC-96/T/Ha） 杭州B 荧光分析仪（F990，DA620S）C 离心机1台（国产TGL——16B）D [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]3支E 水浴锅1台F 辅助易耗品与耗材 实用型 A 全自动荧光定量扩增仪B 离心机1台（国产TGL——16B）C [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]3支D 水浴锅1台E 辅助易耗品与耗材 （可选） 豪华型 A 全自动荧光定量扩增仪（可选） 全自动荧光定量扩增仪（iCycler) BioRad 全自动荧光定量扩增仪(7000) ABI 全自动荧光定量扩增仪(Linghtcycler) Roche 全自动荧光定量扩增仪(FTC2000) 上海 PCR荧光产物分析仪 上海 全自动核酸纯化系统（6100） ABI PCR扩增仪（Gene Cycler) BioRadB 离心机1台（国产TGL——16B）C [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]3支D 金属浴1台E 辅助易耗品与耗材

PCR相关经验分享PCR常见问题-分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)问题1：无扩增产物 现象：正对照有条带，而样品则无 原因: 1.模板:含有抑制物，含量低 2.Buffer对样品不合适 3.引物设计不当或者发生降解 4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 对策: 1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 2.更换Buffer或调整浓度 3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 4.降低退火温度、延长延伸时间 问题2：非特异性扩增 现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带 原因： 1.引物特异性差 2.模板或引物浓度过高 3.酶量过多 4.Mg2+浓度偏高 5.退火温度偏低 6.循环次数过多 对策： 1.重新设计引物或者使用巢式PCR 2.适当降低模板或引物浓度 3.适当减少酶量 4.降低镁离子浓度 5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法 6.减少循环次数 问题3：拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。 原因： 1.模板不纯 2.Buffer不合适 3.退火温度偏低 4.酶量过多 5.dNTP、Mg 2+浓度偏高 6.循环次数过多 对策： 1.纯化模板 2.更换Buffer 3.适当提高退火温度 4.适量用酶 5.适当降低dNTP和镁离子的浓度 6.减少循环次数 问题4：假阳性 现象：空白对照出现目的扩增产物 原因： 靶序列或扩增产物 的交*污染 对策： 1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管 及加样枪头等均应一次性使用。 3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存 PCR引物设计的黄金法则 （转自tiangen）1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。4.引物3′端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。6. 碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。8. 引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。 △G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析）9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。 引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。3′ 端也不能有形成任何二级结构可能。10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。 某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于

