分子间相互作用分析仪

因为固相萃取填料有时是同时存在多种作用力的，写的时候发现表达十分困难，要是大家在看的过程发现写得不好的地方，或者有意见提出，可以联系我。谢谢各位。[b]本文不得擅自转载，若需转载，请联系本人。[/b][color=#000000] 极性相互作用因为氨基、羟基等基团的存在有时伴随离子相互作用，当存在强度较大的离子键时，单纯增大溶剂的洗脱强度未必能有效洗脱目标化合物。此外，正相机制一般以低极性溶剂上柱。所以[b]实验人员选择正相机制时，应先确定目标化合物溶于正己烷、甲醇等有机溶剂。[/b]既有效排除离子相互作用还符合正相模式的上柱要求。[/color][b]由此可知，正相模式需要满足如下条件：①萃取的溶剂是有机溶剂；②分析物可溶于有机溶剂；③分析物为极性或中等极性。[/b]在正相固相萃取中，主要发挥作用的有这三种力：偶极-偶极作用力，氢键作用力，π-π共轭。[b]极性相互作用较为复杂，有时是多种作用力共同作用。[color=#000000]①偶极-偶极作用力[/color][/b][color=#000000]在日常工作中，实验人员经常会听到一个词语-极性，经验上水的极性大，碳18的极性小。这里的极性大小，指的是偶极矩（μ）的大小，这是一个矢量。如果要简单的说，偶极矩实际就是分子的电荷分布是否均匀，有多不均匀，以下图为例。 [b] [/b][/color][b][img=,900,212]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/03/201903031856360279_4828_3092963_3.jpg!w900x212.jpg[/img][/b]明显，水和氨的电荷分布是不均匀的，所以偶极矩不为零，是极性分子。而二氧化碳和四氯化碳尽管碳氧双键和C-Cl键的电荷分布不均，但对称的结构消去了分子的极性，可见分子的极性和分子的空间结构有很大的关系。像水、氨这样的偶极矩不为零的分子，都含有永久偶极。永久偶极不需诱导，即可与其他电荷分布不均匀的分子发生吸附作用，即偶极-偶极作用力，原理见下图。[img=,869,264]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/03/201903031857001463_344_3092963_3.jpg!w869x264.jpg[/img][b]正相固相萃取柱，均可拥有这种作用力。但正相相互作用中，更多利用的是氢键。有时氢键和偶极作用会一起发生作用。[color=#000000]②氢键作用力[/color][/b][color=#000000]在极性相互作用力中，还有氢键。形成条件：①拥有与电负性大且半径小的原子(F、O、N)相连的 H；②在附近有电负性大, 半径小的原子(F、O、N)。如下图所示，氢氧键的极性很强，共用电子对就会偏向氧，这时另一个水分子带部分负电荷的氧靠近，就产生了氢键。除了氧氟氮原子外，氯原子也可产生氢键。正相固相萃取中，多数情况下都是利用氢键作用。[/color][img=,359,149]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/03/201903031857313450_935_3092963_3.png!w359x149.jpg[/img][img=,379,218]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/03/201903031857352593_3750_3092963_3.png!w379x218.jpg[/img][b][color=#000000]③π-π共轭[/color][/b][color=#000000]π-π共轭等是指两个以上双键(或叁键)以单键相联结时所发生的 π电子的离位作用。（这个涉及分子轨道理论，篇幅问题大家有兴趣自行查阅）最后，极性固相萃取柱还存在诱导偶极矩及其他多种相互作用力。相比非极性相互作[/color][color=#000000]用，极性填料的力可谓复杂了许多。[/color]根据以上介绍的力去推导。我们可以知道正相固相萃取柱[b]原则上包含：羟基、氨基、羰基、巯基（偶极-偶极相互作用）、电负性原子O\N\F\S\P等（氢键）、双键（π-π共轭）。[/b]硅胶固相萃取柱、氨基柱、氰基柱（既可正相也可反相）、二醇基柱、弗罗里硅土及酸性氧化铝、中性氧化铝、碱性氧化铝等。均具备正相吸附能力。[img=,521,314]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/03/201903031858243757_4781_3092963_3.png!w521x314.jpg[/img] 例如上图，是二醇基柱和氰基柱的吸附作用。二醇基柱是通过氢键吸附，氰基柱是通过偶极偶极作用吸附。[color=#000000][b]知道正相作用力机制有什么用[/b][/color][color=#000000]一般情况下，非极性溶剂（正己烷、异辛烷等）能促进极性分析物在极性固相萃取柱中的保留。这是因为高极性溶剂对目标物具有一定溶解性，且与吸附剂有竞争作用，会使吸附剂与目标物之间的极性作用力被破坏，导致吸附剂无法有效吸附。而在洗脱时，通过高极性溶剂破坏吸附剂与目标化合物的极性作用力，即可完成洗脱。