GS-Smart小型自动凝胶染色摇床在考马斯亮蓝染色实验中的应用考马斯亮蓝染色法(CBB染色法)是目前蛋白质染色实验中相当常用的方法,它既克服了氨基黑染色灵敏度不高的限制,号称目前灵敏度最高的蛋白质测定法之一,而又比硝酸银染色等其他方法更简便且更加容易操作,因而得到了广泛应用。考马斯亮蓝染色法的全实验过程有两个关键且耗时较长的步骤,分别是染色和脱色。通常,为了让蛋白凝胶能够充分的染色和脱色,一般会先后将CBB染色液、脱色液加入持续摇摆的脱色摇床工作池,再置入凝胶使其充分浸润洗涤,从而实现染色脱色。普通的脱色摇床除了工作池的摆动频率可以调节外,并没有其他参数可以设置,进液、换液和排液等步骤都必须由实验人员手动完成。而且启动后,由于工作池一般是持续不停的摆动,因而染色、脱色时间也只能靠实验人员自己把握。所以,普通考马斯亮蓝染色脱色实验一般都需要有实验人员值守。此外,为固定蛋白质和维持CBB在染色前的酸性环境,同时也为了去除前期电泳残留物质对染色的干扰,通常配置的CBB染色液或脱色液中有时会加入具有神经毒性的甲醇和强刺激性的乙酸,且配好的CBB染色液一般总体呈棕黑色(CBB R-250)。而普通脱色摇床的工作池完全敞开暴露,所以摆动过程中有可能溅出溢出CBB染色液、脱色液,还有可能挥发出有毒化合物。这样不仅容易造成污染,甚至可能产生安全隐患,进而危害实验人员的健康。鼎昊源GS-Smart小型自动凝胶染色摇床(又名自动凝胶染色仪)可以很好地解决以上普通考马斯亮蓝染色脱色实验所面临的问题,同时也能带来更多便利。首先,她的智能编程功能可以实现进液、换液、出液、定时摇动、废液回收的自动运行,全过程无需人员值守,从而真正全自动完成CBB染色脱色实验。其次,她配备了可封闭的染色池,能有效防止CBB染色液、脱色液溅出溢出,阻隔挥发物质,从而大大降低污染风险,保护实验人员的健康。染色池还有多款尺寸可选,甚至可以定制,从而尽可能多地满足不同科研工作者对考马斯亮蓝染色脱色实验的不同需求。第三,鼎昊源GS-Smart小型自动凝胶染色摇床操作起来也十分简单方便,只需“加入溶液、置入凝胶、设置管路程序、点击运行”四个简单的步骤,便可轻松搞定考马斯亮蓝染色、脱色的全过程,省时省力省心。另外,再值得一提的是,鼎昊源GS-Smart小型自动凝胶染色摇床还拥有国际外首创的机身与储液瓶一体化设计,与市场同类产品相比,减少了分散在外的瓶瓶罐罐,节省了实验室空间,同时也美化了整体外观。本文关键词:染色摇床,自动凝胶染色摇床,考马斯亮蓝染色,CBB染色
在分子生物学领域,凝胶电泳是再常见不过的实验了,也是检测生物大分子非常惯用的手段,在实验过程中,为了让这些肉眼难见的东西“现出原形”,就需要对凝胶进行染色,但众所周知,染色过程中用的化学试剂,没有那样是对人体无害的,EB就不用说了,硝酸银也不好惹,还有甲醛,连普通老百姓都敬而远之.......其他的我就不一一列举了。 在人们日益关注健康的今天,实验室的健康安全也渐渐的被诸位“老板”们放在了眼里,毕竟人家国外这一点都是做得很好的,为了与国际化接轨,各方面都是要学习的。 凝胶染色这类在以前看来最一般的“粗活”,现在也有设备可以替代人工了,如果你的工作量挺大,那还真是得了解放了。即便每天没有几十块的胶染,也可避免那些化学物的日积月累,毕竟谁都不是金刚不坏之身。 省事也是自动化最直接的好处,洗衣机带给“懒人”们的福音谁都不会质疑,有人说了,那是衣服,我的实验可没那么好做,那我就让大家看看另一个好处吧:(见下图) http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/09/201209101719_390013_2601691_3.jpg这是手动染色的,当然排除电泳跑的好坏不说,背景的污点是不可避免的。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/09/201209101721_390015_2601691_3.jpg自动染色的就干净多了。所以说,虽然有时候自动的设备比不上熟练的人手,但有时候给人们带来的好处还是显而易见的!应热心回帖支持者的要求,下面再介绍一下实现自动染色的仪器(先声明不是广告)。 实现自动化首先要有程序的支持,用句流行的词叫“微电脑控制”,就是操作者将实验步骤输入仪器,形成程序,仪器就会按照程序步骤去工作。现在的很多仪器,如最常见的如PCR仪就属于这种工作方式。 既然是自动化,那么就要尽量替代人工的操作,凡是染色过程中需要人卖力气的,都交给机器去干,其实算下来染色过程中人干的最多的就是换液,其他时间也是交给机器——各种规格的脱色摇床来干,然后就是拿着个Timer等了。所以自动染色就是要把换液的、摇床的、计时的七七八八功能整合到一块,使实验者只需将凝胶放入机器按下“开始”就OK了,这过程真的和自动洗衣机太像了。 由于尊重这里的版规,也更尊重学术的气氛,我在这就不便透露仪器的更多细节了希望谅解。
GS-Smart小型自动凝胶染色仪与台式水平脱色摇床在CBB染色法中的应用对比台式水平脱色摇床是生物学实验室常见的仪器设备,常用于普通凝胶电泳条带固定、考马斯亮蓝(CBB)染色脱色、硝酸银染色、蛋白质免疫印迹(Western Blot)、细胞培养和放射自显影等实验中。一般的台式水平脱色摇床主要是通过调节定幅载具的摆动频率,从而控制样品在溶液中的摆动快慢,这既是该仪器的基本工作原理,也是她在以上实验中主要发挥的作用。在普通考马斯亮蓝染色、脱色实验中,台式水平脱色摇床就是科研工作者们经常会用到的设备。一般是设定工作池的摇摆频率后,先后加入CBB染色液、脱色液,使摇床工作池持续摇摆,再置入蛋白凝胶使其在摇摆的液体中充分浸润洗涤,从而实现染色脱色。但一般的台式水平脱色摇床除了工作池的摆动频率可调外,没有其他参数能设置,虽然某些型号摇床还增加了定时功能,但也无法设置自动完成复杂的步骤。因此,前期进液、换液和排液都需要实验人员手动操作,另外,染色、脱色时间也只能靠实验人员自己把握。再者,台式水平脱色摇床的工作池一般裸露在外,摇摆过程中,有可能溅出溢出CBB染色液、脱色液,还有可能挥发出有毒化合物。这样不仅容易造成污染,甚至可能产生安全隐患,进而危害实验人员的健康。相比之下,鼎昊源GS-Smart小型自动凝胶染色仪无论在功能上、设计上还是外观上均领先台式水平脱色摇床,例如:1.智能编程功能:GS-Smart内置3种标准的染色程序,可编程存储47个自定义程序,可以轻松实现进液、换液、出液、定时摇动和废液回收等步骤,无人值守,让实验全程自动完成,这将为那些还在使用传统台式水平脱色摇床做CBB染色脱色实验的科研工作者们节省大量时间精力。2.可封闭可定制的染色池:GS-Smart染色池可封闭,既能防止液体溅出溢出、阻隔挥发物质,还可选择并定制各种尺寸。有些科研工作者为实现“快速”CBB染色脱色,习惯将CBB染色液或脱色液加热至沸腾然后进行染色脱色处理,而高温状态的液体会加速挥发甲醇乙酸等化合物,如果此时使用台式水平脱色摇床,无疑具有一定的安全隐患。3.机身与储液瓶一体化设计:该设计属于国际首创,与市场同类产品相比,减少了分散在外的瓶瓶罐罐,从而整机占地面积与普通台式水平脱色摇床相当。不仅节省了实验室空间,同时也美化了整体外观。综上,在CBB染色脱色实验应用方面,鼎昊源GS-Smart小型自动凝胶染色仪无论在功能上、设计上还是外观上均全面领先于台式水平脱色摇床。事实上,GS-Smart从2013年春季发布之初,就定位成了一款为考马斯亮蓝染色脱色实验而生的仪器,她的最终使命是全面取代CBB染色脱色实验中的台式水平脱色摇床,从而让所有CBB染色脱色自动进行!本文关键词:摇床,脱色摇床,水平脱色摇床
