单细胞基因表达分析

环形RNA是一类在真核细胞中广泛存在的内源性非编码RNA分子，在生物体发育过程中发挥重要作用。之前研究已在不同物种中鉴定出数百万个环形RNA分子，并产生了大量用于揭示生物体组织表达模式的环形RNA数据资源。然而，由于大多数环形RNA表达量较低，传统的转录组测序方法无法表征单个细胞环形RNA表达谱系特征及异质性。近年来，随着单细胞全长转录组测序技术的发展，已可对单个细胞中环形RNA进行捕获测定。尽管效率较低，仍可部分揭示单细胞分辨率下环形RNA的表达模式。因此，单细胞水平的环形RNA表达及功能研究已成为该领域重点关注的问题。 中国科学院北京生命科学研究院研究员赵方庆团队致力于环形RNA方面的研究。6月10日，该团队在《自然-通讯》（Nature Communications）上，发表了题为Exploring the cellular landscape of circular RNAs using full-length single-cell RNA sequencing的研究论文。该研究基于海量单细胞全长转录组测序数据集，实现了单细胞分辨率下环形RNA的高效识别及深度挖掘，基于大规模时空组学数据的整合分析，探索了环形RNA的细胞异质性，揭示了环形RNA作为细胞类型标志物的应用潜力。该研究将目前环形RNA研究从传统组织水平提升至单细胞水平，为探究不同细胞类型中环形RNA的生物学功能提供了重要的数据资源和分析技术。 科研人员收集整理了171个已发表的单细胞全长转录组数据集（图1），包含人和小鼠中58种组织和细胞类型，共计172,137个细胞。同时，研究建立了基于单细胞转录组数据的环形RNA识别和整合分析方法，在人和小鼠中共识别出40,604和131,533个高度可靠的环形RNA分子。基于以上数据所生成的单细胞环形RNA综合表达图谱，为环形RNA的研究提供了有力的数据支持，并为揭示环形RNA在不同细胞类型及发育阶段的动态变化提供了重要资源。 该研究深度剖析了单细胞数据中环形RNA的表达模式，发现它们在不同细胞类型上具有高度特异性。研究对小鼠大脑不同细胞类型中环形RNA的表达的分析表明，抑制性和兴奋性神经元的差异性表达与RNA结合蛋白的表达具有高度相关性。此外，研究观察到胚胎发育不同阶段的特征性环形RNA，阐释了环形RNA从母体来源至合子表达发生的动态转变过程。 进一步地，基于单细胞测序技术可有效的揭示肿瘤发展和转移过程中细胞水平的异质性，研究建立了20名乳腺癌患者的单细胞数据集，分析发现环形RNA在正常和肿瘤细胞的上皮间质转换过程中的表达规律和潜在功能。研究筛选出人和小鼠中细胞类型特异性环形RNA，并验证了其可作为生物标志物在解析肿瘤浸润性免疫细胞中的适用性。最后，研究构建了目前首个单细胞环形RNA数据分析和资源平台——circSC（http://circatlas.biols.ac.cn）（图2），为环形RNA研究奠定了独特而重要的数据和技术基础。 研究工作得到国家杰出青年科学基金、国家自然科学基金基金重点项目和国家重点研发计划的支持。赵方庆团队致力于建立高效的算法模型和实验技术，探索人体微生物与非编码RNA的结构组成与变化规律，解析它们与人类健康和疾病的关系。近年来，相关成果先后发表在Cell（2020）、Gut（2022/2020/2018）、Nature Biotechnology（2021）、Nature Computational Science（2022）、Nature Communications （2022a/2022b/2021/2020/2017/2016）、Genome Biology（2021/2020/2016）、Molecular Biology and Evolution（2022）、ISME J（2019）等上，这些研究丰富了科学家对人体微生物与非编码RNA多样性、结构组成与功能的认识，并为相关数据挖掘及功能机制研究提供了重要方法学工具。 　　论文链接 图1.基于单细胞全长转录组的环形RNA识别和整合分析 图2.环形RNA单细胞表达图谱及数据平台——circSC 精彩会议预告：点击图片免费报名参加“第五届基因测序网络大会”

近日，中国科学院北京基因组研究所（国家生物信息中心）国家基因组科学数据中心开发的癌症单细胞表达图谱数据库CancerSCEM上线。该研究成果以CancerSCEM: a database of single-cell expression map across various human cancers为题在国际学术期刊Nucleic Acid Research在线发表。　　单细胞分辨率的全转录组测序技术（scRNA-seq）具有研究细胞异质性的显著优势，已成为研究肿瘤微环境、癌症发病机制、转移与侵袭以及各类癌症治疗与诊断不可或缺的手段。截至2021年11月，PubMed已有超过1300个癌症相关的单细胞转录组学研究，极大提升了人们对人类癌症发生发展的理解，推动了癌症临床诊断与治疗的进程。大规模癌症scRNA-seq数据在过去十年中呈现爆炸式增长，迫切需要对这些数据进行规范化整合与处理，对各类癌症的肿瘤微环境进行深入挖掘与比较分析。为应对这一需求，该研究团队开发了CancerSCEM数据库。　　CancerSCEM 1.0版本整合分析了208个癌症scRNA-seq数据集，涵盖肺腺癌（LUAD）、结肠直肠癌（CRC）、恶性胶质瘤（GBM）等在内的20种人类癌症类型。通过标准化分析流程处理，获得了精确的细胞类型注释信息。在此基础上，团队还开展了一系列附加分析，包括不同细胞类型间基因差异表达分析（可为新型标志物筛选提供参考）、细胞表面受体-配体基因对表达谱、样本内细胞互作网络构建等，可为用户提供更加丰富的肿瘤微环境相关信息，并开展了基于TCGA表达数据与临床信息的生存分析。　　数据库为用户提供浏览、多重检索、在线分析及下载等服务功能，用户可采用首页快速检索、词云及精确检索等途径查询感兴趣的癌症单细胞数据集或样本。如点击词云里的基因名“HLA-A”或通过搜索框输入，均可触发数据库查询功能，并实时获得目标基因的详细信息及其在单细胞层面与细胞群体（组织）层面的表达分布信息。为方便临床相关用户的使用，团队共审编获得36个常用免疫检查点分子（如PDCD1、CTLA4、LAG3、HMGB1），并提供专门的搜索列表，以帮助各类癌症的临床免疫治疗研究寻找更优的治疗靶点。　　数据库还配备了一个交互式综合在线分析平台，共集成2个分析模块与7个分析功能。通过基因分析模块，用户可开展4个方面的实时分析及可视化展示：样本内目标基因的整体表达概况；样本内基因在不同细胞类型间的表达比较；基因表达相关性计算及筛选；208个样本中单细胞或bulk层面的基因表达比较。通过样本分析模块，用户可进行样本间细胞组成比较、样本内细胞互作网络构建以及基于TCGA的生存分析。该分析平台将为用户开展个性化的癌症scRNA-seq数据挖掘提供友好的增值服务。　　该研究工作得到中科院战略性先导科技专项、国家自然科学基金、国家重点研发计划等项目资助。　　论文链接

DNA不仅可以按其序列编码信息，也可以按其形状编码信息。人类基因组被分割成由染色质纤维折叠成动态的层次结构组成的染色体。这种空间结构（包括许多染色质环）可以将远端元件拉近，并将转录活动组织到不同的区域，从而限制了DNA的调控和转录机制。而在癌症中，这种染色质环境则发生了深远的改变【1】。近年来，编码癌基因的环状染色体外DNA（ecDNA）被证明在癌症中广泛存在，是癌症基因组的普遍特征，也是人类癌症进展的有力驱动因素。ecDNA是共价闭合双链，不同于在健康体细胞组织中发现的千碱基大小的环状DNA，其大小从100千碱基到数兆碱基不等，且被高度扩增【1】。ecDNA缺乏着丝粒，并且在每次细胞分裂后随机分布在子细胞中，使得其可以快速积累，且可以选择具有耐药性或其他适应性优势的ecDNA变体【2】。ecDNAs可以重新整合到染色体中，因此也可能作为某些染色体扩增的前体【3】。ecDNA具有更高的染色质可及性而缺乏更高的染色质致密性，且包含内源性致癌基因增强子元件，这表明癌基因扩增子可能是通过调控依赖性来扩增转录的【1,4】。值得一提的是，ecDNA存在于正常染色体环境之外，但其在细胞核中的空间组织尚不清楚。此外，ecDNA可以在细胞分裂期间或DNA损伤后聚集，但此生物学后果也尚不清楚。2021年11月24日，来自美国斯坦福大学的Howard Y. Chang团队在Nature上在线发表题为 EcDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression 的文章，研究了致癌ecDNA的空间、表观遗传学和转录动力学，揭示了由聚集在间期细胞细胞核中的约10-100个ecDNA组成的ecDNA“中心”，可以驱动分子间增强子信号以促使癌基因表达扩增，从而作为癌基因协同转录的组合增强子平台。研究人员利用DNA荧光原位杂交（FISH）技术，使用靶向多个细胞系中的ecDNA扩增的癌基因的探针来观察间期细胞核中ecDNA的定位，包括前列腺癌细胞系PC3（MYC扩增）、结直肠癌细胞系COLO320-DM（MYC扩增）、多形性成胶质细胞瘤细胞系HK359（EGFR扩增）和胃癌细胞系SNU16（MYC和FGFR2扩增）。结果显示，在进行实验的所有ecDNA阳性癌细胞中，尽管有数十到数百个单独的ecDNA分子，这些ecDNA的DNA FISH信号在很大程度上都局限于间期细胞细胞核的特定区域，由此表明ecDNA彼此发生了强烈聚集，该特征被称为ecDNA“中心”。这些ecDNA“中心”所占据的空间比相同大小的相邻染色体片段大得多，提示它们由许多紧密聚集在该空间中的ecDNA分子组成。进一步实验发现，ecDNA的聚集可以发生在具有不同癌基因扩增的各种癌症类型和原发性肿瘤中。随后，研究人员通过联合DNA和新生RNA FISH，在PC3和COLO320-DM细胞系中观察MYC等位基因的活跃转录，并计算每个ecDNA分子的MYC转录概率。结果显示，大多数新生的MYC mRNA转录本来自ecDNA“中心”，而不是来自染色体位点。ecDNA“中心”上致癌基因的转录活性明显高于染色体位点，表明当同一细胞中有更多的ecDNA拷贝时，每个ecDNA分子转录癌基因的可能性更大，尤其是以ecDNA“中心”的形式。人类染色体8q24上的MYC癌基因是癌症中体细胞DNA重排的热点，在人类癌症中近30%的MYC扩增以ecDNA的形式存在，通常包含MYC和PVT1（浆细胞瘤变体转录本1，位于MYC 3’端55kb处，是人类癌症的常发断点）的5’端部分。MYC的两侧是超级增强子，以赖氨酸27处的组蛋白H3乙酰化（H3K27ac）和BET蛋白（如BRD4）为标记，MYC转录对抑制剂JQ1置换BET蛋白高度敏感。为了检测活细胞中的MYC ecDNA，研究人员在COLO320-DM细胞中的MYC ecDNA中插入Tet-operator (TetO)阵列，并用TetR-eGFP或TetR-eGFP（A206K）标记ecDNA，以最小化GFP二聚化。实验结果显示，JQ1能有效降低COLO320-DM细胞（含MYC ecDNA）中MYC mRNA的水平，但对COLO320-HSR细胞（染色体MYC扩增子或均匀染色区）中MYC mRNA的水平没有显著影响（注：这两种细胞来自同一患者肿瘤，除了MYC扩增的背景外，具有高度相似的遗传背景）。