问题描述：荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]，扩增曲线有一向上或向下的尖峰的现象，可能是什么原因？解答：[align=left][font=宋体][color=black]（[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]1[/color][/font][font=宋体][color=black]）反应过程中电压不稳定。[/color][/font][/align][align=left][font=宋体][color=black]（[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]2[/color][/font][font=宋体][color=black]）可能在[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black] 20 [/color][/font][font=宋体][color=black]个循环左右时，仪器暂停了或被开盖，使光线突然增强。[/color][/font][/align][align=left][font=宋体][color=black]（[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]3[/color][/font][font=宋体][color=black]）如果尖峰向下，可能是由卤素灯老化所致，这时应更换。[/color][/font][/align]以上内容来自仪器信息网《PCR实战宝典》

荧光定量PCR（FQ-PCR)技术推广荧光定量PCR技术的先进性FQ-PCR与常规PCR相比，具有显著的优势：（1）实现基因表达的精确定量。（2）特异性好，大大降低了检测的假阳性；（3）灵敏度高，采用灵敏的荧光检测系统对荧光信号进行实时监控；（4）操作简单，无PCR产物污染。file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps_clip_image-6075.png 应用TagMan探针技术进行FQ-PCR反应示意图试剂盒优势：省去了最麻烦的基因序列查询、引物探针设计、PCR扩增条件优化等大量费时、费力、费钱的繁琐工作，并且有专业的实验室进行技术服务和技术支持。 详细内容，请看附件。

一、实验目的 本实验目的了解PCR反应用来扩增DNA 特异性片段实验的的基本原理、实验方法和操作步骤，熟练掌握PCR反应基本体系配制和实验条件的设定。 二、实验原理 PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应是1986 年由Kallis Mullis 发现。这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病诊断，肿瘤机制探查，法医鉴定等方面。PCR技术已成为方法学上的一次革命，它必将大大推动分子生物学各学科的研究发展。PCR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物经酶促合成特异的DNA 片段的体外方法，由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA 得以迅速扩增，主要过程如图6。置待扩增DNA 于高温下解链成为单链DNA 模板;人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合;DNA聚合酶在72 ℃将单核苷酸从引物3"端开始掺入，沿模板5"—3"方向延伸，合成DNA 新链。由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR 产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。PCR技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqDNA 聚合酶缺乏5"—3"核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，不过Innis M·A 发现，错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。PCR技术应用广泛，不可能有这样一套条件满足所有的实验，但本实验所介绍的方法可适应于大多数DNA 扩增反应，即使有的不适应，至少也确定了一个共同的起点，在此基础上可以作多种变化。不过下列因素在实验应用时应予以特别注意，以求取得满意结果。1. 模板：单、双链DNA 和RNA都可以作为PCR样品，若起始材料是RNA，须先通过逆转录得取第一条cDNA。虽然PCR 可以仅用极微量的样品，但为了保证反应的特异性，一般宜用ng 量级的克隆DNA，ug 级的染色体DNA，待扩增样品质量要求较低，但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶，Taq DNA聚合酶的抑制剂以及能结合DNA 的蛋白质。2. 引物：引物是决定PCR 结果的关键，下列原则有助于引物的合理设计。(1)尽可能选择碱基随机分布，GC 含量类似于被扩增片段的引物，尽量避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶或其它异常序列的引物。(2)避免具有明显二级结构(尤其是在引物3"—末端)的序列。(3)防止引物间的互补，特别要注意避免具有3"末端重叠的序列。(4)引物的长度约为20个碱基，较长引物较好，但成本增加，短引物则特异性降低。(5)引物浓度不宜偏高，过高易形成二聚体，而且扩增微量靶目标或起始材料是粗制品，容易产生非特异产物。3. 缓冲液：PCR缓冲液的变化通常会影响扩增结果，特别是MgCl2，其浓度对专一性和扩增量有重大影响，通常最适浓度为1.5 mM左右(每种dNTP 的浓度为0.2 mM时)，浓度过高，使反应特异性降低;浓度过低，使产物产量降低。四种dNTP 浓度通常每种都是0.05 mM—0.2 mM。过高的浓度会导致错误掺入，浓度过低，则影响反应产物的产量。