自动凝胶染色工作站和传统脱色摇床的操作对比鼎昊源凝胶染色工作站在2012年中推出以来,受到了来自大学院校,科研机构和生物科技公司的广泛关注。在全国各地的高校和科研机构的试用和购买中都取得了良好的结果,包括:中国农科院、辽宁省农科院、江苏省农科院、天津农科院、中科院油料所、中国农业大学、华中农业大学、华南农业大学等多家单位。DHS凝胶染色工作站的设计初衷是自动化完成SDS-PAGE电泳后的硝酸银染色流程,替代在传统脱色摇床上的实验操作。通过微电脑控制的程序,DHS凝胶染色工作站实现了银染过程中无人值守,免除了人工加液、换液、漂洗的时间,大大提高实验室的日常工作效率,同时通过程序化操作提高实验的可重复性。同时明显地降低了和毒性试剂的接触时间,减少对实验人员的身体伤害。试剂在相对封闭的环境中循环,用户也不必担心实验室环境的污染。弥补使用脱色摇床可能带来的潜在担忧。从硬件上来看,工作站采用了独立的共11路进液/排液管路,可靠的避免了试剂的交叉污染,达到了实验后的试剂回收。工作站的染色池振荡方式同摇床,并配有盖子防止显色液挥发。软件方面,简明清晰的操作界面可以让用户自由设定进液管路、排液管路,进液量、摇动时间。当然用户根据正常实验流程设定工作站的程序可以达到实验的预期,但在硝酸银凝胶染色的过程中,显色过程有时不好掌握时间,那么用自动化程序是否如何实现人工干预呢?DHS凝胶染色工作站的染色池采用深色透明材料制成,用户可以在显色过程中直接观察条带,可以在任何步骤中选择终止或跳过进行下一步,避免凝胶染色过度。另外深色的染色槽排除了日光对硝酸银溶液的影响。在我们和用户的实际使用过程中,DHS染色工作站可以轻松胜任各种常见的实验要求。染色效果如下图,与传统脱色摇床染色等效:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/06/201306141601_444952_2267_3.jpg此外,自动凝胶染色工作站的效果在SDS-PAGE上如考染等其他染色方法中也发挥出色。
自今年年中鼎昊源科技有限公司推出GelStainer凝胶自动染色工作站以来,倍受广大用户的关注,为使用户更好的体验其性能及方便之处,我们在全国范围内推出了免费试用活动,包括:中国农科院、辽宁省农科院、江苏省农科院、天津农科院、中科院油料所、中国农业大学、华中农业大学、华南农业大学等多家单位都积极参与了试用并取得了良好的结果。 同时我们在凝胶自动染色工作站的试用过程中得到了更大的收获——即用户给我们提出的宝贵意见和建议,使我们能够不断针对用户需要改进和提高仪器性能,不断追求创新进步,持续研发生产更多更新更好的仪器成为生命科学仪器专业制造商的真正动力。在此我们衷心的感谢参与试用体验的每一位用户!http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/11/201211201009_405438_2267_3.jpg目前,我们的GelStainer凝胶自动染色工作站主要的应用集中在硝酸银染色的凝胶处理,多路独立的进液/排液系统,使染色过程中每种液体的吸入、排出以及回收都能自由掌握。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/11/201211201009_405439_2267_3.jpg加上封闭的染色槽设计,使原本高污染的、高毒性的实验过程变得更加友好,再不用担心实验室被污染,实验人员健康被威胁而烦恼! 都说硝酸银染色的条件不好掌握,最怕显色时出问题,但我们的GelStainer凝胶自动染色工作站深色避光染色槽不仅能使显色得到保护,并且在染色过程中用户可以进行观察,从而实现人工干预。至于染色程序,我们在经过多次的实验后发现,只要实验条件不是特殊类别,即便用仪器标准程序做出的实验结果都是没有问题的。当然这并不意味着凝胶自动染色工作站本身的程序是万能的,还需要对程序进行优化,并可以直接将优化后的程序快速方便地设置保存,随时可以调用。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/11/201211201014_405440_2267_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/11/201211201014_405441_2267_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/11/201211201015_405443_2267_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/11/201211201016_405446_2267_3.jpg 另外,我们为了使用户的染色结果更好的呈现及保存,还推出大面积凝胶扫描系统配合凝胶自动染色工作站使用,效果同样出色(如上图所示)。我们的体验试用活动正在升级中,敬请关注!
http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/11/201311011618_474916_2781427_3.png 北京鼎昊源科技有限公司的自动凝胶染色工作站(DHS GelStainer)已参加“国产好仪器”活动并通过初审。自上市以来,这款产品已经被多家单位采用,如果您使用过此仪器设备或者对其有所了解,欢迎一起聊聊它各方面的情况。您还可以通过投票抽奖、参与调研等方式参与活动,并获得手机电子充值卡。【点击参与活动】【仪器简介】 DHS GelStainer 自动凝胶染色工作站由微电脑控制,可编程自动运行进液、排液、回收及定时摇动等功能。使用简单、功能丰富,为你的凝胶染色实验带来革命性的变化!【性能特点】自动运行,无人值守,解放人力,减少误差,节约成本,保护环境与操作者健康!染色池最大允许40×35cm的超大型凝胶的染色,还可定制染色池。内置三种标准染色方法(DNA银染、蛋白考马斯亮蓝染色和蛋白银染),用户可存储47种染色方法,每种方法最多可有50步执行过程。两路独立蠕动泵,五路独立进液管路、六路独立排液管路。每种试剂可以编程设定进液量试剂可回收到独立试剂瓶中;废液单独存放;过滤装置能保护管路并保护回收试剂的质量染色池摇动时间可编程设定染色池摇动频率可灵活调节试剂及摇动池封闭,减少气味挥发管路可自动清洗【技术参数】 进液试剂瓶数量: 5废液及回收液试剂瓶数量: 6最大进液速度: 1600毫升/分钟摇动幅度: 3.5°摇动频率: 5---15次/分钟可调定时范围: 1秒—99分59秒或持续运行体积 (长×宽×高): 850×490×360mm重量: 30Kg【了解更多此仪器设备的信息】
电泳时胶回收切胶的注意事项: 1. 电泳的buffer和gel都是新制的,切胶的台子清理干净,刀片最好洗净灭菌,总之一句话就是保证切下的带没有外源dna污染。 2. 切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。为了减少胶的体积,可以用相对比较薄的胶来做,只要够点样即可,也可采用薄而宽的梳子来跑胶。 3. 关于防护,在一般有机玻璃后就足够了,戴上防护面具以保护眼睛,如果戴树脂眼镜就可以了。要是非常害怕紫外照射,或者对于胶有特殊要求,例如要求不含EB,可以采用点marker和带刻度的尺子一起照相的方法来确定目的条带在胶上的位置进行切胶。 4. 按照正常程序点marker跑胶,然后切下有marker的胶,EB染色,紫外灯下与带刻度的尺子一起照相。由于要回收的带与marker间的相对位置已知,根据尺子来衡量未染色胶上目的带的位置即可。如果觉得很难判断,可以直接在marker边点少量的样,这样位置就容易确定了。 凝胶成像分析系统的使用和注意事项: 凝胶成像分析系统:可以应用在蛋白电泳凝胶,DNA凝胶,样品进行图象采集并进行定性和定量分析,样品包括:EB、SYBR Green、SYBR Gold、Texas Red、GelStar、Fluoroscecin、 Radiant Red等染色的核酸监测;以及Coomassie Blue、SYPRO Orange、各种染色的蛋白质凝胶如考染等。(或UV,EB和有色及可见样品成像) 使用注意事项: • 注意开机顺序,先开凝胶成像系统,再打开电脑进入软件。 • 紫外凝胶照相时要防止EB 污染仪器,凝胶成像系统的门不能用污染的手套接触,进行软件操作时同样不能被污染的手套接触。凝胶成像仪推荐 • 在使用紫外光源照相的过程中,不可以打开凝胶成像系统前面板。 • 照相后经废胶取出,并用较软的纸擦拭干净。 • 调焦时要轻,动作不要剧烈。 • 环境电压 不稳定 时,请使用稳压电源。使用过程中如遇断电,请及时将仪器电源关闭,直至重新来电。 • 使用时,请先打开仪器的电源开关,再打开电脑开关并打开软件( Quantity One )。 • 保持观测室内环境干燥,及时将遗留在观测板上的水或其他液体檫干(可使用软质纸,一般卷纸即可)。 • 观测用 EB (溴乙锭)染色的凝胶时,注意不要污染仪器表面。千万不要用手直接接触凝胶,或戴着接触过凝胶的手套去接触仪器的门和观测台的把手。 • 使用仪器时,要将门及观测台关紧,否则将无法正常使用紫外灯。 • 尽可能不要将电脑连接到因特网或局域网上,同时在电脑上安装杀毒软件(推荐使用正版软件),做到专机专用。 • 较长时间不用仪器时,请将仪器用防尘罩盖上。 • 为延长灯管的使用寿命,请观测好凝胶后及时关闭光源(仪器自身有 15 分钟的自动保护程序)。 转自上海思伯明仪器设备www.springsci.com.cn