此外，TetO-GFP COLO320-DM细胞的活细胞成像显示ecDNA“中心”在有丝分裂期间分解成更小的颗粒，之后又重新形成大的“中心”。值得注意的是，有丝分裂后的ecDNA“中心”的组装会被JQ1阻断。这些结果表明，COLO320-DM细胞中ecDNA“中心”的形成、维持和癌基因转录对BET蛋白的溴域H3K27ac相互作用具有独特的依赖性。为了将ecDNA结构与MYC转录调控联系起来，研究人员使用五种正交方法重建了COLO320-DM ecDNA，报告了迄今为止组装的最大的ecDNA结构——一个4.328 Mb的ecDNA，包含PVT1-MYC融合、标准MYC序列和来自多个染色体起源的序列（染色体6、8、13和16）的多个拷贝，并且利用DNA FISH验证了PLUT、PCAT1和MYC基因在重建预测的ecDNA上的共定位。接下来，研究人员确定了与癌基因高表达相关的ecDNA调控元件。来自72,049个COLO320-DM和COLO320-HSR细胞的配对单细胞ATAC–seq和RNA-seq确定了47个与高MYC表达相关的ecDNA调控元件，而目前驱动ecDNA上MYC癌基因表达的PVT1启动子（PVT1p），在ecDNA“中心”内接受了广泛的组合增强子输入。进一步地实验表明，分子间增强子-启动子在ecDNA“中心”激活，同时研究人员证实PVT1p作为一种DNA元件，能够反式激活ecDNA“中心”。那么分子间增强子-基因的相互作用是否可以被精确定位和干扰呢？以SNU16细胞系（它包含两种不同的ecDNA类型：一种来自8号和11号染色体的MYC扩增子和一种来自10号染色体的FGFR2扩增子）为研究对象，实验结果表明FGFR2和MYC ecDNA是共同选择的，因此这两个扩增子上的增强子可协同激活MYC表达。然后，MYC蛋白又可以反过来激活FGFR2的表达。顺式和反式调控元件之间几乎没有重叠，这也证实分子间增强子元件是直接通过反式而非下游效应修改基因表达。而进一步评估独立癌症类型中的分子间ecDNA的相互作用显示ecDNA“中心”内的分子间增强子基因激活发生在不同的癌基因位点和多种癌症类型中。综上所述，ecDNA“中心”内ecDNA的局部聚集促进了新的分子间增强子-基因相互作用和癌基因过度表达（图1）。与偏向局部顺式调控元件并跨越100-300nm的染色体转录中心不同，ecDNA“中心”可以跨越1000 nm以上，且涉及位于不同ecDNA分子上的反式调控元件。毫无疑问，这一发现对于ecDNA如何进行选择以及ecDNA上癌基因调控的重组如何促进转录具有深远的意义。同时，对于ecDNA“中心”促进癌基因转录的认识为癌症治疗提供新的潜在机会。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-021-04116-8

p　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "什么叫做单细胞基因测序(Single-Cell Sequencing)?/span/pp　　一句话说，就是单个细胞水平上对基因组进行测序。2013年，自然杂志把年度技术授予了单细胞a title="" href="http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S01-T000-3-1-1.html" target="_self"span style="color: rgb(255, 0, 0) "基因测序/span/a(Single Cell Sequencing)，认为该技术将改变a title="" href="http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S01-T000-3-1-1.html" target="_self"span style="color: rgb(255, 0, 0) "生物界和医学界/span/a的许多领域。/pp　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "我们为什么要进行单细胞基因测序?/span/pp　　传统的测序方法，无论是基因芯片或者二代基因测序技术(Next Generation Sequencing，NGS)都需要从超过10万个细胞中提取一大堆(bulk)DNA或者RNA，而提供的信息是一大堆细胞的平均值。但是传统的方法，对于理解人体细胞的多样性有着明显的局限性。/pp　　在人体的每一个组织中，比如说，肾脏组织，拥有着大量不同的细胞类型，每一种细胞类型有着独特的起源和功能。每一个细胞的谱系和发展的状态又决定了每个细胞如何和周围的细胞和环境如何反应，把基因测序应用到单个细胞层面，对于我们理解细胞的起源，功能，变异等有着至关重要的作用。/pp　　关于二代基因测序已经详细在我们的前期两篇深度报告中进行了介绍，在本篇报告中，我们将详细解读单细胞基因测序，以及该技术对癌症，辅助生殖以及免疫学等领域带来的新的突破。/pp　　strong一、单细胞基因测序行业：刚启程，面临引爆点/strong/pp　　BCC Research的一项分析报告指出，2014年全球单细胞分析(Single-cell Analysis)的市场达5.4亿美金，预测将从2015年的6.3亿美金增长到2020年的16亿美金，复合增长率达21%。根据GENReports的报告，关于单细胞分析的文章发表在过去的几年也有着爆发性的增长。/pp style="text-align: center "　　图2：单细胞分析的文章发表数量/pp style="text-align: center "img title="1.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/006c9fd7-a2cd-46b2-a028-18b51b5ea3cd.jpg"//pp style="text-align: center "　　资料来源：GEN，民生证券研究院/pp　　其中，传统的单细胞基因组学主要是由基因芯片和PCR主导的，随着二代基因测序的成本以超摩尔定律下降，目前单细胞基因组学逐渐由二代基因测序技术接棒。/pp　　和qPCR在90年代的发展一样，目前所有的刺激因素(高度的科研兴趣，生物医药巨头公司的关注等)正在解锁这个市场，单细胞基因测序行业正面临引爆点。/pp　strong　二、单细胞基因测序的基本流程：单细胞分离--基因组扩增--测序和分析/strong/pp　　单细胞测序，简单地说，主要经过如下的步骤：单细胞的分离--DNA/RNA的提取和扩增(全基因组扩增和全转录组扩增)---测序以及后续的分析和应用。/pp style="text-align: center "　　图3：单细胞测序的步骤/pp style="text-align: center "img title="2.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/782ee757-3c06-4a1b-9103-4c7336ac2929.jpg"//pp style="text-align: center "　　资料来源：Recent advances and current issues in single-cell/pp style="text-align: center "sequencing of tumors，民生证券研究院/pp　　2.1 单细胞的捕捉和分离/pp　　单细胞测序的第一步是单细胞的分离和提取，目前的方法主要有如下几种方法：流式细胞术，激光捕获显微切割技术以及微流控技术。/pp style="text-align: center "　　图4：单细胞分离的三种方式：流式细胞术，激光捕获显微切割以及微流控技术/pp style="text-align: center "img title="3.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/ea66e087-c9b2-4930-a4d3-50025543fe8b.jpg"//pp style="text-align: center "　　资料来源：Technologies for Single-Cell Isolation，民生证券研究院/pp　　1)流式细胞术 (Flow Cytometry)/pp　　是指通过对于悬浮于流体中的细胞或者其他颗粒进行定量分析和分选的技术。在各种流式细胞仪中，大家主要讨论的是荧光活化细胞分类计FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting)系统分离单细胞。定量原理：待测细胞经特异性荧光染料染色后，加入样品管中，经过测量区，由染色后的细胞在激光照射下的荧光产生的电信号来进行定量分析 分选原理：通过流束形成含有细胞的带电液滴来实现的。/pp　　2)激光捕获显微切割技术Laser Capture Microdissection(LCM)/pp　　LCM技术可以在显微镜直视下快速、准确获取所需的单一细胞亚群，甚至单个细胞，从而成功解决了组织中细胞异质性问题。其基本原理是通过一低能红外激光脉冲激活热塑模-乙烯乙酸乙烯酯(EVA)膜，在直视下选择性地将目标细胞或组织碎片粘到该膜上。/pp　　3)微流控技术(Microfluidics)/pp　　微流控技术是一种用于精确控制微量液体的技术。微流控芯片是实施该技术的平台，通常通过细微的管道对液体实施操控，微流控对液体的操控尺度, 刚好适合于单细胞样品的处理操作。/pp　　2.2 全基因组扩增 (Whole Genome Amplification. WGA)/ 全转录组扩增 (Whole Transcriptome Amplification，WTA)：单细胞测序的难点/pp　　2.2.1 主要的三种全基因组扩增技术，各有优势/pp　　由于在单细胞中的DNA和RNA的数量非常小(几个pg)，用传统的测序仪无法检测，所以科学家们必须首先对这些分子进行扩增，同时尽量的减少错误。目前的全基因组扩增技术主要有三种：简并寡核苷酸引物PCR扩增(DOP-PCR)，多重置换扩增(MDA) 和基于多次退火和成环的扩增循环(MALBAC)。/pp　　1)基于PCR技术的全基因组扩增技术，例如DOP-PCR(简并寡核苷酸引物PCR扩增)/pp　　DOP-PCR是一种部分随机引物法, 其引物构成为3& #8242 -ATGTGG-NNNNNN-CCGACTCGAG-5& #8242 ；主要 利用3& #8242 端ATGTGG这6个在人体中分布频率极高的碱基作为引导, 以6个碱基的随机序列来决定特异的扩增起始位点，从而达到扩增整个基因组的目的。/pp　　2)多重置换扩增(MDA)/pp　　MDA是一种等温的链置换扩增反应, 其使用随机的6碱基引物在多位点和模板链结合, 接着利用 phi29DNA 聚合酶很强的模板结合和置换能力实现对全基因组的扩增。