四种dNTP浓度应大体相同，其中一种若偏高，会诱发错误掺入，降低合成速度，过早终止延伸反应。另外dNTP 能与Mg2+结合，使游离Mg2+浓度降低，所以如果dNTP 的浓度有很大改变，MgCl2浓度也要改变。Taq聚合酶是一种耐高温聚合酶，用量通常是1—4 单位/100 ul，浓度过高，产生过多的非特异片段。4. 循环参数：PCR 循环是把起始材料加热到90—95 ℃，保持短时间使双链DNA 解链;然后冷却至37—55 ℃，使引物与模板退火;再升温至70—75 ℃，在TaqDNA聚合酶的作用下掺入单核苷酸，使引物沿模板延伸。解链不完全是导致PCR 失败的最主要原因。用DNA扩增仪时，94 ℃保持1 分钟可使模板的起始物完全变性。若用低于94 ℃的条件，则应适当延长时间。引物与模板退火温度由引物的长度及G+C含量决定。适时间退火(1—2)分钟有利于产物的特异性。引物延伸在70—75 ℃保温的时间可根据扩增DNA片段的长短来调节。正常情况下，每分钟可延伸1 Kb 的长度，常规PCR 一般为25—40个循环，若循环加长，则由于酶活性降低，聚合时间延长，引物及单核苷酸减少等原因，反应后期容易产生错误掺入，所以在满足产物得率前提下，应尽量减少周期次数。三、材料(一)仪器与器皿PRC 扩增仪(PE2400)，琼脂糖凝胶电泳设备，微量取样器，一次性指形管，凝胶成像仪 玻片(二)试剂与材料1. 琼脂糖凝胶电泳试剂1)电泳缓冲液：Tris—乙酸0.04 mol/L PH8.0 0.002 mol/L EDTA2)加样缓冲液：0.25%溴酚兰40% w/v蔗糖3)溴化乙锭溶液：0.05 mg/ml溴化乙锭/水4)琼脂糖2. TaqDNA 多聚酶3. 5′反应缓冲液：125 mmol/L Tris-HCl pH8.2;10 mmol/L MgCl2;0.5 mg/ml gelatin;125 mmol/L(NH4)2SO4; Formamide 25%4. 混合dNTP 液(dATP dGTP dTTP dCTP各2 mmol/L)5. DNA 模板(每2 ml 中含有10 fg 待扩增DNA)6. 引物 1 (25 pmol/L)，5’加入EcoRI 粘性末端碱基7. 引物 2 (25 pmol/L)，5’加入HindIII 粘性末端碱基8. 无菌水四、实验步骤1. 按顺序在200 ml 指形管中加入以下试剂与样品：(因购入的试剂批次不同，加样时有 所差别，以预实验结果为准。)1) ddH2O 74 ml2) 10′Buffer 10 ml3) MgCl2 6 ml(10′Buffer 如已加入MgCl2，则不必加)4) dNTP 2 ml5) 引物1 2 ml6) 引物2 2 ml7) 模板 2 ml8) Taq DNA聚合酶2 ml总体积共100 ml(也可以配成40 ml 的反应体系)2. 在PCR 扩增仪上按以下反应条件编入程序：(以下为参考值，因扩增的DNA片段不同，各类PCR 扩增仪程序设定各不相同，编程过程视扩增的DNA 片段的要求及仪器而定参数，见示范。)预变性 94 ℃ 2 分种循环条件(30 次)变性 94 ℃ 40 秒复性 55 ℃ 35 秒延伸 72 ℃ 2 分10 秒延长延伸 72 ℃ 7 分钟编完反应程序，置反应管于PCR扩增仪的反应孔中，开动机器，扩增循环反应开始。3. PCR 扩增完毕，配2%琼脂糖凝胶，取15 ml 反应液及相适应的PCR mark 分别点样， 加样缓冲液应为40%W/V 蔗糖，电泳观察结果。4. 凝胶成像仪或紫外灯下观察实验结果，是否已扩增到实验设计的DNA 片段。注意事项： 要想得到预期的实验结果，PCR的反应条件和很多参数有着密切的关系，都应引起注意。在实验设计中我们要考虑到模板浓度的大小，设计引物时也要主要引物长度适当以及恰当的GC含量，在PCR体系中引物浓度，dNTPs浓度相对要均衡，选取的taq enzyme，缓冲液的离子含量也是影响产物的结果，另外就是要根据产物大小设定适当的变性时间，退火温度及时间，延伸的时间。

前一段时间在百度中搜索，发现多年前写的一个关于荧光定量PCR技术的PPT有很多人看过或引用过，考虑到自己作荧光定量PCR工作已经了五年了，做的实验以及解决的问题远比五年前多了，因此利用过年的时间，写点荧光定量PCR实验中的一些注意事项及感想，无论对错，都是希望对相关的人员有些参考价值。 荧光定量PCR原理等大家都已经很熟了，我就不细说了，主要是写一些有人问过的事，希望写的内容是大家都关心的。普通PCR与荧光定量PCR技术区别？简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段，用于克隆、测序等实验，后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量，而荧光定量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。前些年有人讲过普通PCR后，通过电泳也可以进行定量，其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。Sybr Green、Taqman、Molecular beacon、LUX这些方法如何选择？从实验成本来讲，Sybr Green是最好的，基本上就是普通PCR加上一点Sybr Green I 荧光染料即可，其信号强度也很好，还可以进行融解曲线分析等，但缺点是只能在一个反应管内进行一种PCR反应的检测，另一个问题是非特异性扩增会影响实验结果，当然也有一些技术解决这些问题，后面会讲到。