指示剂 核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中 呈紫兰色,在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中,溴酚兰的迁移率分别与1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同.二甲苯青的水溶液呈兰色,它在 1%和1.4%琼脂糖中电泳时,其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似. 指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液.载样缓冲液的作用有①增加样 品密度,使其比重增加,以确保DNA均匀沉入加样孔内.②在电泳中形成肉眼可见的指 示带,可预测核酸电泳的速度和位置.③使样品呈色,使加样操作更方便.染色剂 核酸电泳后,需经染色后才能显现出带型,最常用的是溴化乙锭染色法,其 次是银染色. 溴化乙锭(ethidium bromide,EB)是一种荧光染料,EB分子可嵌入核酸双链的碱基对 之间,在紫外线激发下,发出红色荧光.根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为 0.5ug/ml的EB,有时亦可在电泳后,将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10~15min.琼脂 糖凝胶EB染色,肉眼可见核酸电泳带,其DNA量一般5ng,当溴化乙锭太多,凝胶染 色过深,核酸电泳带看不清时,可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察. 银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物,然后用还原剂如甲醛 使Ag+还原成银颗粒,可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色. 也用于琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后,DNA不宜回收.来源:生命经纬
请教下各位大神,怎么检测凝胶糖果中的死菌含量呢?急!!就是像QQ糖那种,要先融化吗?还是直接取样染色镜检?(问题是,融化是不是会把里面可能存在的活菌也灭了,直接染色镜检又不好固定,也不均匀。。。)
请教下各位大神,怎么检测凝胶糖果中的死菌含量呢?急!!就是像QQ糖那种,要先融化吗?还是直接取样染色镜检?(问题是,融化是不是会把里面可能存在的活菌也灭了,直接染色镜检又不好固定,也不均匀。。。)
http://www.ebiotrade.com/custom/dhsci/130513/images/top.jpg 鼎昊源新一轮全系列自动染色仪意见征集活动开始啦!http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/01/201701191656_647243_2267_3.gifhttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/01/201701191656_647243_2267_3.gif 自去年年中我公司推出GelStainer凝胶银染自动染色仪以来,倍受广大银染用户的关注,为使用户更好的体验其代替手工银染及脱色摇床的先进之处,我们在全国范围内推出了免费试用活动,包括中国农科院、中国农业大学、华中农业大学等多家单位都积极参与了试用并高度认可我们的设计理念——自动化代替人工带来高效与健康。此过程中不少做考染的用户提出虽然考染比银染简单,但也同样费力低效,能否研发一种更经济、更简化、更适合考染的自动染色仪;另一批做Western Blot 的用户又提出能否替代膜转印后复杂的膜杂交处理过程等等,为此我公司最新研发推出两款新机型,形成了我们的全系列银染/考染/印迹膜自动染色仪。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/06/201306261252_447795_2267_3.jpg GelStainer凝胶银染自动染色仪 GS-Smart经济型凝胶自动染色仪 主要用于小面积凝胶及染色工作量较少的实验 尤其适用于考染Blot Stainer印迹膜自动染色仪 主要用于Western Blot膜杂交、 原位杂交等实验 为了感谢新老用户的支持,我们将举行鼎昊源新一轮全系列银染/考染/印迹膜自动染色仪意见征集活动,给正在为传统凝胶银染、考染及印迹膜杂交的繁杂步骤及有害健康而苦恼的用户们提供免费体验的机会,欢迎大家积极参与,在把愉快的体验心得分享给他人的同时,更欢迎针对仪器在凝胶银染、考染及印迹膜杂交应用中,操作及零部件结构提出改进意见和建议。作为厂家,正是广大用户的实际需求和真诚的意见促使我们把产品做精做好! 共同助力中国创造!http://www.ebiotrade.com/custom/dhsci/130513/images/lw-s2.png 还在等什么,快来申请体验吧,凡报名的老师我们将携带仪器上门免费为您做体验实验,体验后真诚邀您参加我们的全系列银染/考染/印迹膜自动染色仪意见征集互动活动,我们将有http://www.ebiotrade.com/custom/dhsci/130513/images/w2.png或http://www.ebiotrade.com/custom/dhsci/130513/images/w3.png奉上哟!!! (具体参与方式请点击此处查看) 参加方式: 新浪微博@昊诺斯或@鼎昊源互动 仪器信息网论坛回帖生物通邮件点击回帖将创意发至我公司邮箱 sales@dhsci.com 发帖内容可涉及以下3方面: 1. 使用全系列银染/考染/印迹膜自动染色仪的体验照片和体验感觉,奖励礼品:计时器或手机座。2. 使用全系列银染/考染/印迹膜自动染色仪得到具体实验的数据和分析结果(含凝胶图片),奖励礼品:U盘or鼎昊源背包。3. 使用全系列银染/考染/印迹膜自动染色仪得到实验结果,并以此发表的文章,将有现金奖励。(SCI文章500元,核心期刊300元) 欢迎垂询北京鼎昊源科技有限公司 注:本活动携DHS“TL2010s中通量组织研磨仪创意征集”活动暨昊诺斯第四届真心英雄大闯关(共三关)第二关活动同期进行! 参与活动即得精美礼品,同时还有机会获得Ipad(真心英雄三关通关)、联想乐pad等大奖哟! 温馨提醒:请经常关注仪器信息网论坛,我们将定期公布送出礼品奖励的通告及参与用户的讨论,欢迎跟帖讨论,为中国创造助力!http://www.ebiotrade.com/custom/dhsci/130513/images/bb2.jpg
我在做一个课题,将糖类用琼脂糖凝胶电泳分离后,染色,再定量。现在的问题是到底用凝胶成像系统准确些,还是用薄层扫描仪效果好些?看国外的文献,用的是一种叫做“光密度计”的设备,国内难以找到。我的老板曾去相关实验室访问,他说对方用的是薄层扫描仪。我在想是否凝胶成像系统会更好些。不知各位高人有无好的建议给我?