/pp style="text-align: center "　　图5：DOP-PCR和MDA全基因组扩增技术简介/pp style="text-align: center "img title="4.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/d9b0aef0-e3b1-4c63-8313-c20796064bb3.jpg"//pp style="text-align: center "　　资料来源：Single-cell genome sequencing: current state/pp style="text-align: center "of the science，民生证券研究院/pp　　3)MALBAC(Multiple annealing and looping-based amplification cycles)基于多次退火和成环的扩增循环/pp　　通过采用特殊引物，使得扩增子的结尾互补而成环，从而达到近乎线性的扩增,该技术是哈佛大学谢晓亮教授团队发明的。/pp style="text-align: center "　　图6：MALBAC全基因组扩增的示意图/pp style="text-align: center "img title="5.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/83e2f828-d990-4b9c-afd6-bd692fc52888.jpg"//pp style="text-align: center "　　资料来源：Single-cell sequencing by Doug Brutlag，民生证券研究院/pp　　表1：三种类型的全基因组扩增方式比较/pp style="text-align: center "img width="600" height="302" title="QQ截图20160302115018.jpg" style="width: 600px height: 302px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/297e4e6e-a134-4101-a297-456cd703c3af.jpg" border="0" vspace="0" hspace="0"//pp style="text-align: center "　　资料来源：Single-Cell Sequencing Technologies: Current and Future，/pp style="text-align: center "民生证券研究院/pp　　Navin 在研究报告中指出(来源：Cancer genomics: one cell at a time)，对于检测CNV(Copy Number Variation)的时候，DOP-PCR以及MALBAC较有优势，另一方面， MDA方法一般用来检测点突变。Gawad et al., (2015)更是指出，三种全基因组扩增技术并没有明显的胜者，具体方法的使用取决于研究的目的。/pp　　2.2.2 全转录组扩增/pp　　一个哺乳动物的单细胞大约含有10pg的RNA，其中mRNA大约在0.1-0.5pg，并不能满足目前测序平台的要求，所以需要进行全转录组扩增技术。/pp　　单细胞中提取的RNA首先经过逆转录出cDNA，然后对逆转录生成的cDNA进行扩增。目前主要的转录组扩增技术主要包括如下几种：传统的PCR，改进的PCR，T7-in vitro 体外转录组扩增以及Phi29聚合酶扩增。/pp　　三. 单细胞测序的主要应用：癌症，辅助生殖以及免疫学领域/pp　　当单细胞被分离，细胞内的DNA/RNA被提取和扩增后，二代基因测序(Next Generation Sequencing)可以用来进行后续的测序。当把基因测序应用于单个细胞层面，在下游应用领域有着先天独到的优势。/pp　　3.1单细胞基因测序技术有助研究癌症起因和治疗/pp　　首先谈一下癌症的异质性：中晚期的肿瘤或由一系列的肿瘤克隆组成，每一种克隆有着独立的变异，形态和药物反应。对于肿瘤克隆精准的诊断非常重要，因为一个占据原发性肿瘤5.1%的亚克隆种群在复发的时候可能成为主要的致病因素。/pp style="text-align: center "　　图7：肿瘤的异质性/pp style="text-align: center "img title="6.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/88b49609-3a47-4577-ad2a-7e9b36b6a4dc.jpg"//pp style="text-align: center "　　资料来源：Illumina，民生证券研究院/pp　　实体瘤由一系列不同的细胞组成，包括癌症纤维细胞，内皮细胞，淋巴细胞，巨噬细胞等。同时，实体瘤由多个肿瘤克隆亚种群构成，使得临床样本的分析更加复杂。当多个肿瘤克隆同时存在时，标准方法检测的要么是平均信号要么是主要的克隆群体(并不一定是最致病的)的信号。/pp　　而同时，肿瘤的异质性和癌症产生抗药性以及转移密切相关，所以，单细胞测序开始用来检测肿瘤内基因异质性，对于癌症起因以及后续治疗的研究非常关键和重要。/pp　　例如，Navin et al.(2011), 利用单细胞基因测序的方法(流式细胞术提取细胞-全基因组扩增-NGS)，在某个乳腺癌肿瘤组织中检测了100个乳腺癌细胞的CNVs，覆盖度大约6%，发现了三种完全不一样的克隆亚种群。/pp　　除了肿瘤细胞，单细胞基因测序同样可以应用于循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells)和外周血播散肿瘤细胞DTC(disseminated tumor cells)，该部分内容将在后续的研究报告中深入讨论。/pp　　3.2 单细胞基因测序助力辅助生殖/pp　　PGS(Pre-implantation Genetic Screening)是胚胎注入前遗传学筛查，主要是通过检测胚胎的23对染色体结构、数目，来分析胚胎是否有遗传物质异常 PGD(Pre-implantation Genetic Diagnosis)，主要用于检测胚胎是否携带遗传缺陷的基因，关于PGS/PGD的介绍，请参考我们之前的行业深度《基因+大数据的颠覆：从癌症基因测序到辅助生殖》。/pp　　PGD过程中，目前主要有三种方式获得活检材料：1)卵子的第一极体和第二极体 2)培养至第3天胚胎卵裂期的卵裂球细胞(一般取1-2个细胞) 3)培养第5天左右的囊胚细胞。/pp　　例如，牛津大学的Dr.Dagan Wells团队，通过对囊胚细胞进行单细胞基因测序，选择健康的胚胎植入。另外，谢晓亮教授团队通过对女方卵细胞极体细胞进行测序，结合胚胎选择，选择正常的胚胎移植。/pp style="text-align: center "　　图8：卵母细胞减数分裂产生极体的过程/pp style="text-align: center "img title="7.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/a1c2724b-0f2c-4b27-9eca-d304dccd613c.jpg"//pp style="text-align: center "　　资料来源：Genome Analyses of Single Human Oocytes，民生证券研究院/pp style="text-align: center "　　(注：其中PB1和PB2是第一极体和第二极体)/pp　　3.3 单细胞基因测序打开免疫报多样性研究之门/pp　　用单细胞基因测序分析免疫细胞的原因是现存的多样的病原体导致了免疫细胞的高度异质性，传统的检测方法，取样来自一大堆细胞，低估了单个免疫细胞的多样性，所以我们需要更加精确检测单个免疫细胞的遗传物质，从而理解机体复杂的免疫机制。正如开篇提到的Juno收购的单细胞基因测序公司AbVitro致力于T细胞和B细胞的基因测序。/pp　　图9展示了对单个T细胞受体基因测序(TCR Sequencing)的流程。TCR & #945 和& #946 mRNA经过逆转录，扩增，重叠延伸，目的基因被选择性地进行PCR扩增以及后续的分析。/pp style="text-align: center "　　图9：TCR Sequencing过程/pp style="text-align: center "img title="8.png" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/04e7c357-80bd-4709-89dc-92ee07a28fa9.jpg"//pp style="text-align: center "　　资料来源：Pairing of T-cell receptor chains via emulsion PCR，/pp style="text-align: center "Illumina，民生证券研究院/pp　　四. 单细胞基因测序未来的发展之路/pp　　在目前来看，单细胞基因测序还处在非常初级的阶段，也面临很多技术的挑战，包括：如何高效的分离细胞，全基因组无偏差的扩增，以及下游的数据分析等。但各大生物医药巨头都已经目光锁定了这个方向，除了今年初Juno收购AbVitro(单个T细胞和B细胞进行基因测序)，去年八月BD公司收购了单细胞测序公司Cellular Research。Illumina也通过和Clontech合作，推出了单细胞RNA测序服务。/pp　　我们认为，未来的基因测序一定朝着更精准，更微观的方向前进，如今，单细胞测序正面临着一场革命，在单个细胞层面让我们在前所未有的水平理解基因组学，表观基因组学和转录组学的多样性。/pp　　背景案例：/pp　　2016年1月，肿瘤免疫疗法的领头羊公司Juno宣布以1.25亿美金的股票和现金收购波士顿的一家单细胞测序公司：AbVitro Inc.。 AbVitro公司的技术起源于哈佛大学George Church的实验室，AbVitro的技术包括对单个T细胞和B细胞进行基因测序，帮助科学家们理解T细胞受体(T cell receptor & #945 和& #946 链的基因的复杂性。/pp　　图：Juno收购AbVitro之后的布局/pp style="text-align: center "img title="9.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/6ef1eca1-dc46-4600-9c6d-d95f77a85f9e.jpg"//p