同时，高离子浓度也能破坏极性相互作用力，这是因为硅胶一般通过形成氢键达到吸附，高离子浓度可以抑制氢键（例如对水的氢键破坏作用：CaCl[sub]2[/sub]＞MgCl[sub]2[/sub]＞FeCl[sub]3[/sub]＞NaCl）。[/color][color=#000000]我们通过目标物的化学结构，了解到吸附材料和目标物存在什么作用力。知道了作用力，我们自然可以通过各种手段加强或者减弱这些力，以达分离和纯化的目的。当我们的化合物拥有较多羟基或者氨基，我们是不是可以思考利用氢键作用力进行吸附呢？那么硅胶柱、氨基柱等好像是很好的选择。当目标物溶于有机溶剂、较少羟基氨基，同时极性较中等，双键较多，氰基柱是不错的选择。有时我们在优化实验时怎样也无法得到满意的回收率，是不是因为操作不当导致了离子力的吸附呢？在这种情况下，是否应该修正前处理或者另辟蹊径呢？如果不是离子力的作用，那就是吸附过强或过弱导致的。吸附过强可以通过降低吸附剂极性、轻微破坏氢键作用、增强洗脱剂强度改善。吸附过弱，就需要反向操作或更换吸附模式了，例如更换反相模式或离子模式。π-π共轭的削弱或增强可以通过衍生化反应，减少或增加π键的数量，达到目的。具体问题需要具体分析，相信广大实验人员一定能总结出自己的经验。[/color][color=#000000][/color][color=#000000][b][color=#000000]正相固相萃取填料的介绍[/color][/b][/color][table][tr][td=1,1,112][align=center][color=#000000]正相固相萃取柱[/color][/align][/td][td=1,1,111][align=center][color=#000000]功能基团[/color][/align][/td][td=1,1,114][align=center][color=#000000]保留机制[/color][/align][/td][td=1,1,106][align=center][color=#000000]封端（+表示有，-表示无）[/color][/align][/td][td=1,1,110][align=center][color=#000000]应用[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,112][align=center][color=#000000]氰基柱[/color][/align][/td][td=1,1,111][align=center][color=#000000]氰丙基[/color][/align][/td][td=1,1,114][align=center][color=#000000]非极性相互作用或极性相互作用[/color][/align][/td][td=1,1,106][align=center][color=#000000]+[/color][/align][/td][td=1,1,110][align=center][color=#000000]C18\C8\硅胶等对目标吸附过强，可以选择氰基柱[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,112][align=center][color=#000000]硅胶柱[/color][/align][/td][td=1,1,111][align=center][color=#000000]硅羟基[/color][/align][/td][td=1,1,114][align=center][color=#000000]极性相互作用[/color][/align][/td][td=1,1,106][align=center][color=#000000]-[/color][/align][/td][td=1,1,110][align=center][color=#000000]最强的极性材料，可用于分离异构体[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,112][align=center][color=#000000]氨基柱[/color][/align][/td][td=1,1,111][align=center][color=#000000]氨丙基[/color][/align][/td][td=1,1,114][align=center][color=#000000]极性相互作用、阴离子交换作用[/color][/align][/td][td=1,1,106][align=center][color=#000000]-[/color][/align][/td][td=1,1,110][align=center][color=#000000]pKa：9.8，非极性溶剂活化能与-OH\-NH\-SH形成氢键，此外能作为弱阴离子交换柱[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,112][align=center][color=#000000]PSA柱[/color][/align][/td][td=1,1,111][align=center][color=#000000]乙二胺-N-丙基[/color][