关键词:单细胞凝胶电泳目的:为便于各室单细胞凝胶电泳试验结果的可比性背景知识:略原理:在细胞核中,DNA是环状附着在核基质上,细胞裂解过程中,核基质被溶解、抽提,DNA的结构则未发生变化。如果DNA链上存在缺口,则使DNA超螺旋变的松弛,DNA环向外展,同时由于暴露了阴电荷,在电场力的作用下,松动的DNA环向阳极迁移,但是由于这种松动的DNA环一端仍附着于核DNA,其迁移距离受到限制,因此尾长并不总是真实反映链缺口的多少。实际应当依靠尾长与尾部的荧光强度同时来进行分析。主体内容:操作步骤见下文主要参考文献:略操作步骤:1. 分离制备单细胞悬液:(1) 体外培养的细胞株:用胰酶消化,吹打成单细胞悬液(2) 体内脏器细胞:处死动物,取出脏器,于Hanks’液中制备成单个细胞悬液。2. 胶板制备:(1) 取20~50μl于56℃水浴中保温的0.5%普通熔点琼脂糖,铺于磨沙载玻片上,形成底胶。(2) 取100~150μl 0.5%普通熔点琼脂糖加在底胶上,再于其上加盖玻片,4℃冷凝10分钟。(3) 取下盖片,取50~100μl于37℃水浴中保温的1.0%的低熔点琼脂糖与50~100μl细胞悬液(105个细胞/ml)混匀,立即铺片,加上盖玻片,4℃冷凝10分钟。(4) 去掉盖玻片,取70~100μl于37℃水浴中保温的0.5%的低熔点琼脂糖铺片,加盖玻片,4℃冷凝。3. 细胞裂解与电泳:(1) 将制备好的胶板去掉盖玻片后,浸于4℃预冷的细胞裂解液中,4℃裂解1小时。(2) 取出胶板,放入电泳槽中,浸泡在电泳液中解旋20分钟。(3) 4℃电泳20分钟(25V,300mA)。4. 中和与染色:(1) 电泳结束,将胶板浸泡于中和液中,每次15分钟,共中和两次,注意更换中和液。(2) 取出胶板,置于染色架上,滴加5μg/ml的PI,暗处染色20分钟。(3) 蒸馏水脱色15分钟。5. 镜检和分析:(1) 在荧光显微镜下观察,绿光激发吸收滤片590nm。必要时照相记录。(2) 记数观察的细胞,记录彗星细胞出现的频率,用目镜测微尺测头长与全长,计算核DNA迁移距离。* * * * *使用两层凝胶法,经裂解、DNA解旋、电泳和中和得到湿琼脂糖凝胶片。将湿琼脂糖凝胶片置于冰冷无水乙醇中脱水10分钟,后置于空气中自发干燥。每人制备2张琼脂糖凝胶片。全部操作在采血后8小时内完成,操作过程中注意避光。脱水干燥的琼脂糖凝胶片装于含有干燥剂的载片盒中运回实验室。使用50μl 30μM的溴乙锭溶液染色、照相。使用单细胞凝胶电泳软件分析所有照片,每人随机测量100个以上细胞的尾长和olive尾矩,以尾长和olive尾矩的算术均数代表个体DNA损伤情况。
1.原理等电聚焦凝胶电泳是依据蛋白质分子的静电荷或等电点进行分离的技术,等电聚焦中,蛋白质分子在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳。载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧酸,在电场中形成正极为酸性,负极为碱性的连续的pH梯度。蛋白质分子在偏离其等电点的pH条件下带有电荷,因此可以在电场中移动;当蛋白质迁移至其等电点位置时,其静电荷数为零,在电场中不再移动,据此将蛋白质分离。 等电聚焦中,只有在凝胶两端给以高电压时,才能获得较好的蛋白质条带分辨率,这就需要非常有效的凝胶冷却系统(否则会导致烧胶),即凝胶同期周围液体之间的热传递效率要高。由于平板胶热传递能力高,并可方便的同时比较多种蛋白质样品,所以平板胶用在等电聚焦上的居多。由于等电聚焦对蛋白质的电荷差异非常敏感,若要好的重复性,制备蛋白样品时一定要小心,要避免任何对蛋白质化学组成和结构的修饰。另外,蛋白质-脂类、蛋白质-蛋白质相互作用可引起电荷改变,进而导致等电点迁移或纹理现象。除非特殊需要研究蛋白质-蛋白质相互作用或者必须保持蛋白质的生物学功能,等电聚焦通常在含有尿素的变性凝胶系统中进行。使用非离子去垢剂也可以提高分辨率。 2.主要仪器、试剂仪器:微型电泳系统、电源、注射器、固定和染色用容器 试剂:丙稀酰胺、双-丙稀酰胺、载体两性电解质、尿素、过硫酸胺、TEMED、TritonX-100、2-巯基乙醇、溴酚蓝、磷酸、氢氧化钠、氯化钾、三氯乙酸、考马斯亮蓝、甲醇、乙酸。 储存液:1)30%(w/v)丙稀酰胺,1%(w/v)双-丙稀酰胺;2)20%Triton X100;3)10%三氯乙酸;4)1%三氯乙酸;5)1%溴酚蓝;6)考马斯亮蓝染色液;7)考马斯亮蓝脱色液;
单细胞凝胶电泳步骤:1. 分离制备单细胞悬液:(1) 体外培养的细胞株:用胰酶消化,最后用PBS悬浮吹打成单细胞悬液,细胞要计数,具体的量我前边已经说过。(2) 体内脏器细胞:处死动物,取出脏器,于Hanks’液中制备成单个细胞悬液。2. 胶板制备:(1) 取100μl于45℃水浴中保温的0.5%NMA,铺于磨沙载玻片上,形成底胶。盖玻片推匀,不能有气泡,4度凝固5至8分钟。(2) 水平取下盖片,取100μl于37℃水浴中保温的0.5%LMA与20μl细胞悬液(约400个细胞)混匀,立即铺片,加上盖玻片,4度凝固5至8分钟。3. 细胞裂解与电泳:(1) 将制备好的胶板去掉盖玻片后,浸于4℃预冷的细胞裂解液中,在4℃下裂解2.5到3小时。(2) 取出胶板,用双蒸水浸没漂洗后放入电泳槽中,浸泡在4℃预冷的电泳液中解旋20分钟。(3) 玻片水平放置阳极端附近,4℃电泳20到25分钟(25V,300mA)。可在电泳槽周围加冰块以保持低温。4. 中和与染色:(1) 电泳结束,将胶板浸泡于中和液中,每次10分钟,共中和3次,每次要更换中和液。最后晾干。(2) 取出胶板,置于染色缸中,在2μg/ml的EB染色液中,暗处染色5到10分钟。(3) 蒸馏水漂洗2次,每次5分钟。稍晾干,滤纸吸去多余水分,尽快在荧光显微镜下观察。从胶板制备开始到最后都应该在暗光下操作。先讲这些,你们可以先开始摸索,真正做了才能发现具体的问题,到时我们再探讨。
SmartGel一体化凝胶成像仪http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/08/201408261520_511707_2925070_3.jpg产品详细描述性能特点:①完全一体化设计将计算机整合在内,无需另外购买,真正做到拍摄和分析一体化。②占地面积小,宽度仅有32cm,只需狭小空间就可安放。③安装快捷,您只需要将SmartGel从包装箱取出,接上电源,打开开关就可开始使用。④真正的免培训设计,无需工程师上门,自动向导功能让您轻松掌握产品的使用。⑤专利的人机工程学设计让您在使用时保持最舒适的操作视角。⑥全触摸式显示屏可控制拍摄和分析的所有流程,可连接打印机、鼠标和键盘,可通过USB和网络进行各种图形和数据文件的交换。⑦先进的网络教学和远程诊断技术的应用让您后顾无忧。应用领域:可适用于各种紫外和可见光样品的拍摄何分析,包括:①EB、GoldView、SYBR Green等染色的DNA/RNA琼脂糖电泳凝胶;②考马斯亮蓝、银染等染色的蛋白质电泳凝胶;③印迹杂交膜(Southern、Northern、Western、Dot/Slot blot等;④克隆计数、抑菌圈、物体切片测量等样品。http://www.bioon.com.cn/ewebeditor/fckup/2014/7/20140723151422487231.jpg北京赛智创业科技有限公司地址:北京市海淀区清河龙岗路27号1号楼203室电话:010-62991647
脉冲场凝胶电泳以其重复性好、分辨力强而被誉为细菌分子分型技术的“金标准”。它可以用于的分子DNA的分离,其分辨范围可达10Mb。PFGE选用识别稀有酶切位点的限制性内切酶切割基因组DNA,获得的DNA大片段在外加脉冲电场的低浓度琼脂糖凝胶中分离,产生数量有限的DNA条带。其原理是DNA分子在脉冲电场中随着电泳方向的改变不断改变其分子构象,挤过凝胶间隙。小的DNA分子比大的分子重新定向快,在凝胶中移动快,从而使小分子DNA片段与大片段相分离,同时较大的DNA片段也能被有效分离,在凝胶上按染色体片段长度的不同而呈现出电泳带型。
用溴化乙锭(EB)染色DNA,然后用Beckman PACE5000的激光诱导荧光检测,检测到的吸收峰相对于背景吸收很不明显。这主要与哪些因素有关?EB的浓度是多少合适呢。我查到有人用1μg/mL,这与DNA样品的浓度是否有关?如果染料浓度过高,会有什么影响。本人用的凝胶缓冲液为含5%PVP的1×TTE。谢谢,各位帮忙解决!