近年来，单细胞基因组学是十分热门的研究方向，以“三高”著名——高逼格、高门槛、高分文章。此外，对于下游测序公司来说，还存在高利润的优势。单细胞基因组学在免疫学、肿瘤学和神经学研究等各个科学领域发挥着关键作用。2013年，Nature杂志将年度技术授予了单细胞基因测序，认为该技术将改变生物界和医学界的许多领域。单细胞基因组研究主要技术单细胞基因测序主要步骤为：单细胞的分离--DNA/RNA的提取和扩增(全基因组扩增和全转录组扩增)---测序以及后续的分析和应用。其中，单细胞的捕捉和分离是第一步，具有一定挑战性，目前主要包括流式细胞术、激光捕获显微切割技术和微流控技术。全基因组和全转录组扩增是单细胞测序的难点，近几年也取得了较大突破，目前扩增技术已逐渐成熟。全基因组扩增技术主要有：简并寡核苷酸引物PCR扩增(DOP-PCR)，多重置换扩增(MDA)；和基于多次退火和成环的扩增循环(MALBAC)几种技术。全转录组扩增技术，从PCR扩增（SMART-SEQ2等）到IVT扩增（CEL-SEQ2等），到现在的高保真DNA聚合酶扩增（SPLIT-SEQ等）。单细胞测序上游市场及主要供应商由于单细胞基因测序技术的应用前景被广泛看好，多家上游科技企业纷纷投入研发单细胞基因测序产品，2017年以后，更多商业化单细胞测序平台陆续走向市场。目前，国外品牌在单细胞基因组学技术中占主导地位，包括10x Genomics、伯乐、富鲁达、Illumina和凯杰、BD、安捷伦等。2020年，全球单细胞基因组学产品的销售额为5.19亿美元，预计到2025年将以高个位数的年复合增长率增长。富鲁达的 C1平台，是世界上第一个商业化的用于基因组学研究的自动化单细胞样本制备系统。通过采用创新的微流控专利技术，能够快速可靠地分离、处理、并对单细胞进行基因组分析。利用微流控芯片(IFC)，可快速捕获并实现96或800个单细胞的核酸样本制备。一步法完成从捕获、裂解到逆转录和预扩增的过程，进行各类单细胞测序建库。该平台的商业化开始让更多人涉足单细胞测序领域，但该技术成本较高，通量相对较低，目前一些非RNA类单细胞测序仍会采用该技术。Fluidigm C1平台10X Genomics是一家年轻的公司，于2012年成立，2019年9月在美国纳斯达克上市，同年营业收入为2.46亿美元，一开始就专注于单细胞测序。2016年2月10X Genomics推出主要产品Chromium单细胞转录组测序平台，该平台利用微流控、油滴包裹和baecode标记等技术来实现高通量的细胞捕获技术，能够一次性分离、并标记500–10000个单细胞，从而获得每个细胞的3’端的转录组信息。10X Genomics 近两年也多次陷入专利纠纷的官司中，2020年后，其单细胞测序产品 Chromium开始全部使用Next GE微流控芯片。为了解决常规测序系统读长限制所带来的的无法满足组装、结构变异、多态性等问题，10X Genomics推出了GemCode平台，通过条形码信息将Illumina短序列再次连接，获得更有研究价值的长片段信息。10X Genomics还推出了升级版的Chromium系统，在GemCode的基础上整合单细胞测序。每次实验可分析1000至10000个细胞，增加了检测稀有细胞的灵敏度和准确度。10X Genomics Chromium单细胞测序产品BD Rhapsod单细胞捕获系统比10X晚一年推出，2018年3月进入中国市场。BD Rhapsod平台采用分子标签技术，为单细胞中每个转录本标记特异性分子标签，实现单细胞水平上基因表达谱的绝对定量。平台源于Cytoseq蜂窝板技术，采用20万+个微孔（远超过细胞数量，目的就是为了一孔一个细胞），因此可以叫做“微孔捕获”，效率更高。捕获后也是裂解细胞，再进行mRNA抓取。结合Rhapsody特有的单细胞分离技术，单次实验可制备100-10000个单细胞文库，用户可根据需求定制引物，将检测范围集中在目标基因，大幅降低后续测序成本。BD Rhapsody单细胞分析平台2017年1月，Illumina和伯乐在JP摩根健康大会上发布了Illumina Bio-Rad Single-Cell Sequencing Solution。该综合解决方案是单细胞分析的第一个新一代测序(NGS)工作流程。解决方案包括ddSEQ™ Single-Cell Isolator和SureCell™ WTA 3’Library Prep Kit。伯乐最好的液滴分离技术，Droplet Digital™ 技术，可以对单细胞进行隔离和编制条形码，然后在Illumina的许多主要NGS仪器上进行下游测序。全面的工作流程解决方案包括使用BaseSpace Informatics Suite，Illumina的云端基因组学计算环境进行初级和中级数据分析，使用流式细胞分析技术的领先公司FlowJo, LLC所开发的SeqGeq™ 进行高级数据分析和可视化处理。该测序系统可一次性检测8个样本，每个样本可以得到500~10000个细胞，研究单细胞在组织功能、病情进展和治疗反应方面的协同作用。与其他高通量捕获平台相比：Illumina Bio-Rad捕获效率低，仅为3%，但测序成本相对较低。Illumina Bio-Rad Single-Cell Sequencing Solution包括全新的ddSEQ Single-Cell Isolato（与NextSeq 500合照）宝生物（Takara Bio），是一家集试剂、耗材、仪器和服务为一体的生物技术公司，旗下的Clontech品牌拥有单细胞RNA-Seq文库构建的核心专利——SMART技术，由此发展处单细胞全基因组扩增技术、高通量单细胞捕获分选技术等。2015年2月份，宝生物收购的Wafergen公司开发出ICELL8 Single-Cell System单细胞分选平台，平台基于微流控芯片的技术，ICELL8利用WaferGen SmartChip TE平台筛选细胞，平台拥有5184个反应孔，可进行单细胞RNA测序样本的制备、扩增、表达谱建库测序、生物信息分析，快速得到样本间的基因表达差异。该平台具有通量高，周期快等特点，解决了传统单细胞扩增中通量低，价格贵的问题，为需进行大量细胞捕获筛选的研究提供了高效单细胞分选平台。该平台的细胞捕获效率为30%，成本相对较低。ICELL8 Single-Cell System2017年11月，英国Dolomite Bio公司推出Nadia单细胞自动制备仪，可平行运行1,2,4,8个样品， 每个样品18min内可生成6000个单细胞库；专为DropSeq方案设计；使用一次性试剂盒，防止污染；自动检测试剂盒状态，触摸屏控制，全自动运行。Nadia创新平台，可以使用自己的试剂，开发新的方法，可调节液滴大小、频率、温度、搅拌和时间等参数，一旦条件摸索成功，可通过Nadia单细胞自动制备仪在相同条件下平行运行2,4,8个样品。此前，该公司已推出单细胞RNA测序系统和μEncapsulator细胞包裹系统。Nadia单细胞自动制备仪Namocell是专注于单细胞分离分选技术的生物仪器公司，其自主研发的微流体单细胞分离平台，在单细胞基因组产前基因筛查方面已有所应用。 单细胞分选分离仪是集流式细胞术和微流控技术于一体的新一代细胞分离技术，仪器能够通过光电检测系统，识别标有荧光抗体的目的细胞，在激光照射的后的微流体通道中，设有电子开关，能够将目的细胞所在液体捕获，并且单个分离出来。Namocell单细胞分选分离仪除了细胞分选、建库和测序的仪器产品，凯杰、安捷伦等公司也在单细胞基因组研究领域有所布局，凯杰公司有单细胞全基因组扩增试剂盒，安捷伦公司除了之前的高通量寡核苷酸微阵列芯片和试剂盒等产品外，就在今天（1月26日）还宣布与一家叫新格元的分子诊断公司合作，共同开发针对单细胞测序的一站式解决方案，其中安捷伦将提供质量控制产品仪确保获得高质量测序文库，同时可改进样品处理和文库制备流程。此外，还有众多初创公司瞄准单细胞基因组学市场，以下为来源于某网站的不完全统计名单：国内也有科研团队正在从事相关领域的研究。如2020年12月，厦门大学杨朝勇教授团队研发的Digital-WGS样品前处理平抬，可基于数字微流控的自动化处理功能来简化高性能单细胞的WGS。该平台集成了并行纳升体积多重置换扩增(MDA)的所有主要步骤，包括从单细胞分离到全基因组扩增(WGA)的自动处理。通过在DMF芯片上结合流体动力学和表面润湿性，无论细胞类型和输入如何，都可以通过液滴操作自动有效地(100%)分离单个细胞。Digital-WGS允许在所有步骤中对液滴进行可寻址的控制，以大大提高裂解效率和反应的均匀性。可寻址和非接触式工作流程减少了与污染物或内源性背景的竞争，从而提高了基因组模板的有效浓度，为执行单细胞测序提供了一种有效的途径，对于单细胞基因组测序有广阔的应用前景。小结总体来讲，单细胞基因组学市场的快速发展，主要得益于政府及科研单位的重视和资金投入、测序技术成本的降低以及RNA测序技术的进步。此外还有多组学分析的专门技术，涉及利用各种“组学”学科，如基因组学、蛋白质组学和转录组学来收集和分析复杂、大量的生物数据。虽前景大好，单细胞基因组学市场目前仍面临诸多挑战，如相较于群体细胞测序，单细胞样品的分离、获取难度会大幅度增加，由于管理大量测序数据输出而导致的潜在数据分析错误，相关企业卷入了各种涉及知识产权、并购和其他商业交易的诉讼案件，以及新冠疫情导致2020年初产品销售中断等可能存在的持续影响。目前，单细胞基因测序更多应用还处于基础科研阶段，预计到2025年，单细胞基因组学将在整个科学技术市场占有重要地位。

在一项新的研究中，来自英国威康基金会桑格研究所和欧洲分子生物学实验室（EMBL）欧洲生物信息学研究所等研究机构的研究人员对六种哺乳动物物种中的25万多个细胞的基因进行测序，证实了免疫反应中的基因如何在不同的细胞之间和不同的物种之间具有不同的活活性。相关研究结果于2018年10月24日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“Gene expression variability across cells and species shapes innate immunity”。 图片来自Nature, doi:10.1038/s41586-018-0657-2。 这些研究人员以前所未有的细节研究了在细胞对病原体入侵作出的初始反应--先天性免疫反应（innate immune response）---中激活的基因。他们利用单细胞基因组学技术测量了25万多个细胞中数千个基因的活性来绘制抗病毒和抗细菌免疫的进化。 之前的研究已表明，先天性免疫反应中的许多基因在脊椎动物中快速地进化。这被认为是由来自细菌和病毒等病原体的无情攻击压力造成的。这些基因包括产生细胞因子和趋化因子分子的基因，它们以多种方式起作用---一些分子是提醒身体危险存在的炎症分子；其他的分子限制病原体增殖的能力；还有一些分子诱导细胞死亡。它们代表了一种成功的宿主策略来抵抗快速进化的病原体。 这些研究人员证实这些基因在不同的物种之间快速地进化，而且在单个组织内的不同细胞中也具有高度可变的活性。相比之下，他们发现在不同物种之间保守的并调节免疫反应的基因在单个组织的不同细胞之间中更加一致性地被激活。这些基因可能受到更严格的限制，这是因为它们参与细胞内的许多不同功能。但是，它们也是病毒的靶标。这些受到更严格限制的基因代表着致命弱点，可被病原体用来破坏免疫系统。 论文一作者、威康基金会桑格研究所研究员Tzachi Hagai博士说，“我们认为这种激活模式---一些基因受到严格控制，而另一些基因具有更多的可变活性---已进化成了一种对先天性免疫反应加以微调的方式。它是高效的，但又是平衡的。基因能够经进化后协助细胞控制入侵者，而且对这些基因的使用能够因细胞而异，因此周围组织不会受到大量攻击的影响。” 论文通信作者、威康基金会桑格研究所细胞遗传学主任Sarah Teichmann博士说，“在单细胞分辨率下DNA测序的强大功能意味着开展这种类型的研究如今是可行的。据估计，人体有37万亿个细胞，每个细胞具有相同的遗传密码。但是不同的细胞具有不同的表现，它们以不同的方式使用遗传密码。通过研究单个细胞，我们能够理解生命的这些基础的构成单元（building block，这里指的是细胞）以及它们如何一起合作，包括它们如何抵抗病原体。”