对于研究人员来讲，如果需要检测的基因很多，而每个反应管中进行一种PCR反应的检测可以满足实验要求，则Sybr Green是最好的选择。如果需要进行多通道实验，即在一个反应管中进行2种或以上的反应，则要选择其他的方法，最常用的是Taqman、Molecular beacon，这两种都是探针的方式，由于增加了探针的特异性，因此其扩增曲线反映的就是特异性产物的扩增曲线，不含有非特异性扩增的成分。因此商业用途的检测试剂盒大都采用这一技术，以减少非特异性产物造成错误结论的可能性。其缺点在于探针成本较高，有时设计的探针并不合适，有造成损失的可能性。并且要进行较多的实验条件的优化。这两种探针技术用于商业目的时都有专利问题，据说取得Molecular beacon的许可权的成本相对较低，但只是据说。另一种值得一提的是LUX探针，它也可进行多通道实验，但它没有Taqman和Molecular beacon方法的增加探针特异性的功能，因此只能是一种折中的方案，如果不考虑多通道实验，则不如Sybr Green法选择单通道实验还是多通道实验？这是要根据实验需要来选择的，如果有一个、两个或是三个基因要进行比较，并用看家基因进行对照，可以考虑选择多通道实验。多通道实验的好处是可以消除样本加样的误差。但要克服的困难也比较多，一是条件的优化比较麻烦，即多种PCR反应以及探针要在同一个反应条件下进行，并且效率都要比较高，另一个困难是要求相互之间没有干扰，因为干扰会影响到实验结果。还有一个困难是当一个基因的模板数显著大于其他基因时，因为共用核苷酸等资源的原因，会让模板数少的基因的定量值变小或变为零。因此一般两通道的实验比较多些，即一个基因进行多样本比较，用看家基因进行对照。可以看出，如果单通道实验可以解决问题，就不要选择多通道实验了。三个以上的基因进行比较时就最好用单通道。因为一般的仪器最多也只有四个通道，就是有更多的通道，实验条件的优化也是足够麻烦了。双通道实验时如何克服反应条件、干扰以及模板数差别很大等困难？对于反应条件的优化，可通过两个单独实验的标准曲线来优化，主要是复性温度，可用PCR仪的温度梯度功能来选择，然后找到一个合适的复性温度。对于如何确定是否存在相互干扰，则要通过两个独立的单通道实验与双通道实验的结果进行比较，如果差别不大，则表明没有干扰。至于模板数差别很大的问题，可以通过降低引物浓度的方法来实现，即primer limited，在一般的PCR反应中，引物的浓度是足够高的，基本上可以将反应液中的核苷酸全部消耗尽，在优化引物浓度时，用不同的引物浓度进行实验，找到不影响反应的C(t)值的最低引物浓度。这样在实际反应中，模板数高的基因在引物耗尽后，反应液中仍然有足够的核苷酸等用于另一个基因的反应。引物设计中的几个注意事项1、 引物设计最好用相关的软件来进行设计，考虑引物自身回折、错配、引物二聚体、复性温度、产物变性温度等问题，其中产物的变性温度是大家不太关心的问题，但有些产物在一般的95度条件下不能充分解链，会严重影响实验结果。2、 引物所设计的片断一定要有足够的特异性，选择好片段后，最好到互联网中进行相关的搜索，看在样本的基因组有没有相拟的基因以及假基因等，如果有，则可选择特异性更高的区域。3、 在进行mRNA表达量的定量，可以在引物设计时考虑基因组的污染问题，即在引物设计时让两个引物跨一个内含子，这样基因组污染所造成的扩增可以区别出来，或因为片段过大而不能扩增4、 由于mRNA表达量的定量有一个逆转录的过程，如果逆转录是用poly（T）作引物，则设计的片段尽量靠近poly（A），以免逆转录的效率影响到实验结果。如果用特异性引物进行逆转录，则要考虑引物区是否存在RNA二级结构的问题5、 产物片段的大小：定量PCR一般产生片段都不大，不会超过600bp。Sybr Green法一般选择250-600bp，过大会影响到PCR扩增的效率，过小则很难通过融解曲线与引物二聚体分开，但并不是绝对的。Taqman法的扩增片段都很小，几十或是100多，这是其原理造成的。Molecular beacon法对片段大小的要求不高，只要不是太长即可。Sybr Green法的实验策略：实验可分为三个阶段，即实验条件的优化、预实验和正式实验。一、 实验条件的优化阶段，这一阶段是最花时间的，1、 要找到一个阳性的模板，可以是克隆有基因质粒、强阳性样本或纯化的PCR产物等。有了阳性的模板才能进行最基本的定量扩增实验，如果有普通PCR的实验条件，也可以此为基础进行实验。2、 扩增出的产物要通过电泳方法确定其大小，以确认定量PCR扩增的产物是你的目的基因，有些用户就发生过优化了几天的条件才发现扩增片段的大小不对，不是自己想要的基因。当然，能测个序什么的最好。并通过融解曲线实验来确定产生的Tm值以及所用的变性温度是否已经足够，个别情况下会出来解键不充分的现象。3、 有了基本的PCR条件后，要将阳性模板进行倍比稀释，一般用10倍稀释。将稀释的模板带上阴性对照，分成多份进行温度梯度实验，对复性温度进行优化，以找出复性温度范围，复性温度最好能满足以下条件：高中低模板浓度下PCR扩增效率都很高、阴性模板没有扩增。选择满足条件的中间温度，这样可以提高实验的稳定性，不会因为样本管在加热模块中的位置不同而影响实验结果。4、 如果找不到合适的条件，如引物二聚体过多，可对引物浓度、Mg2+离子浓度、DMSO含量等进行优化，然后再进行复性温度梯度实验。其中Mg2+离子浓度、DMSO含量都会影响Tm值以及所用的变性温度。

德国有家做PCR仪的公司叫BIOMETRA的，中文叫什么名字啊？请高手请教，感谢

急!急!今天进行PCR扩增,为什么没有荧光反应?是染料过期还是什么问题?