自今年年中鼎昊源推出GelStainer自动硝酸银染色仪(凝胶自动染色仪)以来,倍受广大用户的关注,为使用户更好的体验其性能及方便之处,鼎昊源在上一期全国范围免费体验活动中,包括:中国农科院、辽宁省农科院、江苏省农科院、中科院遗传所、农科院油料所、中国农业大学、华中农业大学、华南农业大学等多家单位都积极参与了试用并取得了良好的结果。 同时鼎昊源在GelStainer自动硝酸银染色仪的试用过程中得到了更大的收获——即用户给提出的宝贵意见和建议,使鼎昊源能够不断针对用户需要改进和提高仪器性能,不断追求更新更好,更获得了持续研发生产更多更新更好的仪器成为生命科学仪器专业制造商的真正动力。在此鼎昊源衷心的感谢参与试用体验的每一位用户!http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/11/201211291602_408218_2961690_3.jpg 为了感谢新老用户的支持和配合,鼎昊源将举行新一轮自动硝酸银染色仪的免费体验升级活动,同时借助仪器信息网的原创大赛平台,让更多战斗在实验室一线,为担心实验室被污染,实验人员健康被威胁而烦恼的用户们提供免费体验的机会,欢迎大家积极参与,并把愉快的体验心得分享给更多的人。还在等什么,快来申请体验吧,凡报名的老师在活动期间,鼎昊源将携带仪器上门免费为您做体验实验,体验后真诚邀您参加凝胶自动染色仪试用升级--体验分享互动活动,将有http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/11/201211291604_408219_2961690_3.jpg或奖金奉上哟!!! \(^o^)/~参加方式一:仪器信息网上注册,发帖并加入昊诺斯-鼎昊源真心英雄队(发帖时“选择主题”请选择“第五届原创”;“参加原创团队”点“是”,记得选择“昊诺斯-鼎昊源真心英雄队”哟),分享试用心得体会,仪器信息网将奖励100积分;参加方式二:关注并发微博@昊诺斯生物(新浪微博)发帖内容可涉及以下3方面:1、 使用GelStainer自动硝酸银染色仪的体验照片和体验感觉,奖励礼品:计时器或手机座。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/11/201211291604_408220_2961690_3.jpg2、 使用GelStainer自动硝酸银染色仪得到具体实验的数据和分析结果(含凝胶图片),奖励礼品:U盘or鼎昊源背包。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/11/201211291605_408222_2961690_3.jpg3、使用GelStainer自动硝酸银染色仪得到实验结果,并以此发表的文章,将有现金奖励。(SCI文章500元,核心期刊300元)温馨提醒:您发帖后,请您发邮件到sales@dhsci.com或致电010-85584421及时和鼎昊源联系,核实完后将尽快将送出礼品。
1、 溶胀商品凝胶是干燥的颗粒,通常以40~63um的使用最多。凝胶使用前需要在洗脱液中充分溶涨一至数天,如在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温到近沸,则溶涨时间可以缩短到1~2小时。凝胶的溶涨一定要完全,否则会导致色谱柱的不均匀。热溶涨法还可以杀死凝胶中产生的细菌、脱掉凝胶中的气泡。2、 装柱由于凝胶的分离是靠筛分作用,所以凝胶的填充要求很高,必须要使整个填充柱非常均匀,否则必须重填。凝胶在装柱前,可用水浮选法去除凝胶中的单体、粉末及杂质,并可用真空泵抽气排出凝胶中的气泡。最好购买商品中的玻璃或有机玻璃的凝胶空柱,在柱的两端皆有平整的筛网或筛板。将柱垂直固定,加入少量流动相以排除柱中底端的气泡,在加入一些流动相于柱中约1/4的高度。柱顶部连接一个漏斗,颈直径约为柱颈的一半,然后在搅拌下、缓慢的、均匀地、连续地加入已经脱气的凝胶悬浮液,同时打开色谱柱的毛细管出口,维持适当的流速,凝胶颗粒将逐层水平式上升,在柱中均匀地沉积,直到所需高度位置。最后拆除漏斗,用较小的滤纸片轻轻盖住凝胶床的表面,再用大量洗脱剂将凝胶床洗涤一段时间。3、 柱均匀性检查凝胶色谱的分离效果主要决定于色谱柱装填得是否均匀,在对样品进行分离之前,对色谱柱必须进行是否均匀的检查。由于凝胶在色谱柱中是半透明的,检查方法可在柱旁放一至于柱平行的日光灯,用肉眼观察柱内是否有“纹路”或气泡。也可向色谱柱内加入有色大分子等,加入物质的分子量应在凝胶柱的分离范围,如果观察到柱内谱带窄、均匀、平整,即说明色谱柱性能良好;如果色带出现不规则、杂乱、很宽时必须重新装填凝胶柱。4、 上样凝胶柱装好后,一定要对柱用流动相进行很好的平衡处理,才能上样。凝胶柱的上样也是一个非常重要的因素,总的原则是要使样品柱塞尽量的窄和平整。为了防止样品中的一些沉淀物污染色谱柱,一般在上柱前将样品过滤或离心。样品溶液的浓度应该尽可能的大一些,但如果样品的溶解度与温度有关时,必须将样品适当稀释,并使样品温度与色谱柱的温度一致。当一切都准备好后,这时可打开色谱柱的活塞,让流动相与凝胶床刚好平行,关闭出口。用滴管吸取样品溶液沿柱壁轻轻地加入到色谱柱中,打开流出口,使样品液渗入凝胶床内。当样品液面恰与凝胶床表面平时,再次加入少量的洗脱剂冲洗管壁。重复上述操作及此,每一次的关键是既要使样品恰好全部渗入凝胶床,又不致使凝胶床面干燥而发生裂缝。随后可慢慢地逐步加大洗脱剂的量进行洗脱。整个过程一定要仔细,避免破坏凝胶柱的床层。
对于广大实验科研工作者来说大家在做PCR凝胶成像实验时应注意以下几个问题: 1.EB染料的安全使用EB(Ethidium bromide):即溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂,广泛用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的核酸大分子。在302nm 紫外光激发下溴化乙锭能够放射出橙红色荧光信号,用Polaroid 底片或有CCD 成像头的凝胶成像处理系统可以捕捉拍摄这种信号。因此EB染料广泛用于分子生物学实验。但目前认为EB染料是一种强诱变剂,具有高致癌性。因此在实验过程中一定要注意安全。实验结束后要对EB染料净化处理,以免危害人身安全及污染环境。对于含有EB染料的溶液可做如下处理:EB含量超过0.5mg/ml:首先用水将其浓度稀释至0.5mg/ml以下;然后加入一倍体积的0.5mol/L KMnO4,混匀,再加入等量的25mol/L HCl,混匀,置室温下数小时;最后加入一倍体积的2.5mol/L NaOH,混匀并废弃。EB含量小于0.5mg/ml:首先按1mg/ml的量加入活性炭,轻摇混匀后置室温下1小时;然后用滤纸过滤溶液,并将活性碳与滤纸密封废弃。2.对于紫外线的防护虽然适量紫外线对人体具有一定的保健作用,但对于科学工作者来说往往要接触大量的紫外辐射,因此正确的防护尤为重要。过量过强紫外线作用于皮肤时,易引起皮肤出现红斑,水疱甚至水肿,严重的还可引起皮肤癌等。作用于眼睛可引起眼痛,流泪等进而引起各种炎症反应,严重的还可能诱发白内障。过量强紫外线作用于中枢神经系统,可引发头痛、头晕、体温升高等不适症状。
求问各位有没有用二甲苯胺蓝染色液染色过酵母,有没有镜检图片。我这怀疑是酵母,所以染色了,图如下。[img=,375,500]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907031350457583_2773_1795523_3.jpg!w375x500.jpg[/img]