p　　早前，美国ProteinSimple公司推出全球第一款可以对循环肿瘤细胞、外泌体等微量样本进行蛋白质表达水平定量检测的Milo系统。一经推出，此产品立即获得《The Scientist》杂志年度创新产品第一名、生物通2016年度生命科学十大创新产品奖、中国仪器协会年度创新新产品奖等。它的发明人之一Kelly Gardner博士也获得MIT Technology Review 35岁以下创新人才奖。/pp style="text-align: center "img width="400" height="284" title="1.jpg" style="width: 400px height: 284px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/b89d84ca-1b3f-49c0-b5b1-82a689442e01.jpg" border="0" vspace="0" hspace="0"//pp　　通过检测血液中的循环肿瘤细胞(CTC)及循环肿瘤DNA发展起来的液体活检，对于肿瘤病人无痛诊断及靶向治疗有非常重要的意义。各国科学家在CTC富集、DNA测序和DNA分析方面做了很多的工作，但是CTC蛋白质研究一直因为检测灵敏度问题停滞不前，影响CTC在肿瘤诊断及治疗中发挥更重要的作用。/pp　　美国ProteinSimple Milo系统的推出解决了这一问题。最近，加州大学伯克利分校和斯坦福大学医学院的研究人员利用Milo系统在《Nature Communications》上发表文章，证实在一次普通的抽血后(2-4 ml血液)，可对血样中罕见的CTC进行蛋白质表达水平分析，以检测其中一组与癌症相关的蛋白质。/pp　　实验方案如下：科学家们从乳腺癌患者的血液中分离出循环肿瘤细胞，然后将循环肿瘤细胞接种到Milo芯片western blot细胞捕获孔中。微流体设备裂解细胞，让其内容物流出，之后进行电泳将蛋白质根据分子量大小进行分离。然后在凝胶中原位捕获蛋白，再进行抗体孵育杂交，最后通过荧光信号值进行定量，检测了癌症蛋白标志物的含量。/pp style="text-align: center "img title="2.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/1045381e-1f3a-40c1-a07f-82df916660d6.jpg"//pp style="text-align: center "(图片来自Nature Communications)/pp　　这项研究检测的蛋白靶标有12个，包括已被用于癌症分型(如ER、HER2、EGFR)、循环肿瘤细胞鉴定(如EpCAM、panCK、CK8)、白细胞标记(如CD45)的蛋白和普遍表达于哺乳动物细胞的蛋白(GAPDH、β-tubulin、mTOR、ERK-1/2、eIF4E)。研究者计划将这一名单继续扩大，以便最终能够更精确地对癌细胞进行分类，选择针对的靶向治疗药物。/pp style="text-align: center "img title="3.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/60121d8a-3a5f-4b8b-9f0f-453af71e6bed.jpg"//pp style="text-align: center "(图片来自Nature Communications)/pp　　这篇文章的通讯作者、加州大学伯克利分校的Amy Herr表示：“微流体设计是本研究的关键。我们能够将每个阶段所需的功能整合在一起。这样，我们才能很快、很快地开展每一步。如果慢一点，细胞中的蛋白质将弥散，变得无法检测。”/p

学理工的人大概都有这样的感觉，很多规律和现象都可以用理论、公式或算法来描述及推导。只要知道了所有的条件，便能预测结果。反过来，也可以通过现象反推关键的成因。久而久之，我们也习惯并爱上了这样逻辑清晰、条理分明的世界。以至于我们时常因为意外的结果徒然而叹，也为寻找到那孜孜以求的&ldquo 理&rdquo 而欢欣鼓舞。抛开现实里的林林总总，理工男女的生活可以很简单&mdash &mdash 以&ldquo 理&rdquo 立身，有&ldquo 理&rdquo 走遍天下，无&ldquo 理&rdquo 无地容身。这样的准则对某些人来说甚至可以上升到人生哲学的高度&mdash &mdash 直到他们遇上了生物学。　　相比数理化，生命科学相当&ldquo 后进&rdquo 。在数理化已经发展到有相当完整的理论体系的今天，生物学，尤其是分子生物学可谓是才刚刚起步。&ldquo 不幸的&rdquo 生物工作者还处于认知的原始积累阶段。我们研究的几乎每一个对象，每一种方法，大概还没有可以宣称已经研究透彻的例子&mdash &mdash 即使对象是简单如病毒这样连生命都算不上的活性大分子。实验不能重复，现象无法解释这样的事在生物实验室里是家常便饭。许多人都遇到过PCR扩增失败，或电泳多出一条带这样的事。多数选择再做一次看看，而不是寻根究底。因为整个系统太复杂、变量太多太多了。　　 　　系统的复杂程度太高是一方面，另外一个原因是研究手段的局限(当然还有更多客观原因，非本文主旨所以省略)。微观世界的研究手段的升级依赖于其他科学门类的进步，对手段的依赖必然导致方法论的单调。在分子和细胞生物学领域，许多人习惯用宏观思维去理解微观世界，比如重视群体现象而忽视个体差异，用一群相关的细胞代替一个系统。而对一个复杂的系统用笼统的手段进行研究，得出的结论自然是粗浅的。　　虽然没人做过统计，但据估计至少95%以上的现代生物学研究成果是建立在对细胞群体的研究基础上。忽略细胞异质性(Cellular Heterogeneity)的方法固然降低了系统的复杂度，简化了流程。其带来的生物信息不可逆的丢失也是显而易见的。这种平均化的方法必然导致信息的稀释或丢失，在某些情况下甚至会让人得出矛盾的结论。另外，该方法让发现并分离细胞群体中的&ldquo 异类&rdquo 的尝试变得难上加难。如此，只有强信号才有可能被检测到。而这不仅让以往科学家们的努力有了不过是摘取了低处枝条上果实的意味，也让部分成果的准确性打上了问号。　　单细胞分析技术正是解决上述问题的方法，其中最引人注目的是单细胞测序技术(Single-Cell Sequencing)。然而，细胞异质的不确定性导致需要同时分析很多单细胞以消除小量样品可能带来的偏差，而这直接和实验可行性挂钩。幸运的是，由于技术的进步和费用的降低，单细胞测序技术近年来已得到迅速推广。通过对单个细胞的逐个测序，信息的精度、深度，以及信息量可获得几何级数的增长，随之带来的是我们对具体对象更加翔实和准确的了解。而且，通过数学方法，高度相关的细胞可以被整合起来当作亚群体处理以部分消除单个细胞的随机异质性，或者按相关性重排以构建全新的不依赖于传统时间轴的图谱。这些新手段已经给我们带来了一些前所未有的认知。那些前沿科学家们所取得的成就，同时也刺激着更多的人加入他们的行列，形成了正反馈。　　近年来，单细胞测序逐渐大众化，相关的论文发表数量在2010年后呈指数增长之势，在高品质期刊上发表的单细胞研究成果屡见不鲜。其产生的影响深远，以致Nature Methods将单细胞测序选为2013年度重大技术，并在2014年首刊专述。在后面的文章中我将会挑选几篇有代表性的文章谈谈它们的意义。有意思的是，二代测序技术已经在2007年当选Nature的年度重大技术。单细胞研究的流行无疑让它的使用拓展到了更广阔的领域。　　单细胞研究不仅在DNA和RNA测序方面取得了极大的进展，单细胞质谱分析(Mass Cytometry)也正在逐渐得到更多的关注。该技术用带有重金属原子标记的单克隆抗体对细胞表面和细胞内的关键蛋白进行标记，然后依次等离子化细胞，通过质谱分离重金属原子并分析其丰度来获取相应蛋白在各细胞内的表达情况。该技术也叫质谱流式细胞技术，相比荧光流式细胞技术，其主要特点是背景低、通道互扰小，所以可以同时分析更多的蛋白质。如今可用的重金属标记已达35种，这是基于荧光的检测手段无法企及的(最新的荧光流式技术可一次检测16-18种蛋白)。该技术可以一次分析百万量级的单细胞，而且没有理论上限，超出单细胞测序几个数量级。因此可以用来构建非常详细的细胞关联图，尤其适合分析高复杂度的系统，比如血液中的细胞。另一方面，单细胞质谱无法像测序那样对全基因组进行分析，但是由于它是直接对细胞的功能的执行者&mdash &mdash 蛋白质进行解析，跳过了对细胞内各种基因表达调控机制的考量，其意义是非常明显的。　　此外，单细胞测序技术让微流控芯片技术(Microfluidics)得到了发展。除了在制备单细胞测序文库方面具有优势以外，该技术在其他领域内的应用也得到了拓展，如在微流控环境中进行细胞培养。该方法可将少数细胞分离到纳升级(nL)的独立单元中分别培养并进行定向引导，然后可以立即利用微流控系统制备测序文库。在干细胞研究以及生物制药领域，该技术应该有着广阔的应用前景。　　在单个细胞层面的研究近年来经历了井喷式的增长。然而，其应用主要体现在基础研究中。目前临床上唯一被使用的单细胞检测法是胚胎植入前遗传学诊断(PGD, Preimplantation Genetic Diagnosis)。循环肿瘤细胞(CTCs, Circulating Tumor Cells)虽然在定义上是存在于循环系统中的极少量单个细胞，临床上仍然是先富集然后进行整体分析。对单个CTC进行分析的必要性已有探讨，但开发出相应的技术并在临床上被接受还有一段路要走。