/align][/td][td=1,1,114][align=center][color=#000000]极性相互作用、弱阴离子交换作用[/color][/align][/td][td=1,1,106][align=center][color=#000000]-[/color][/align][/td][td=1,1,110][align=center][color=#000000]pKa：10.1和10.9，非极性作用力比氨基柱强，若某强极性化合物在氨基柱无法洗脱可尝试用PSA[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,112][align=center][color=#000000]二醇基固相萃取柱[/color][/align][/td][td=1,1,111][align=center][color=#000000]二醇基[/color][/align][/td][td=1,1,114][align=center][color=#000000]非极性相互作用或极性相互作用、阴离子交换[/color][/align][/td][td=1,1,106][align=center][color=#000000]-[/color][/align][/td][td=1,1,110][align=center][color=#000000]特别适用于从非极性溶剂中萃取极性化合物[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,112][align=center][color=#000000]弗罗里硅土[/color][/align][/td][td=1,1,111][align=center][color=#000000]硅羟基[/color][/align][/td][td=1,1,114][align=center][color=#000000]极性相互作用[/color][/align][/td][td=1,1,106][align=center][color=#000000]-[/color][/align][/td][td=1,1,110][align=center][color=#000000]样品粘度大可替代硅胶柱，也可在特殊情况替代氧化铝[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,112][align=center][color=#000000]（酸性）氧化铝[/color][/align][/td][td=1,1,111][align=center][color=#000000]-[/color][/align][/td][td=1,1,114][align=center][color=#000000]极性相互作用、阴离子交换作用[/color][/align][/td][td=1,1,106][align=center][color=#000000]-[/color][/align][/td][td=1,1,110][align=center][color=#000000]PH约为5，主要用于吸附阴离子、极性化合物[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,112][align=center][color=#000000]（中性）氧化铝[/color][/align][/td][td=1,1,111][align=center][color=#000000]-[/color][/align][/td][td=1,1,114][align=center][color=#000000]极性相互作用、离子交换作用[/color][/align][/td][td=1,1,106][align=center][color=#000000]-[/color][/align][/td][td=1,1,110][align=center][color=#000000]PH约为7.5，样品中极性或非极性化合物分离[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,112][align=center][color=#000000]（碱性）氧化铝[/color][/align][/td][td=1,1,111][align=center][color=#000000]-[/color][/align][/td][td=1,1,114][align=center][color=#000000]极性相互作用、阳离子交换作用[/color][/align][/td][td=1,1,106][align=center][color=#000000]-[/color][/align][/td][td=1,1,110][align=center][color=#000000]PH约为10，主要用于吸附阳离子、极性化合物[/color][/align][/td][/tr][/table][b][color=#000000]正相固相萃取的注意事项：[/color][/b][color=#000000]当利用正相固相萃取极性化合物时：[/color][color=#000000]首先要确定的是，样品的萃取溶剂最好是低极性溶剂，因为极性溶剂上正相柱，较难吸附。