第一节 概 述一. DNA的限制性内切酶酶切分析限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA,而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用,它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后,用等体积酚/氯仿抽提,加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇,混匀后置-70℃低温冰箱30分钟,离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱,它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成,以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中,建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节,近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶,通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。在酶切图谱制作过程中,为了获得条带清晰的电泳图谱,一般DNA用量约为0.5-1μg。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶,消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。二. 凝胶电泳琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速,可以分辨用其它方法(如密度梯度离心法)所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:1、DNA的分子大小:线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比,分子越大则所受阻力越大,也越难于在凝胶孔隙中蠕行,因而迁移得越慢。2、琼脂糖浓度一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。
脉冲场凝胶电泳1)高分子量DNA琼脂糖凝胶块制备和加工1.收集10ml全血,加入30ml细胞裂解液。置冰浴中至少20min直至红细胞完全溶解。2.2000r/min离心10min,移去红色上清液,再次用细胞裂解液洗涤细胞,然后用PBS重悬细胞。3.稀释单细胞悬液并取一小份用Neubauer腔计数细胞。4.用PBS重悬细胞,以达到40μl PBS中含1百万个细胞比例(1百万个二倍体哺乳动物大约含有基因组DNA 10μg)5.用PBS配制2%浓度低熔点琼脂糖溶液并保持在50℃。6.将等体积(各1ml)细胞悬液与琼脂糖溶液于室温下混匀,立即倒入凝胶块模具中。7.静置20min让琼脂糖固化,用无菌塑料杯(通常用作划菌)将凝胶块自模具中取出并置入蛋白酶缓冲液中,加入2mg/ml的蛋白酶K。8.将带有凝胶块的蛋白酶K缓冲液于50℃保持2~3天。每个盛有50ml蛋白酶缓冲液的Falcon管可容纳多达100个凝胶块。9.蛋白酶K消化后,可将凝胶块保留在此缓冲液或0.5mol/L EDTA溶液中保存于4℃。10. 此外,继续将凝胶块用高压消毒过的TE缓冲液冲洗数遍的步骤。11. 将凝胶块放入装有TE及0.04mg/ml PMSF溶液的Falcon试管中,灭活残留的蛋白酶K。12. 室温下用TE溶液漂洗凝胶块数次,将凝胶块放入另一干净的试管,可直接用于酶切反应或用0.5mol/L EDTA,(pH8.0)4℃保存凝胶块。13. 若用EDTA保存凝胶块,取出后应用TE溶液室温下漂洗30 min×2次。2)大小标准物的制备 l λ多联体1.以TE缓冲液悬浮λ多联体(Boehringer MA宝灵曼公司产品),浓度为4μg/40μl。2.用等体积TE配制的2%低熔点琼脂糖(温度保持在45℃)混匀。3.移去混合液注入预冷的凝胶块模具中。4.室温下用TE及100 mmol/L NaCl溶液温育2天。l 酵母染色体1.从YPD(酵母提取物,蛋白胨和葡萄糖)培养基瓶皿中挑选单一克隆加入10ml YPD预培养的肉汤中,30℃下剧烈震荡生长24小时,然后加入200ml YPD肉汤,剧烈振荡24~48h(产量大约100块)。2.4000×g转速,离心10min,然后用50mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液悬浮。3.仍以4000×g转速离心10min,再用SCE[1 mol/L 山梨醇,0.1mol/L枸椽酸钠,pH5.8及10 mmol/L EDTA (pH7.5)]溶液重悬。4.取稀释后的细胞悬液用Neubauer腔计数。5.溶液短暂离心后,再用SCE重悬细胞,使40μl SCE溶液中含5×107个细胞(相当于80μl体积的模块中含有5×107个细胞)。6.溶液与0.1mg/ml酵母扣糖酶100T和100mmol/Lβ-巯基乙醇混匀,37℃保温15~30min。7.细胞悬液与等体积的SCE配制的2%低熔点琼脂糖凝胶混匀,保持在50℃。8.将混合物移注入预冷的凝胶块模具中。9.凝胶块用含10 mmol/L二硫苏糖醇的SCE溶液37℃下振荡温育1~2小时。10. 将凝胶块移入蛋白酶缓冲液中,加入2mg/ml蛋白酶K,50℃温育48h。11. 用50 mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液洗涤凝胶块3次,每次20min。12. 凝胶块可用此混合液于4℃保存或不用漂洗直接装载入凝胶中。3)琼脂糖凝胶块中DNA的限制性内切酶消化1.应使用消毒溶液及戴无菌手套以免DNA降解。2.在Falcon试管中用1×TE溶液漂洗凝胶块20min 3次,以去除EDTA。3.混合:酶反应缓冲液(高、中或低盐缓冲液),100 mmol/L亚精胺(只用于高盐缓冲液状态),10~20单位的内切酶。20单位的内切酶就足以过夜完全消化10μg DNA。4.设立一个除内切酶成分外含有混合物各组分的阴性对照,以检查是否有非特异性DNA降解。5.将琼脂糖凝胶块加入反应混合溶液中:通常用消毒过的手术刀或套环将凝胶块移入。6.若两种内切酶所需缓冲液条件一致,可以同时或先后用两种不同的酶进行消化(先用低盐缓冲液的酶消化,再调整盐浓度)。倘若首次消化的酶要求50℃条件,在第二个酶消化时要换缓冲液。7.若要进行部分消化,则首先在同一温度和反应时间用1:10稀释的酶进行尝试。4)凝胶电泳1.将0.8%的琼脂糖在0.25×TBE中熔化后冷却至50~60℃,立即注入凝胶框架中,并插入梳子。2.凝胶固化后小心地拔出齿梳,用2把无菌手术刀将DNA凝胶块上样。若用不同内切酶消化凝胶块,则取不同样品时应将手术刀片烧灼后冷却。将DNA大小标志物上样至凝胶的两旁。3.用1%液态低熔点琼脂糖凝胶(0.25×TBE配制)密封狭槽。4.若有气泡存在,用注射器驱赶气泡。5.一旦密封的低熔点琼脂糖已固化(大约10min),可将凝胶搁入腔室,并用电泳缓冲液覆盖过胶面。6.应设定合适的电压及转换时间(参考《分子医学技术》84页表8.1)并开始电泳。两个不同电泳方向的电流应相等。7.电泳结束后,凝胶用0.25×TBE配制成的EB(0.4μg/ml)染色。8.用泵自槽中排除缓冲液,续以双蒸水冲洗电泳槽。9.凝胶成像:DNA在曝光的过程中可能会形成缺口。10. 用0.25mol/L HCl漂洗凝胶30min,让DNA脱嘌呤,并有利于转移。11. 凝胶用碱(变性溶液中)变性20min,两次,续以中性溶液1~5min。12. 采用标准Southern印迹方案将DNA转印至尼龙膜上。一般来说,印迹PFGE凝胶的时间较普通凝胶印迹时间长(约48h)。