p style="text-indent: 2em "微生物所strong微生物资源前期开发国家重点实验室/strong杜文斌研究组和黄力研究组共同开发了一种新型的strong微流控界面纳升注射技术/strong(Interfacial Nanoinjection, INJ)，该技术可以将传统的生化反应体系微缩在一个纳升体积的油包水微液滴体系中完成。/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "界面纳升注射(INJ)具有诸多显著优势/span/strong/pp　　针对这一技术创新，团队申请了多项中国发明专利和美国专利，并研制了基于INJ技术的小型桌面系统。/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/201910/uepic/fe470173-c411-4a4f-857f-952adad6e8d5.jpg" title="界面纳升注射(INJ)系统.jpg" alt="界面纳升注射(INJ)系统.jpg"//pp style="text-align: center "界面纳升注射(INJ)系统/pp　　该系统和国外同类产品如美国Labcyte公司的Echo超声纳升移液系统、以及美国TTP Labtech公司的mosquito HTS微量筛选系统相比，strong在仪器成本、耗材成本、最小液滴体积、流式细胞仪兼容性、操作的灵活性、以及污染控制等方面，均具有显著优势，/strong适用于各类单细胞微体积反应分析，也可应用于其他微体积反应分析，在微生物培养筛选、合成生物学、药物筛选、蛋白结晶条件筛选等方面均具有应用潜力。/pp　　在性能方面，INJ系统通过高精密度的微体积控制实现不同试剂组分的纳升体积分步添加，兼容96和384孔板，可以在预先填装矿物油的孔板上，按照程序设定加入纳升样品或试剂液滴，用于实现高通量筛选。利用低成本探针可以精确加注的最小体积达到1 nL，当加样体积为5 nL时，体积标准偏差小于11 %。加注的液滴通过离心可以沉降到孔板底部并融合，液滴的融合效率最高，达到99%以上。利用多次加注样品、试剂的方法，可以实现多步反应和浓度梯度配置。系统加注的体积精确性、线性和重现性良好。/pp　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "　FACS-INJ单细胞分析流程和应用/span/strong/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 281px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/201910/uepic/7cc806a5-55aa-475f-a110-69b3c5038b70.jpg" title="杜文斌-流式细胞分选+界面纳升注射技术图示.jpg" alt="杜文斌-流式细胞分选+界面纳升注射技术图示.jpg" width="600" height="281" border="0" vspace="0"//pp style="text-align: center "span style="text-align: center "FACS-INJ单细胞分选分析流程/span/pp　　strong单细胞分析是一项变革性技术/strong，在单细胞基因组异质性研究及复杂微生物群落中稀有微生物种群多样性研究等领域应用广泛。然而，如何进一步降低单细胞分析的成本，提高可靠性和效率，仍然面临重大挑战。流式细胞荧光激活细胞分选(FACS)是目前最高效的单细胞分选技术，可实现病毒、细菌、真菌和动物细胞的多参数检测和分选 利用荧光标记，可对不同类型的细胞进行有效的区分，分选成功率高。研究团队将INJ与FACS平台相结合，建立了FACS-INJ单细胞分选分析流程，应用覆盖了单细胞表型分析、基因型分析、基因表达分析以及全基因组扩增测序。/pp　　研究团队首先利用FACS-INJ系统实现了strong病原菌微生物单细胞耐药基因的PCR筛查和单细胞药敏表型筛查/strong。经优化，多孔板可预先装载纳升体积的PCR引物或不同浓度的抗生素液滴。PCR筛查体积缩小到500 nL，试剂消耗和成本和常规体系相比降低至原先的1/40，耐药检测的体积控制在200 nL，试剂消耗和成本和常规体系相比降低至原先的1/1000，时间从 12小时缩短至5小时，这对于大幅降低临床病原检测的成本，实现脑脊液、房水等难获取微量样品的耐药基因和表型筛查具有重要意义。/pp　　其次，FACS-INJ系统还可用于strong动物细胞的单细胞基因表达分析/strong。以小鼠巨噬细胞RAW264.7在细菌胞外多糖处理前后的炎症反应为例，通过荧光激活流单细胞式分选处理前后的小鼠巨噬细胞，基于一步法反转录实时荧光PCR扩增，在单细胞水平解析了次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(HPRT)基因(看家基因)和白介素1β(IL-1β)基因(炎症反应)表达水平的变化。/pp　　最后，团队与北京大学黄岩谊课题组合作，建立了strong基于FACS-INJ的微生物全基因组扩增测序流程/strong，以获得未培养微生物的全基因组信息。流程包括流式分选微生物单细胞、单细胞裂解、酸碱中和、MDA扩增和建库测序。以热泉来源的古菌硫化叶菌(Sulfolobus sp. A20)菌株为模型，将单细胞扩增的体积优化至360nL，硫化叶菌全基因组覆盖度达到80%以上。在纳升级微液滴中实现西南印度洋未培养单细胞微生物全基因组DNA的MDA扩增与测序，拼接后获得15个单细胞基因组，大小在0.1~3.7Mb大小。该方法获得的微生物基因组污染度较传统的MDA扩增方法显著降低( 5%)，显著提高了微生物单细胞基因组数据质量。平台也适用于肿瘤、胚胎等动物细胞的全基因组扩增测序，对肿瘤细胞的单细胞测序的覆盖度达到60-80%。/pp　　上述研究工作近期作为特邀论文在线发表在Small上。微生物研究所助理研究员贠娟莉博士、郑小伟博士、徐鹏博士为论文共同第一作者，杜文斌研究员、黄力研究员和北京大学黄岩谊教授为论文共同通讯作者。该研究该研究得到了中国大洋协会大洋十三五重点项目、中科院战略性先导科技专项(B类)，中国科学院重点部署项目、中国科学院前沿科学重点研究项目、国家自然科学基金面上项目和优青项目等支持。/pp　　论文出处：/pp　　Yun, J.L.sup#/sup Zheng, X.W.sup#/sup Xu. P.sup#/sup Zheng, X. Xu, J.Y. Cao, C. Fu, Y.S. Xu, B.X. Dai, X. Wang, Y. Liu, H.T. Yi, Q.L. Zhu, Y.X. Wang, J. Wang, L. Dong, Z.Y. Huang, L.* Huang, Y.Y.* Du, W.B.* Interfacial Nanoinjection-based Nanoliter Single-cell Analysis, Small, 2019, doi:10.1002/smll.201903739./pp　　a href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/smll.201903739" target="_self" style="text-decoration: underline font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai color: rgb(255, 0, 0) "strongspan style="font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai color: rgb(255, 0, 0) "查看原文戳这里/span/strong/a/pp　　strongspan style="font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai "杜文斌/span/strongspan style="font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai "，男，中科院微生物研究所研究员。2007年于浙江大学化学系，获博士学位。2007-2011年于美国芝加哥大学化学系从事博士后研究工作。2013年11月加入中科院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室。主要从事微流控芯片技术及新型分析微生物技术与应用研究。已发表论文60余篇，申请中国和美国专利30余项，授权20多项。主持国家优秀青年科学基金项目，国家重点研发计划 “数字诊疗装备研发”项目，中国科学院前沿科学重点研究项目等。/span/p

图片来源：昵图网　　随着第二代测序技术的普及，单细胞测序迎来了迅猛发展。　　近日，南方科技大学生物学系副教授贺建奎在美国冷泉港参加了单细胞分析会议后，在科学网博客里写道：&ldquo 这是一个非常令人激动的前沿学术会议，我深深地体会到了单细胞基因组学时代的来临。&rdquo 　　他对《中国科学报》表示：&ldquo 单细胞基因测序技术的突破，只是开了一个很小的&lsquo 口&rsquo ，&lsquo 口&rsquo 的另外一边，就是一个非常漂亮的世界。&rdquo 他说，单细胞基因组学研究的强劲势头，昭示着人类正逐步迈进个体化医疗时代。　　更重要的是，测序技术的发展使基因测序民用成为大势所趋，个人DNA测序咨询服务即是一例。美国路易斯维尔大学研究员徐鑫认为，基于个人基因组DNA信息的健康评估有潜在市场，有可能发展成为一个新兴的庞大产业。　　高通量测序的推力　　&ldquo 单细胞测序，就好像从太平洋里钓一条小鱼。这在以前是不可想象的，而现在我们技术上已经实现了单细胞测序，可以做很多以前不敢想象的事情。&rdquo 贺建奎表示。　　耶鲁大学一篇发表在《遗传》杂志上的文章指出，单细胞基因组学研究，致力于从最小量的样品(终极目标是单细胞)获得全基因组的最大信息，即在全基因组范围内鉴定在不同水平上影响生命活动的基因群的功能和相互作用。在只有或只能用单细胞或极少量细胞的情况下，单细胞测序技术将一展身手。　　贺建奎介绍说：&ldquo 高通量测序技术的发展，使单个基因组测序价格降到5000美元。&rdquo 　　单细胞测序在技术上实现突破，应归功于高通量测序技术。&ldquo 新一代基因分析平台Ion Torrent巴掌大小的芯片上就有上千万个测序微孔&rdquo ，据深圳华因康基因科技有限公司研发部负责人金虹介绍，类似于半导体集成芯片，高通量测序芯片的密度非常高，这样就能实现一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，效率非常高。　　微流控技术帮了单细胞测序一个大忙&mdash &mdash 减少甚至避免基因污染。贺建奎说，微流控平台提供了一个适于单细胞基因扩增、与反应物充分接触、基因测序的&ldquo 微试管&rdquo ，可以降低单细胞测序的噪声。　　他打了个很有意思的比方：&ldquo 就好像我们把小鱼从太平洋赶到小池塘，只需要很少的鱼钩(反应物)就能把它抓到，而且大大减少了&lsquo 误捕&rsquo 的机会。&rdquo 　　徐鑫认为，基因测序日益便捷，成本不断下降，研究人员都在努力向1000美元即可实现测序单个人基因组的目标迈进，因此基因组DNA测序有可能逐步发展为民用。　　目前我国在高通量测序技术上不甘落后。金虹表示，开展研发具有自主知识产权的高通量测序技术，对于我国在这一新兴领域的发展具有重要意义，尽管这个过程可能漫长而艰辛。　　基因病变的曙光　　测序技术目前已在癌症的诊疗中崭露头角。金虹指出，目前基因测序技术已经在癌症的诊疗中发挥作用，尤其是在靶向药物作用靶点的基因表达水平的检测，能给癌症患者实质性的帮助。　　