[/color][color=#000000]活化：一般用低极性溶剂进行活化处理（正己烷）[/color][color=#000000]上样：将低极性溶剂的样品上柱[/color][color=#000000]淋洗：适当增加溶剂极性，才具备洗去杂质的能力[/color][color=#000000]洗脱：中强极性有机溶剂。建议使用的洗脱溶剂（洗脱强度逐渐增大）：己烷、二氯甲烷、THF、丙酮、乙腈、异丙醇。以下为溶剂正反模式洗脱强度：[/color][img=,900,618]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/03/201903031859366495_8785_3092963_3.jpg!w900x618.jpg[/img]正相模式下，活化→上样→淋洗→洗脱，[b]4个步骤在建立固相萃取方法时应该合理地逐渐增加溶剂极性，以洗去杂质，保留目标物。[/b]在优化方法时，可以通过建立淋洗曲线和洗脱曲线，找出适合的淋洗溶剂和洗脱溶剂。[b]淋洗液要求，在洗出目标物前的最大洗脱强度，以求最大限度除去杂质。而洗脱液含量要稍微大于目标化合物完全被洗脱时的溶剂体系，这是因为过强的洗脱强度会把强吸附杂质一同洗下。[/b]最后，[b]正相模式比反相模式有更好的选择性[/b]。当使用氨基柱、PSA柱等分离结构异构体，实际是通过增加溶剂极性或洗脱剂的量完成的。[b]前文提要：[b][url=https://bbs.instrument.com.cn/topic/7100954]干货|固相萃取篇01-了解PH、PKA[/url][url=https://bbs.instrument.com.cn/topic/7100956]干货|固相萃取篇02-非极性相互作用，碳系吸附剂选择原则。[/url][/b][/b]

我们知道固相萃取理论其实同样适合我们的色谱柱，我们可以将固相萃取小柱理解为一根柱效更低的色谱柱，但因为填料较少，柱效较低，一般实验人员只将固相萃取柱作去杂、富集工具使用。既然固相萃取是一种吸附与解吸附的技术，实验人员首先要了解的是其相关的力，才能更好地应用固相萃取小柱。[b]固相萃取作用力[/b]主要包含以下四种：①[b]非极性相互作用[/b]、②[b]极性相互作用[/b]、③[b]离子相互作用[/b]、④[b]次级相互作用[/b]。[align=center][/align][b]非极性相互作用（疏水相互作用）[/b]：主要发生在[b]吸附剂烃基[/b]及[b]目标物烃基[/b]间的作用力。其成因是分子的瞬间偶极与[b]瞬间诱导偶极[/b]之间的作用力。具体原理看图更好理解：[align=center][img=,690,512]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/02/201902090703237076_4077_3092963_3.jpg!w690x512.jpg[/img][/align]图a，一般情况非极性分子正负电荷重心重合；图b，原子核和电子运动导致电荷重心瞬间偏移，出现[b]瞬间偶极[/b]（椭圆左正右负）；图c，由于分子出现[b]瞬间偶极[/b]，相邻的正负电荷重心重合的分子被相关的正负偶极吸引，引起异极相邻，产生作用力，这是[b]瞬间诱导偶极，[/b]产生相关的力，从而发生吸附。[align=center] [img]data:image/gif base64,iVBORw0KGgoAAAANSUhEUgAAAAEAAAABCAYAAAAfFcSJAAAADUlEQVQImWNgYGBgAAAABQABh6FO1AAAAABJRU5ErkJggg==[/img][/align]以[color=#ff4c00][b]非极性作用力[/b][/color]为主要作用力的固相萃取填料有：[color=#000000]C18、C8、C2、C1、苯基柱、环己基、CN（同时具备非极性、极性相互作用力）、HLB（同时具备非极性、极性相互作用力）[/color]等。[b][color=#ff4c00]由C18到C1，随着碳链慢慢变短，填料极性逐渐变大，C2极性比CN稍低。[/color][/b]HLB为亲水亲油平衡柱，属于一种聚合物吸附剂，我们会在将来对这类聚合物填料进行讨论及汇总。大多数有机化合物都含非极性基团，因而吸附剂可以通过非极性相互作用吸附目标物。[b]我们在挑选[/b][color=#0052ff][b]溶解目标物[/b][/color][b]的溶剂时，应尽可能选择可接受的（[/b][color=#0052ff][b]能溶解目标物[/b][/color][b]），[color=red]极性较强[/color]的溶剂（例如水、含有少量有机相的水等等）。[/b]这是因为低极性溶剂对目标物具有一定溶解性，且与吸附剂有竞争作用，会使吸附剂与目标物之间的非极性作用力被破坏，导致吸附剂无法有效吸附。而在洗脱时，通过低极性溶剂破坏吸附剂与目标化合物的非极性作用力，即可完成洗脱。[align=center] [/align]在非极性相互作用填料中，C18是发展较早的一种固相萃取填料。