Difference Gel Electrophoresis (DIGE)即差异凝胶电泳是目前2D领域相当热门的一项技术,可以说它的出现消除了传统双向的一些弊端,使得好多实验室对双向重拾信心http://img.dxycdn.com/images_new/smiles/smile_tongue.gif 先简要介绍一下DIGE技术的历史和路线。DIGE技术最早在1997年由Jon Minden实验室提出,后来Amresham成为此项技术的主要推动者,其技术路线是将样品在电泳前标记Cy2、Cy3 和Cy5 这3 种荧光染料(其中Cy2 作为用Cy3、Cy5 标记的蛋白质内标, 用以比较数据库中各个胶之间的蛋白质的量的差异),然后将标记后的3 种样品混合, 同时在一块胶上进行电泳。所得到的2D 胶图像可使用3 种不同的激发P发射过滤器得到不同颜色荧光信号,根据这些信号的比例来判断样品之间蛋白质的差异,这样可避免在匹配时出现的误差,进行定量分析时也不依赖于胶与胶之间的重复性。用于标记的荧光基团在化学结构上相似,分子量也基本相同,都带有正电荷,所以在与赖氨酸残基反应时,保证了所有的样品可以移至相同的位置。该方法的灵敏度可与银染和SYPRO Ruby 相媲美,可以检测到100~200pg 的蛋白质,线形动态范围在5个数量级左右。该方法也提高了定量上的准确性。由于实验方法本身造成的蛋白质斑点强度的差异,比如样品在进入胶条时会有一些样品损失,但在同一块差异凝胶电泳胶上就不会出现这样的差异。DIGE 可在同一次检测中通过分析单一胶上的相互覆盖的信息来得到蛋白质的信息,可以同时在一块胶上在相同电泳条件下分离2~3 个样品,大大减少了一个实验需要的胶的总数。虽然从理论上来说,该方法非常诱人, 但DIGE 本身还有很多技术上的问题。主要的问题在于:1) 只有当约1 %~2 %的蛋白质的赖氨酸残基在荧光标记时修饰,才可以维持被标记的蛋白在电泳时的溶解性;2) 在DIGE 染色中丢失的蛋白质基本确定为样品中的低丰度蛋白; 3) 虽然经染色后在电荷上未发生变化,被染料标记的蛋白质比未标记的蛋白质点向大分子方向有轻微迁移,主要是由于荧光团的加入(500Da左右)使得在标记的和未标记蛋白之间产生95%的误差, 之后在质谱分析时产生更多的复杂问题。4) 另一个值得注意的影响灵敏度的问题是荧光物质在激发P发射过程中会出现信号的相互干扰,引发Cy3 的激发波长有时可引起Cy5 标记的蛋白发射。(以上内容部分摘自国外医学卫生学分册2004年第31卷第1期姜楠文章)
同样是电泳,但是DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖电泳在操作上有很大的区别。相比之下,琼脂糖凝胶操作简单很多,只需要准备好制胶槽和梳子,融好胶后加一点核酸染料后,倒入制胶槽,然后点样,电泳,即可显示,时间大概在1个小时左右就可以了。而DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳,先要洗板子,然后用乙醇擦板子,用硅化剂和反硅化剂擦,再制胶,然后预电泳,期间要插梳子,缓冲液热了后,点样电泳,电泳完后,下板子染色15分钟,最后显色。这一系列步骤听下来都有些复杂,所以有必要把该方法整理下来,标注好实验关键点。以下自己对聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验总结,虽然步骤大体上和其他网上搜的一致,但是不同实验室甚至个人对于一个实验操作都会有不同,所以我把自己的拿出来和大家一起分享,重点在于一些小细节操作。一 聚丙烯酰胺凝胶的制备根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积,配制聚丙烯酰胺凝胶.1玻璃板清洗:NaOH溶液浸泡玻璃板一定时间,想要快的话可以用开水浸泡,将剥离板上的胶铲除,用去污剂(洗洁精也可)和清水清洗干净,最后用双蒸水冲洗两遍,垂直放置,晾干(清洗短长板的工具要分开)。2 用滤纸蘸取95%乙醇擦拭长短板,5分钟待乙醇挥发后。分别用脱脂棉蘸取硅化剂和反硅化剂均匀擦拭长短板。2.固定玻璃板:5分钟之后,把两个封条分别置于长板处理面两侧,短板处理面向下盖到长板上,两侧用夹子固定,准备好梳子,调整板子的平衡,使板子和台面保持水平。3配制胶溶液(5%): 原胶: 8.34ml;尿素: 45ml; 5xTBE:15ml;双蒸水:6.66ml; 尿素在室温难溶解,这一部分胶先配好在55℃水浴中预热,溶解完后过滤,制胶时再加入TEMED: 30ul;过硫酸铵: 200ul4灌胶:缓缓地使胶溶液倒入两板间,等胶溶液布满整个板子时,倒插梳子,用夹子夹紧使梳子和玻璃博间没有缝隙从而防止点样时串样,整个过程不要产生气泡。5.凝固:灌完胶后,放于室温让其自然凝固,观察胶边沿出现折射线就表明胶以凝固。二 聚丙烯酰胺凝胶电泳1.固定玻璃板于电泳仪:取掉玻璃板上的夹子,拔下梳子,除去长板点样处的胶,用清水冲洗干净玻璃板,短板向里固定于电泳仪支架上,即凹口板面向电泳液。2.插梳子:取5xTBE200ml稀释到1000ml制成1xTBE。向电泳仪下端槽内倒1xTBE约500ml,向上槽倒1xTBE,使液面高于短板上沿。用10ml的枪吸打缓冲液吹除插梳子除的废胶,插好梳子,点3ul 上样缓冲液,观察点样孔是否串样,如串样再调试梳子。3 预电泳:打开变压器,调节电压为1800V,功率100W,电流100A,预电泳大约40min至玻璃板热。4 样品变性:12ul体积的样品中加入6ulLoading Buffer,沸水浴5min,迅速放于冰上冷却。5电泳: 吸取3-4ul 变性后的样品,按顺序点样。调节电压为1800V,功率100W,电流80A,电泳大约1h。6 卸玻璃板。电泳完毕,关掉电泳仪,放出缓冲液,取下玻璃板,卸下短板、梳子、封条,只留下长板和上面的胶。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/08/201508042043_559121_3030491_3.jpg三 聚丙烯酰胺凝胶电泳的显色----银染1.洗胶:把长板置于双蒸水中清洗一次。2.染色: 染色液 硝酸银: 1.5g(0.1%);37%甲醇:2.25ml;加双蒸水至1.5L。把长板放在染色液中15分钟。3 洗胶:从染色液中拿出长板后,于双蒸水中清洗一次,该步骤动作要迅速。4.显色:显色液 碳酸钠: 45g(0.03g/ml); 37%甲醛: 2.25ml(0.15%);硫代硫酸钠:300ul(10mg/ml);加双蒸水至1.5L。把清洗干净的胶板置于盛有显色液的塑料盘中显色。显色时间根据条带和背景颜色深浅调整,达到DNA条带清晰的目的。5.终止显色:在水龙头下冲洗板子,防止胶被烧而无法读带。7.干胶:胶板置于室温自然干燥。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/08/201508042043_559120_3030491_3.jpg上图是自己按操作跑的板子,所有的实验操作都需带好手套,口罩,注意实验安全。板子读完后拍照保存,及时泡于NaOH溶液中。对于同一个实验每个实验室在有些步骤上会不同,所以本文也仅限拿出来分享而已。
shim pack Diol-300岛津凝胶柱? 被污染了 是长时间测定蛋白质,柱效低,本来分的开的2峰,现在挤到一块了! 怎么处理~~啊 哪位大吓 说说哈!谢谢
请问一下柠檬酸铅染色的原理是什么?是选择染含羧酸类的物质吗? 酰胺会被染色吗?如果酰胺类高分子材料, 如何进行染色? 是将超薄片浸到柠檬酸铅的溶液中还是熏啥的?时间多长?有高手了解这种制样条件吗?