&ldquo 然而，基因测序作为一种工具，目前在民用方面的受惠面还很窄，远远没有发挥它的作用，现阶段主要的用途还是在科研方面。&rdquo 金虹话锋一转，说：&ldquo 不过我们有理由相信，基因测序将会越来越多地向临床应用方向发展。&rdquo 　　据了解，癌症基因组的最新研究进展表明，癌症本身是一种多基因相互作用和影响的疾病，这正是癌症难以治愈的原因。而了解癌细胞如何在肿瘤内变化以及每个细胞内&ldquo 定居&rdquo 着多少版本的基因，这将有助于癌症诊断。　　&ldquo 肿瘤的演化过程是复杂的。&rdquo 贺建奎认为，单细胞基因组学的研究，使人们能够认识癌细胞进化过程的更多细节，&ldquo 比如我们有望通过研究从血液中分离出来的单个游离癌细胞，实现癌症的超早期诊断和治疗的实时监测。&rdquo 他说，借此了解癌症的形成、扩散，可以为癌症的治疗提供更多的借鉴。　　例如，近日深圳华大基因的研究人员揭示了癌症并非由常见的突变基因导致，在病人群体中所鉴定的频发突变可能与肿瘤个体无关。因此，在癌症分析和诊断过程中进行个性化治疗十分重要。　　不仅对癌症，许多基因病变也可为鉴。贺建奎说，单细胞基因组学的一个功能就是揭示基因病变的根本原因，解开基因治疗的密码，对不同患者对症下药。　　2012年，美国科学院院士谢晓亮课题组与北京大学生物动态光学成像中心研究员李瑞强课题组等合作，首次实现了高覆盖度的单个精子的全基因组测序。谢晓亮表示，这项工作构建了迄今为止重组定位精度最高的个人遗传图谱，这一技术方法在男性不育症研究和肿瘤早期诊断及个体化治疗等生物医学领域有着广泛的应用前景。　　重新审视生命　　&ldquo 尽管单细胞基因组学前景广阔，但并不意味着我们要改造生命。&rdquo 贺建奎说，&ldquo 帮助人们更深刻地观察、重新审视生命的奥秘，是单细胞基因组学研究的要义。&rdquo 　　一直以来，人体干细胞都被认为是单向地从不成熟细胞发展为专门的成熟细胞，生长过程不可逆转。　　而2012年诺贝尔生理学或医学奖获得者，日本科学家山中伸弥和英国发育生物学家约翰· 戈登关于细胞核重编程的研究，彻底改变了人们对细胞和器官生长的理解：他们发现，成熟的、专门的细胞可以重新编程，成为未成熟的细胞，并进而发育成人体的所有组织。　　贺建奎认为，通过单细胞测序技术对每个细胞的测序，对比细胞间的差异，就有可能有新的发现，诸如&ldquo 为什么有的干细胞发育成了心脏，有的发育成了手足?&rdquo 此类命题，单细胞基因组学可能会给出不同的答案。　　&ldquo 我们通过对人体不同部位的单细胞的测序和基因比对，就有可能解开发育之谜。&rdquo 贺建奎说，单细胞基因测序将取代基因组测序的平均法则，&ldquo 对于每一种疾病，也可以从单个细胞的水平重新认识，从而揭示病变的根本原因。&rdquo 　　《自然》杂志网站这样评价单细胞基因组学：测序技术的飞速发展和成本大大降低，使得基因组测序成为常规技术。然而，大多数的人类基因组、癌症等研究仍然通过多个细胞抽提DNA进行测序，其中所忽略的细胞间的差异对于控制基因表达、细胞行为和药物反应的问题却有可能是至关重要的。单细胞测序有望成为个体化医疗的重点领域。

据美国物理学家组织网近日报道，最近，加拿大英属哥伦比亚大学与英属哥伦比亚癌症研究所、转化与应用基因组学中心合作，开发出一种硅酮材料的芯片实验室技术，能让每个细胞像弹球机里的球一样各就各位，然后进行基因检测。这种“单细胞基因分析”技术使基因检测更加灵敏迅速，有助于肿瘤分析和临床疾病的诊断。本周出版的《美国国家科学院院刊》对该芯片实验室进行了详细介绍。　　这种芯片实验室大小跟一个9伏电池相当，能同时分析300个细胞。研究人员设计了一种路线，用液体载运细胞通过显微管道和一个个小阀门，当细胞挨个进入各自的小空位时，它们的RNA就会被提取出来，经过复制用于进一步分析。　　标准基因检测要求使用大量细胞，才能得出由上千万不同细胞平均化以后的“综合图像”，这会掩盖细胞的真实属性和它们之间的相互作用。“这就好比用混合水果慕丝来研究草莓和树莓为什么不一样。”领导该研究的高通量生物中心副教授卡尔汉森介绍说，而单细胞分析正在成为基因研究中的黄金手段，因为即使是从同一肿瘤组织中采集的样本，也包含了正常细胞和多种癌细胞类型，而单细胞分析显出极微小的差异。　　此外，这种芯片实验室几乎将所有细胞分析过程整合在了一起，不仅能分离细胞，还能用化学试剂将细胞混合起来，通过检测反应过程中的荧光发射获得它们的基因编码。所有这些都能在芯片上完成，不仅操作简单，而且成本效益高。

空间代谢组学：单细胞空间代谢流分析新方法原创 飞飞 赛默飞色谱与质谱中国 关注我们，更多干货和惊喜好礼刘甜生物体内的代谢物和脂质不仅是细胞的关键组成模块，它们在信号传导、表观基因组调控、免疫、炎症和癌症发展中同样具有重要作用和意义。代谢组学分析是我们了解、评估生物体、器官和细胞状态的重要方式。而单细胞技术通过展示组织内部甚至单克隆细胞之间的细胞异质性，将生物学研究推进至新维度。质谱成像（MSI）技术可以从样品中创建特定化合物的图像，这些图像是由样品表面获得的数千个质谱生成的。每个记录的质谱都会为图像贡献一个像素，而每个质谱中的峰都可以生成一个图像。与其他成像方法相比，MSI无需化合物标记，可实现非靶向分析。本次与大家分享的是一篇最新发表于bioRxiv上的有关单细胞空间代谢流分析方法的文章[1]。研究人员基于AP-SMALDI Orbitrap平台开发了一种命名为“13C-SpaceM”的新方法，通过13C标记的葡萄糖示踪葡萄糖依赖性脂肪酸从头合成途径（glucose-dependent de novo lipogenesis）。本方法应用超高分辨率的基质辅助激光解吸/电离实现了单细胞质谱成像，并通过全离子碎裂模式（AIF）模拟了脂肪酸分析前处理过程中的皂化反应，对包括甘油磷脂在内的主要脂质中的脂肪酸部分实现了共同分析。超高灵敏度、高分辨质谱检测器为单细胞内脂肪酸同位素检测提供了准确的定性、定量结果。研究人员通过鼠肝癌细胞的常氧-低氧模型，对检测方法进行了验证，确认方法的有效性。之后应用本方法分别检测了ATP柠檬酸裂解酶基因敲降（ACLY knockdown）鼠肝癌细胞以及携带异柠檬酸脱氢酶（IDH）突变的小鼠胶质瘤脑组织切片，通过比较脂肪酸的同位素丰度变化评估脂肪酸从头合成比例以及外源性脂肪酸摄取的变化。分析结果揭示了在脂肪酸从头合成过程中，乙酰辅酶A池（Acetyl-CoA pool）中存在大量的空间异质性，这表明在微环境适应过程中发生了代谢重编程。01研究背景脂质在生物体生命过程中承担着多种重要作用，多数脂质是由脂肪酸合成而来。成年哺乳动物体内的细胞通常由血液中摄取脂肪酸，而脂肪、肝脏以及癌细胞还可以Acetyl-CoA为底物，从头合成脂肪酸[2]。Acetyl-CoA经过一系列代谢反应，可以生成含有16个碳的饱和脂肪酸棕榈酸（16:0），之后棕榈酸发生碳链延长或去饱和反应生成不同的饱和、不饱和脂肪酸，从而影响脂质组成。而Acetyl-CoA同样有多种来源，除了葡萄糖经由TCA循环生成的柠檬酸在ACLY作用下生成Acetyl-CoA以外，在缺氧环境下，葡萄糖后续代谢产物丙酮酸会转化为乳酸，从而无法合成Acetyl-CoA、进入脂肪酸合成途径。在此情况下，谷氨酰胺可通过还原羧化反应生成柠檬酸，进而合成Acetyl-CoA [3,4] 。另有文献报道，缺氧环境下的癌细胞还可以将乙酸作为脂肪酸合成的前体 [5,6] 。而Acetyl-CoA除了作为脂肪酸合成底物以外，对于蛋白翻译后修饰、基因表达等均有重要作用。通过监控脂肪酸合成和Acetyl-CoA代谢间的互动可以帮助我们深入理解癌细胞的生存状态。02分析方法大气压MALDI成像分析是通过AP-SMALDI5离子源配合Q Exactive plus高分辨质谱仪实现的。激光像素设置为 10×10 µ m，激光衰减器角度设置为33°。质谱在负离子模式下采用一级全扫描和全离子碎裂（AIF）扫描模式。AIF模式的隔离范围为 m/z 600-1000，扫描范围为m/z 100-400，分辨率 140k，最大注入时间500 ms，碰撞能量NC 25%。（图1）图1. 单细胞代谢流质谱成像分析流程（点击查看大图）MALDI分析前后，分别应用显微镜检测，确定细胞影像位置及MALDI消融标记位置。通过检测MALDI的消融标记，将其与细胞影像叠加，并通过应用数学公式进行解卷积，从而整合显微镜图像和MALDI图像。实现了应用MALDI成像质谱检测到的单细胞分子轮廓。（图2）图2. 整合显微镜和MALDI-MS分析结果实现单细胞质谱成像（点击查看大图）03鼠肝癌细胞常氧-低氧模型单细胞成像分析鼠肝癌细胞在添加25 mM的12C-葡萄糖或U-13C-葡萄糖后，用含1mM醋酸、2 mM谷氨酰胺和10%透析胎牛血清的无葡萄糖DMEM细胞培养基培养，在37°C、5% CO2的培养箱中在常氧（20% O2）或低氧（0.5% O2）条件下培养72小时。选择72小时的时间点是为了确保棕榈酸的同位素标记已经达到稳态。（图3）在低氧条件下培养的细胞被表达绿色荧光蛋白（GFP）标记。在共培养实验中，常氧和低氧细胞使用胰酶分离，每种条件下混合10000个细胞，在同一张玻璃片上进行培养，并在固定之前允许其附着3小时。图3. 由稳定同位素标记的13C6-葡萄糖生成细胞质Acetyl-CoA以及后续的脂肪酸和脂质合成途径（点击查看大图）通过质谱一级全扫描分析，质谱成像共检测到64种脂质，包括磷脂酸（PA）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）等。具体脂质鉴定结果经过了常规LCMS脂质分析确认。在AIF模式下，检测到了11种含量最高的脂肪酸，相应检测结果同样与常规LCMS分析结果相符。为了验证本方法，研究人员检测了常氧-低氧培养的鼠肝癌细胞混合样本。通过对氨基酸同位素峰的定量分析，发现13C标记的棕榈酸（M0）主要在正常细胞中检出，而缺氧细胞中的棕榈酸以未标记状态（M+0）为主。通过GFP标记结果的对照，证明了本方法可以通过同位素峰分布有效识别不同培养状态的细胞。图4. 在常氧（GFP阴性）和低氧（GFP阳性）条件下的原代鼠肝癌细胞共培养模型的显微镜和质谱成像结果（点击查看大图）图5. 通过GFP标记验证识别不同培养模式细胞的准确性（点击查看大图）04单细胞Acetyl-CoA池标记水平分析研究人员使用了两种表达不重叠的shRNA序列（ACLYkd oligo1和ACLYkd oligo 2）细胞系以及一个对照组细胞系。通过使用1 μg/mL的四环素处理细胞72小时实现了ACLY沉默。质谱成像数据是以10 μm的像素大小获得的，每个细胞的平均面积为550μm2，平均每个细胞有12个像素。通过应用二项式模型计算每个细胞的acetyl-CoA池标记程度p值，从而量化细胞质中acetyl-CoA池中从葡萄糖衍生的同位素标记acetyl-CoA的比例。测试结果与预期相符，ACLYkd细胞中的acetyl-CoA池标记水平低于对照组。值得注意的是，两种ACLYkd细胞之间的差异非常明显。ACLYkd oligo1的结果呈双峰分布，p值的差异明显较大，表明该细胞系存在两个亚群体。其中一个模式显示的p值与对照组相近，说明存在一个“沉默失败”的细胞亚群。