一般通过硅胶与氯硅烷或甲氧基硅烷反应制得：[color=#0052ff]Silica-O[/color][color=#ff0000]H[/color]+[color=#ff0000]Cl[/color][color=#0052ff]Si(CH[sub]3[/sub])[sub]2[/sub](CH[sub]2[/sub])[sub]17[/sub]CH3[/color]→[color=#0052ff]Silica-O-Si(CH3)2(CH2)17CH3[/color]+[color=#ff0000]HCl[/color]由于空间位阻的存在，在实际的填料制备过程，并非所有硅胶都会发生反应，未反应的硅胶令许多硅羟基裸露在外。(如下图所示，红圈表示未反应的硅羟基，长链代表完成键合的C18)，[b][color=#3da742]裸露的硅羟基会与极性较大的组分产生吸附，如果被吸附物是醇或者胺，则这种吸附一般是以氢键的方式进行。[/color][/b]为了防止残留硅羟基对实验结果的影响，人们利用三功能团硅烷化试剂对已键合好的材料进行“封端”处理，表面残留的硅羟基就被惰性了[b]（我们可以简单理解为将裸露的硅羟基反应掉）[/b]。所以市面上有“封端”C18固相萃取柱及“不封端”C18固相萃取柱。（[b][color=#ff4c00]色谱柱也一样[/color][/b]）[img=,513,460]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/02/201902090705173457_7504_3092963_3.jpg!w513x460.jpg[/img][align=center][/align][align=center][img=,479,430]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/02/201902090706068426_6818_3092963_3.png!w479x430.jpg[/img][/align][align=center][/align]我们的目标物，就如上图的[b][color=#ff2941]六角形[/color][/b]一样，通过疏水相互作用（非极性相互作用）被C18填料吸附住。（C8、C2、苯基、CN等柱与C18填料的区别在于C18长链更换成C8\C2\苯基或CN）。[align=center] [img]data:image/gif base64,iVBORw0KGgoAAAANSUhEUgAAAAEAAAABCAYAAAAfFcSJAAAADUlEQVQImWNgYGBgAAAABQABh6FO1AAAAABJRU5ErkJggg==[/img][/align]那我们该如何选择固相萃取填料呢？这需要从我们的填料和分析物开始思考。实际情况需要具体情况具体分析，非极性目标物选择非极性相互作用填料、极性目标物选择极性相互作用填料。[b]非极性作用太强无法有效洗脱，适当选择更高极性的填料（如C8\C2\CN等等）、含有特殊基团（如苯环）较多的物质，还可选择苯基柱。[/b]当化合物在溶剂中为离子态，此时可以使用离子型交换柱，或通过调节pH值抑制化合物离子化，然后根据化合物的极性确定使用正相填料或反相填料。[b][color=red]以下，先介绍反相固相萃取填料的选择流程及注意事项，正相及离子型交换填料请待下回分解。[/color][/b]1.查阅C18、C8、C2、[b]苯基柱、CN[/b]等填料的说明书，确定填料的可耐受pH范围。2.需要查阅我们相关分析物的pKa，确定我们的分析物在溶剂中是以何种形态存在的，分子态还是离子态，还是共存。（这里有查找方法：→[url=http://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzA3NTI2NzUzNw==&mid=2458466635&idx=1&sn=c2daaa9f4df18773105e82f765a46352&chksm=880eb5f5bf793ce3edba8eee762267f2971f8942f90cf0f9f1525d6c2285fed7157f90bf6672&scene=21#wechat_redirect]干货|固相萃取篇01-了解PH、PKA）[/url]3.当分析物为非极性，在溶剂中分子态，若考虑使用C18填料进行吸附，建议使用“封端”C18，这是因为分析样品基质较为复杂，同时杂质也较多，在这种情况下选择“不封端”C18填料，会对极性杂质进行吸附，降低了净化效果。若吸附太强无法洗脱，可以提高吸附剂极性，选择C8等吸附剂。4. 当分析物既有极性也有非极性，分子态时，由于“封端”C18无法对极性成分进行保留，此时，“不封端”C18填料的裸露硅羟基可发生一定的吸附作用，虽然稍微牺牲除杂效果，但可提极性成分的吸附效率。此外，还可以选择具有一定极性相互作用的C2、CN等固相萃取柱。5.倘若我们只有不封端的C18固相萃取柱怎么办？在这种情况下，实验人员应该想办法将硅羟基的次级相互作用降低。当填料硅羟基带负电荷，目标物带正电荷，次级相互作用主要为能量较大的离子相互作用。[b]当硅羟基未带电荷，次级作用将下降至最小。对于填料硅羟基而言，pH值越大，其解离程度越大，一般pH大于4.0，硅羟基带有明显负电荷。而分析物带电情况则十分复杂，因而最理想的pH应为硅羟基，分析物均不带电荷。[/b]而氢键、偶极偶极相互作用这两种次级相互作用较难避免，若实在无法满足净化要求，只能更换其他类型填料了。