shim pack Diol-300岛津凝胶柱? 被污染了 怎么处理~~啊 哪位大吓 说说哈!谢谢
分离亲水气单胞菌外毒素的 功能高分子凝胶色谱填料 摘要 由丙烯 酰胺 和甲叉丙烯 酰胺 在水 油悬 液中共 聚得 到聚丙烯 酰胺凝胶 Z S P, 并用 I R、 溶 剂吸收 实验等对合成 的 Z S P的结构进 行了确证 。以商 品葡聚糖凝 胶色谱 S e p h a d d e x — G1 0 0为对 照 , 研究 了 ZS P 一 1 0对 中华鳖致 病的亲水气单 胞菌外毒素蛋 白的分 离性能 , 结果 表明经 S e p h a d e x — G1 0 0和 Z S P一 1 0提纯的外毒素蛋白均保留了生物活 ( 毒) 性 , 纯度高 。 从 S DS — P AGE分析结果 , 可以 认为经提纯的毒素蛋 白是分 子量 为 3 2 KDa的纯品。与 S e p h a d e x — G1 0 0凝胶相 比, 聚丙 烯酰胺凝胶 色谱填料 Z S P一 1 0对 蛋 白质 的回收率更 高, 且成本低廉 , 不易染菌 , 是具有 良好 的应 用前景 的蛋 白 质分离色谱填料。 关键词 : 亲水气 单胞菌外毒素 聚丙烯酰胺凝胶 1 前言 在生物技术制取蛋 白质 的多级纯化过程中, 液相色谱被指定为一个必须步骤 , 这表明操作条件温和、 又具有分子水平分离能力的液相色谱为开创现代生物大分子化学树立了一个里程碑。在液相色谱 中, 无论是哪一种层析方法 , 分离介质 的性能都是分离效果 的首要决定 因素。目前所使用的多糖类蛋白色谱分离存在的普遍存在易染菌、 回收率低 、 成本高等问题 。开发高效的蛋 白分离介质受到国内外学者的广泛关注。蛋白分离层析介质 的发展趋势可以认为是对以天然大分子为母体 的层析介质不断地进行合成工艺改进 , 提高性能 , 使老产品更新换代; 同时大力开发以合成高聚物为骨架 的具有优异性能的新一代产品。 亲水气单胞菌在 自然界尤其在水体环境中分布甚广, 属弧菌科, 能引起人和动物的多种疾病n , 特别是水生动物暴发性传染病 , 此病在我 国东南各地广泛流行 , 尤 以水温较高的夏秋季为剧, 导致水生养殖鱼类大量死亡, 给渔业生产造成重大经济损失 矗 。 亲水气单胞菌在习惯上被认为是条件致病菌 , 随着细菌本身的研究的深入 , 这一认识正在被修正 。已有报道该菌的 O抗原、 菌毛及一些表 面的非特异性粘附因子与该菌的致病性有关“ 。 然而, 更多的报道指出致病侏能产生细胞外毒素 , 而毒素与致病关系密切 ~ 7 。 但是关于毒素的种类和性质诸说不一 , 未有定论。 我们用自制的凝胶色谱介质对 中华鳖致病的亲水气单胞菌素进行了分离。 2 实验部分 2 . 1 菌种 亲水气单胞菌菌株从广东省东莞市某养殖场患病的中华鳖中分离鉴定, 取材选取濒死新 2 . 2 细菌培养 亲水气单胞菌菌株接种合成培养基 中, 摇床培养 3 5 ℃, 1 0 0 r / mi n, 2 4 h。 培养物经 4_ C, 1 O 0 0 0 r / mi n离心 3 0 mi n , 取上清液。 将此上清液对小 白鼠( 体重 1 8 ~2 2 g ) 腹腔进行注射( 剂量为 0 . 4 ml / 只) , 确证其生物活性 。 2 . 3 聚丙烯酰胺凝胶色谱填料 Z S P的合成在 甲 苯 和 三 氯 甲烷 溶 剂 中加 入 少 量Twe e n 一 8 0和 1 9 / 6 聚乙烯醇 , 滴加丙烯酰胺和甲又丙烯酰胺水溶液 , 5 0 V水浴恒温 , 滴加完毕待分散均匀后加入适量过硫酸铵, 待反应完成后 , 撤去水浴 , 体系 自然冷却至室温, 减压抽滤 , 真空干燥 , 筛选出 2 0 0 ~3 0 0目产物备用。 2 . 4 红外分析: 采用布鲁克 EQUI NOX 5 5傅里叶变换红外光谱仪 , 波数范 围为 4 0 0 ~4 0 0 0 c m~, 样品采用 KB r压片法进行测试。 2 . 5 溶剂吸收实验 将干燥至恒重 的 0 . 1 ~0 . 2 g Z S P聚合物凝胶置于一特制的底部带有多孔玻璃砂板的试管中, 在室温下置于溶剂 ( 水) 中浸泡 2 4 h。试管用橡胶盖密封 , 放到一离心管内, 用 2 0 0 0 ~4 0 0 0 r / mi n离心 1 5 mi n除去过量的溶剂 , 将带 有溶胀剂的树脂的试管迅速转移到密闭的烧瓶中称重。溶剂吸收量用 1 g干树脂 吸收的溶剂重 量来表 示 。 2 . 6 毒素的提纯 2 . 6 . 1 硫酸铵盐析 用 Na OH调节细菌培养物上清液至 p H 6 , 再加入硫酸铵至 7 O 的饱和度 , 4 ℃静置 4 h, 1 0 0 0 0 r / mi n, 4 ℃离心 3 0 mi n, 去上清液, 沉淀溶于洗脱缓冲液 中, 对相同缓冲液透析过夜 , 将透析后的样品用 P EG2 0 0 0 0进行浓缩 , 即为粗提毒素。 2 . 6 . 2 S e p h a d e x G一 1 O 0凝胶过滤 将粗提 毒素 于 4 ℃装 S e p h a d e x G1 0 0柱( P h a ma c i a产品, 1 . 6×5 0 c m, 平均液及洗脱液均为 5 0 mmo l / L Tr i s — HC1 , p H 7 . 8 ) , 流速为 1 2 ml / h, 每管收集 4 ml , 用紫外检测仪 2 8 0 n m进 行检测, 合并生物活性部分 , 冻干浓缩。 2 . 6 . 3 Z S P 一 1 0凝胶过滤 将 粗 提 毒 素 于 4 n C装 交 联 度 为 1 O 9 / 5 的Z S P 一 1 0 柱 ( 自制 , 1 . 6 ×5 0 c m, 平衡液及洗脱液 均 为 0 . 2 mo l / I Na Ac — HAc , p H5 . O ) , 流速为1 2 ml /· h, 每管收集 4 ml , 用紫外检测以 2 8 0 n m进行检测 , 合并生物活性部分, 冻干浓缩 。 2 . 7 SDS— PAGE采 用 La e mml i 不 连续 S DS — P AGE系统 , 按常规方法在小型蛋白电泳仪上进行 1 0 0 V恒压电泳约 3 h。 所用分离胶浓度为 1 2 9 / 6 , 浓缩胶浓度为 4 9 / 6 , 用考马斯兰法染色。 2 . 8 小 白鼠毒性试验小 白鼠体重 1 8 ~2 2 g, 每组 2只, 分别腹腔注射 0 . 4 ml 毒素样品。 3 结果与讨论 3 . 1 I R分析 图 1 聚丙烯酰胺凝胶填料的 I R谱图 图 1是 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 渗 透色 谱填 料 而引起的。 3 1 8 8 c m 处的强峰是 N— H伸缩振动Z S P 一 1 0的红外谱图。3 3 9 4 c m 处宽而强的峰是 吸收峰。 2 9 3 2 c m 和 2 7 8 1 c m 处的强峰是 CH 一OH伸缩振动的谱带 , 由样 品中残留水分存在 基团中不对称和对 称 C— H伸缩振动峰。1 4 0 0 c m~, 1 3 0 0 c m~, l l 0 0 c m 和 1 0 0 0 c m。附 近的峰 是 C— N伸缩振动和一 NH变形振动引起的。6 2 7 c m 处的峰是 N— H面外变形吸收峰。 3 . 2 Z S P树脂的吸水率 图 2是 Z S P树脂吸水率一交联度曲线。 很明显, 在交联度为 5 ~2 0 的范围内树脂 的吸水率与交联度成正 比。 由此可推测, 在所合成 的聚合物中交联点的分布是 比较均匀的。 O0 5 .o o% I o. 00 % l 5 . O0 % 2 0. o( 2 5 |t ) 儡 空娃度 图 2 Z S P树脂吸水率一 交联度 曲线 3 . 3 毒素的纯化 粗提毒素经 S e p h a d e x- -Gl O 0凝胶色谱柱 纯化后 回收率为 1 8 . 8 3 , 经交联度为 1 0 的聚 丙 烯 酰 胺 Z S P 一 1 0柱 纯 化 后 回 收 率 为 6 8 . 0 5 , 洗脱液蛋峰分别为图 3和图 4 。 毒素的 S e p h a d e x — G 1 0 0层析 3 . 4 SDS— PAGE 经 S e p h a d e x—G 1 0 0和聚丙 烯酰胺 Z S P一 1 0柱纯化后的毒素进行 S DS — P AGE, 考马斯兰 图 5 S e p h a d e x纯化 S DS — P AGE 行 M: 分子量标准 , 行 A: 粗提毒素 . 行 B: 提纯毒素 1 0天左右即会滋生霉菌, 不能再重复使用。而 Z S P 一 1 0 在 同样的条件下可保存半年。 提纯毒素 经浓缩后注射小 白鼠, 2 4 h后小 白鼠死 亡, 可 以认为两种凝胶色谱柱均保留了外毒素蛋白质 的生物 活性 。 图 6 ZS P 一 1 0纯化 S DS — PAGE 行 M: 分子量标准, 行 A; 粗提毒素 , 行 B : 提纯毒素 结论 1