荧光定量PCR（也称TaqMan PCR,以下简称FQ-PCR）是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与变通PCR相比，FQ-PCR具有许多优点。本文拟就该技术的特点、原理和方法以及应用作一简要叙述。一、特点FQ-PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于荧光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，克服了常规PCR的许多缺点。如一般PCR产物都需通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测，不仅需要多种仪器，而且费时费力，所使用的染色剂溴化乙锭对人体又有害，这些繁杂的实验过程又给污染和假阳性提供了机会。而FQ-PCR只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要PCR后处理，避免了常规PCR操作中的诸多弊端。实验一般使用PE公司研制的ABI7100型PCR扩增仪。该仪器具有以下特点：①应用广泛：可用于DNA和RNA的PCR产物定量、基因表达研究、病原体检测及PCR条件的优化等。②独特的定量原理：采用荧光标记探针，经激光激发后荧光量随PCR循环而累积，从而达到定量目的。③工作效率高：内置9600型PCR扩增仪，电脑控制1～2小时全自动同步完成96个样品的扩增及定量。④无须凝胶电泳：无须对样品进行稀释和电泳，只须通过特殊探头在反应管内直接检测。⑤无管道内污染：采用独特全封闭反应管及光电传导系统，无须顾及污染。⑥结果重现性好：定量动态范围高达五个数量级。所以自从此项技术研制成功以来，受到许多科研工作者的重视并在多个领域得到应用。二、原理和方法FQ-PCR的工作原理是利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5’端标以荧光发射基因FAM（6-羧基荧光素，荧光发射峰值在518nm处），靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA（6-羧基四甲基若丹明，荧光发射峰值在582nm处），探针的3’开端被磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，518nm处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板DNA发生杂交，延伸期Taq酶随引物延伸沿DNA模板移动，当移动到探针切断，淬灭作用被解除，荧光信号释放出来（见图）。模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，因此用该技术可对模板进行准确定量。实验仪器一般使用PE公司研制的ABI7100型 PCR扩增仪，也可用其它PCR仪。如果用ABI7700型反应型反应系统进行实验，反应结束后，通过电脑分析，可直接给出定量结果。如果用其他PCR仪，则需要同时使用荧光探测仪测量反应管中的荧光信号，计算出RQ+、RQ-、△RQ。RQ+代表样品管荧光发射基团发光强度与淬灭基团发光强度的比率，RQ-代表空白管中二者的比率，△RQ（△RQ=RQ+-RQ-）代表PCR过程中荧光信号变化量，经过数据处理，即可得出定量结果。由于荧光探针的引入，显著提高了实验的特异性。探针设计一般应符合以下条件：①探针长度应在20～40个碱基左右，以保证结合的特异性。②GC碱基含量在40%～60%，避免单核苷酸序列的重复。③避免与引物发生杂交或重叠。④探针与模板结合的稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5℃。另外，探针的浓度、探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。 http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/07/21/1216476450.gif图.TaqMan PCR反应模式 （A）聚合反应；（B）链置换；（C）裂解； （D）聚合完成（R：FAM；Q：TAMRA，FP：上游引物；RP：下游引物）