[align=center][img]data:image/gif base64,iVBORw0KGgoAAAANSUhEUgAAAAEAAAABCAYAAAAfFcSJAAAADUlEQVQImWNgYGBgAAAABQABh6FO1AAAAABJRU5ErkJggg==[/img][/align]6.固相萃取柱[b][color=#ff2941]保留目标物模式下的使用方法[/color][/b][align=center][img=,404,284]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/02/201902090706512017_4580_3092963_3.jpg!w404x284.jpg[/img][img]data:image/gif base64,iVBORw0KGgoAAAANSUhEUgAAAAEAAAABCAYAAAAfFcSJAAAADUlEQVQImWNgYGBgAAAABQABh6FO1AAAAABJRU5ErkJggg==[/img][/align]6.1[b]非极性相互作用固相萃取柱的活化与平衡。[/b]纯甲醇活化，纯水或样品溶剂平衡。甲醇活化的作用是使吸附剂上的功能基团展开，去除吸附剂的杂质。并且，非极性填料若[b][color=#ac39ff]直接[/color][/b]与水接触，由于它们互不相溶，以压力压下，[b][color=#ac39ff]其接触效果并不好[/color][/b]，以甲醇活化后，甲醇可引导纯水或样品溶剂与填料充分接触，纯水及样品溶液再加入，可令样品溶液有更大的接触面积，增加吸附效率。6.2[b]非极性相互作用固相萃取柱的上样。[color=#ac39ff]溶解样品的溶剂，极性记得要较大，例如用水。[/color][/b]低极性溶解会破坏非极性作用力，这样目标物就吸不住啦。6.3[b]淋洗和洗脱。[/b]因为淋洗只是为了清洗管壁等作用，这一部分[color=#ff2941][b]不能令目标物被洗脱[/b][/color]，可用纯水或者带有[b][color=#ac39ff]少量[/color][/b]甲醇的水溶液淋洗。[color=#ff2941][b]洗脱是为了尽量把目标物带出[/b][/color]，建议使用带有适量有机溶剂的水溶液、甲醇或者极性更低的溶剂把非极性相互作用力打破，以达到洗脱目的。[align=center][/align]7.固相萃取柱[b][color=#ff2941]保留干扰物模式下的使用方法[/color][/b][color=#ff2941][color=#000000]干扰物被保留，而收集洗出液。[/color][/color][align=center][img=,412,313]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/02/201902090707002307_9613_3092963_3.jpg!w412x313.jpg[/img][/align]7.1 使用样品溶剂一致的溶剂活化/平衡；7.2加入样品溶液，弃去前部分样品溶液，目的是为了弃去活化/平衡的溶剂；7.3收集流出液。8.影响固相萃取效率的因素8.1 吸附剂，前文提及的，因为吸附剂对目标化合物的吸附力原理不一样导致的；8.2 洗脱溶剂，洗不掉或在洗脱前就解吸附，直接影响回收率；8.3 保留体积，过多体积样品，和过浓目标物，容易导致固相萃取吸附过载，应该避免。8.4 流速，流速的控制对固相萃取至关重要，流速过大将引起固相萃取柱的穿漏，流速太小则处理速度太慢。柱预处理过程中流速适中，保证溶液充分湿润吸附剂即可，上样和洗脱过程则要求流速尽量慢些，以使分析物尽量保留在柱内或达到完全洗脱，否则会导致分析物流失，影响回收率的大小。尤其离子交换过程，进行比较缓慢，应采用较低的流速(0.5-2.0mL/min)。最后，汇总一下非极性相互作用吸附剂的应用范围吧。[table=767][tr][td=1,1,111]反相固相萃取柱[/td][td=1,1,99]功能基团[/td][td=1,1,147]保留机制[/td][td=1,1,411]应用[/td][/tr][tr][td=1,1,111]C18[/td][td=1,1,99]十八烷基[/td][td=1,1,147][b][color=#ac39ff]强非极性相互作用[/color][/b][/td][td=1,2,411]该疏水反相填料可保留大多数非极性化合物和水性基质中的大多数有机分析物，可用于脱盐。[/td][/tr][tr][td=1,1,111]C18（不封端）[/td][td=1,1,99]十八烷基[/td][td=1,1,147][b][color=#ff2941]非极性相互作用 （主）、次级相互作用（辅）[/color][/b][/td][/tr][tr][td=1,1,111]C8[/td][td=1,1,99]辛基[/td][td=1,1,147][b][color=#0080ff]中等非极性相互作用[/color][/b][/td][td=1,1,411]对非极性物质比 C18 固定相的保留相对弱一些，若C18与目标化合物无法有效洗脱，可以尝试换C8[/td][/tr][tr][td=1,1,111]C2[/td][td=1,1,99]乙基[/td][td=1,1,147][b][color=#3da742]非极性相互作用 （主）、极性相互作用（辅[/color][/b]）[/td][td=1,1,411]C18、C8均无法有效洗脱，可尝试C2，C2 的极性比氰基稍低。 [/td][/tr][tr][td=1,1,111]CN[/td][td=1,1,99]氰基[/td][td=1,1,147][b]非极性相互作用 （主）、极性相互作用（辅）[/b][/td][td=1,1,411]C18、C8均无法有效洗脱，可尝试CN，是水溶性样品提取的理想选择，在水基质和有机基质中均有保留[/td][/tr][tr][td=1,1,111]PH[/td][td=1,1,99]苯基[/td][td=1,1,147][b][color=#888888]中等非极性相互作用[/color][/b][/td][td=1,1,411]极性与C8类似，由于具有π-π相互作用，芳香环上的电子云增强了对共轭的或带芳香环的化合物的保留。[/td][/tr][tr][td=1,1,111]CH[/td][td=1,1,99]环己基[/td][td=1,1,147][b][color=#7a4442]中等非极性相互作用[/color][/b][/td][td=1,1,411]对某些分析物具有独特的选择性。若用作非极性吸附剂，CH 与C2 吸附剂具有相当的极性。当非极性吸附剂如C18、C8 或C2 的选择性不佳时可以选用。[/td][/tr][tr][td=1,1,111]C1[/td][td=1,1,99]甲基[/td][td=1,1,147][b][color=#d6a841]非极性相互作用 [/color][/b][/td][td=1,1,411]吸附剂采用了封端处理，屏蔽了极性活性硅羟基，因此这种固定相仍然可以实现对极性和多官能团化合物的保留和洗脱，C1是所有烷基官能团键合相中对非极性化合物保留最小的。[/td][/tr][/table]

[img=,500,95]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808021007141220_851_981_3.jpg!w690x132.jpg[/img]1 普通共聚焦（左半部分）和STED超分辨（右半部分）检测DNA蛋白互作效果对比。（5nM TFAM 647N，恒力4pN）[b]STED 超分辨[/b]单分子水平定量分析DNA与蛋白的相互作用要求技术水平达到在复杂的生物微环境中保证超高的时间分辨率。这种体内复杂的生物学反应尤其常见于在体外模拟体内实验，比如高浓度的蛋白与不断变化的DNA相互作用。采用受激发射损耗显微技术（STED）能够实现快速对复杂的DNA进行高分辨的扫描。LUMICKS公司研发的SuperC-Trap™ 技术结合STED，能够实现高分辨率可视化的研究多蛋白结合的DNA反应动力学。Figure 1 显示实时观测荧光标记的高浓度（大约 5nM)TFAM转录因子与λ-DNA的相互作用。SuperC-Trap™ 采用光镊技术原位拉直DNA，然后结合STED技术高分辨率（≥50 nm）高频率（≤200 Hz）线性追踪TASM的动态变化。STED 能够实现对单个结合或非结合、寡聚化蛋白基团的实时追踪(Figure 1, 右半部份)。然而利用共聚焦显微镜却分辨不出来 (Figure 1,左半部分）。共聚焦的点状激发原理决定了其只能追踪分布密度比较高的蛋白分子的动态变化，却不能进行广角扫描。而且采用共聚焦技术位置比较相近的两种蛋白也很难被分辨。但是利用STED的受激发射损耗技术可突破衍射极限，可以轻易分辨两种相邻蛋白。[img=,500,111]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808021023463820_3909_981_3.png!w690x154.jpg[/img]2 光镊技术（红色部分）结合共聚焦技术（绿色部分）模式图，多激发模式。[img=,500,103]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808021024169794_3597_981_3.png!w690x143.jpg[/img]3 光镊技术（红色部分）结合STED超分辨技术（黄色部分）模式图，单激发模式。[img=,500,198]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808021025123269_5345_981_3.png!w535x212.jpg[/img]4 共聚焦 (左) 和超分辨率显微镜STED (右)分辨率对比。647N-标记的结合DNA的限制性内切酶。5 共聚焦（蓝色）和超分辨率显微镜STED（红色）对两个相邻蛋白的分辨率对比。[b]SuperC-Trap[/b]共聚焦显微镜和超分辨显微镜的区别很明显。从Figure 4中可以看出超分辨显微镜能够清晰的将两种相邻蛋白分辨出来，而共聚焦的分辨率并不能达到。这种对比明显的说明了超分辨在精确定位上的优势。LUMICKS公司的SuperC-Trap不仅能够实现实时超分辨可视化的观察，而且还可以在亚pN水平、亚nm分辨率监测分子间的相互作用。结合我们的超稳定液流系统和独立的整合软件，使得整个实验在数分钟之内就能完成。