ACLYkd oligo1第二个模式具有的p值明显则低于ACLYkd oligo 2，表明ACLYkd oligo 1中还存在一个“强沉默”的亚群，在这些细胞中，沉默效率非常高，导致acetyl-CoA同位素标记比例大幅降低。在ACLYkd oligo 2中，acetyl-CoA池的标记程度以及GFP报告基因强度显示出更均一的分布。M+2峰是最能表现出ACLYkd oligo1细胞中“强沉默”群体的低acetyl-CoA标记表型的质谱峰。M+8峰则为对照组细胞的特征标记峰。M+2和M+8之间的差异可以作为显示异质性的指标，用于展示葡萄糖对细胞质中acetyl-CoA的相对贡献。因此，13C-SpaceM能够检测ACLY敲降细胞中的异质性，并识别不同的亚群体。这种单细胞和空间异质性无法通过整体分析揭示，显示了13C-SpaceM方法的独特优势。图6. 细胞ACLY敲降后acetyl-CoA的同位素标记程度分析（点击查看大图）05肿瘤组学中氨基酸合成异质性的空间组学分析研究人员分析了从横向植入表达突变型异柠檬酸脱氢酶（IDH）和红色荧光蛋白（RFP）的GL261胶质瘤细胞的小鼠大脑组织切片。在采集组织前的48小时，小鼠被喂食未标记的或含有U-13C葡萄糖的液体饮食。首先，研究人员分析了12C-葡萄糖饮食的肿瘤携带小鼠大脑切片中的酯化脂肪酸组成。通过比较质谱TIC与显微镜明场和荧光成像，发现整个大脑（包括肿瘤区域）的质谱离子响应很高（图7a）。测试过程中，肿瘤区域与组织切片的其余部分分别采用10μm和50μm激光分辨率进行分析。对不同脂肪酸的空间分析揭示了在非肿瘤携带的脑半球组织中，脂肪酸丰度存在高度的异质性，我们可以仅根据它们的脂肪酸组成来识别的某些结构，如胼胝体和前连合部，这两个区域都富含油酸（18:1）且棕榈酸（16:0）、硬脂酸（18:0）和花生四烯酸（20:4）的含量低。有趣的是，尽管棕榈酸、油酸、硬脂酸和花生四烯酸在肿瘤和周围的大脑组织中的含量相似，肉豆蔻酸（14:0）和棕榈酸（16:1）在肿瘤组织中则明显增加。与大脑其它部分相比，肿瘤中必需脂肪酸亚麻油酸（18:2）和α/γ亚麻酸（18:3）也明显增高。之后，研究人员分析了喂食含有U-13C葡萄糖饮食的小鼠肿瘤组织，从肿瘤组织中选择性分离出的5种主要从头合成的脂肪酸的同位素分布（图7c）。三种饱和脂肪酸肉豆蔻酸（14:0）、棕榈酸（16:0）和硬脂酸（18:0）的13C摄入丰度较高，同位素分布最大分别可至M+10，M+12和M+14。其中，肉豆蔻酸M+0的强度极低，几乎完全源自脂肪酸从头合成。由于肉豆蔻酸对一些重要信号蛋白的翻译后修饰很重要，这一发现表明胶质瘤可能选择性地上调肉豆蔻酸的合成以促进自身生长。相比之下，两种单不饱和脂肪酸，棕榈酸（16:1）和油酸（18:1）的M+0同位素的相对丰度较高。硬脂酸和油酸的M+2同位素丰度明显增加，表明它们是由未标记的前体（即棕榈酸和棕榈酸）延长形成的。研究人员进一步利用棕榈酸的同位素分布计算acetyl-CoA池中源自葡萄糖的比例，发现肿瘤组织内的该比例同样具有显著的空间异质性（图7d）。图7. 小鼠脑胶质瘤组织内部脂肪酸代谢空间异质性分析（点击查看大图）总结本文作者开发了一种全新的单细胞代谢流成像检测方法，将超高激光分辨率的大气压MALDI与高分辨率、高灵敏度的质谱检测器相结合，对细胞和肿瘤组织内的葡萄糖依赖性脂肪酸从头合成途径实现单细胞层面的空间分析。不仅为单细胞水平空间探测代谢活动提供了新的方法，还为正常和癌症组织中的脂肪酸摄取、合成和修饰分析提供了前所未有的视角。参考文献：1. Buglakova E, Ekelö f M, Schwaiger-Haber M, et al. 13C-SpaceM: Spatial single-cell isotope tracing reveals heterogeneity of de novo fatty acid synthesis in cancer. Preprint. bioRxiv. 2024 2023.08.18.553810. Published 2024 Feb 28. doi:10.1101/2023.08.18.5538102. Rö hrig F, Schulze A. The multifaceted roles of fatty acid synthesis in cancer. Nat Rev Cancer. 2016 16(11):732-749. doi:10.1038/nrc.2016.893. Metallo CM, Gameiro PA, Bell EL, et al. Reductive glutamine metabolism by IDH1 mediates lipogenesis under hypoxia. Nature. 2011 481(7381):380-384. Published 2011 Nov 20. doi:10.1038/nature106024. Wise DR, Ward PS, Shay JE, et al. Hypoxia promotes isocitrate dehydrogenase-dependent carboxylation of α-ketoglutarate to citrate to support cell growth and viability. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 108(49):19611-19616. doi:10.1073/pnas.11177731085. Kamphorst JJ, Chung MK, Fan J, Rabinowitz JD. Quantitative analysis of acetyl-CoA production in hypoxic cancer cells reveals substantial contribution from acetate. Cancer Metab. 2014 2:23. Published 2014 Dec 11. doi:10.1186/2049-3002-2-236. Schug ZT, Peck B, Jones DT, et al. Acetyl-CoA synthetase 2 promotes acetate utilization and maintains cancer cell growth under metabolic stress. Cancer Cell. 2015 27(1):57-71. doi:10.1016/j.ccell.2014.12.002如需合作转载本文，请文末留言。

人体组织器官由具有不同细胞类型的异质细胞群组成。传统批量测序（Bulk Sequencing）方法仅能捕获器官与组织群体细胞成分的平均水平，或者只代表其中占优势数量的细胞信息，单个细胞独有的特性常常被忽略。近年来，随着单细胞测序（Single-cell sequencing）技术的发展，实现了单个细胞水平上DNA或RNA的测序，从而能够特异和精准地探索单个细胞的基因变异水平，弥补了传统批量测序的不足[1]。图1. 单细胞测序与传统批量测序比较[1]单细胞基因组测序技术，是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项技术，广泛应用于癌症研究、胚胎发育、辅助生殖、细胞分化、免疫机制、微生物等生物医学方向的研究。本期主要对单细胞基因组测序的技术原理、技术流程、技术平台及其在生物医学领域的应用实例做简单介绍。技术原理单细胞基因组测序的原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组后进行高通量测序，揭示细胞间异质性的基因信息。技术流程单细胞基因组测序主要包括四个步骤，即单细胞分离→全基因组扩增→高通量测序→数据分析。目前单细胞基因组测序技术的发展依然面临两方面的技术挑战：一是易于分离和操作的单细胞分离工具（即第一步）；二是能够稳定复制单个细胞中微小核酸的方法（即第二步）[2]。2.1 单细胞分离从组织中将单个细胞分离出来是单细胞基因组测序的第一步。目前常用的单细胞分离方法主要有：有限稀释法、显微操作法、流式细胞分选术、激光捕获显微切割技术（LCM）、微流控芯片技术等，表1总结了上述提到的单细胞分离方法的原理和优缺点，在使用时可根据不同的科研需求及样品情况综合考虑选择适宜的分离方法[3,4]。表1. 单细胞分离技术分离方法原理优点缺点有限稀释法对细胞进行一系列的倍比稀释，最终使细胞处于单个状态，理论上每μL约1个细胞，然后用移液器吸取相应容积的细胞悬液进行单细胞分离。操作简便；成本低，一般不需要特殊的设备。分离效率低；需要研究人员排除大量空白孔和多细胞孔，费时费力；细胞分离过程依赖梯度计算，容易出现错误。显微操作法在高倍倒置显微镜下，利用显微镜操作器（手动或自动）实现单细胞分离。能够准确地控制单细胞的吸取与释放；可以从不同的发育阶段或多样化的群体分离单个细胞。通量低，需要大量的起始量；细胞特异性由显微镜决定，并利用微量移液管分离，可能不够准确。流式细胞分选术通过流式细胞仪，根据细胞特异性分子标志物或细胞光散射特性，分选出单个细胞或特殊细胞群，实现单细胞分离。通量高；基于细胞表面标志物的特异标记，能够确保特定细胞的分离；利用荧光标记可分离亚群。无法扩展到大规模项目；且需要流式细胞仪，设备昂贵。激光捕获显微切割技术（LCM）在显微镜下，从冰冻/石蜡包埋组织切片（或细胞固定在装配有可以激光脉冲激活的热塑膜的涂片）中分离某一类型细胞群或单个细胞，实现单细胞分离。无需解离组织，制备细胞悬液；能够直观准确、快速地获取单个细胞或单一细胞亚群；能够保留所分离细胞的完整性。需要适当的组织处理（冷冻保存或固定）；显微切割可能存在挑战；小的细胞可能难以分离；可能存在污染。微流控芯片技术通过微流控芯片隔离流动通道中的单个细胞从而达到单细胞分离的目的。通量高；上样体积小；周期短；可根据细胞表面标志物分离特定细胞。细胞大小必须均匀；消耗品昂贵。2.2 全基因组扩增（Whole-Genome Amplification , WGA）全基因组扩增是单细胞基因组测序的第二步。由于单个哺乳动物细胞中DNA的含量一般少于10pg，达不到测序仪的检测要求，因此在测序之前必须进行全基因组扩增（WGA）以获得足够的材料用于后续的文库制备。目前常用的全基因组扩增方法按原理可分为三类（见表2）[5-7]：基于聚合酶链式反应（PCR）的WGA方法{主要是简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)}、多重链置换扩增法（Multiple Displacement Amplification , MDA）和多重退火环状循环扩增技术（Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles，MALBAC）等。表2. 全基因组扩增技术DOP-PCRMDAMALBAC原理基于PCR技术，通过加入部分简并的寡核苷酸引物与模板结合来实现扩增整个基因组的目的。基于恒温核酸扩增技术，恒温条件下，使用一条由6个随机碱基构成的随机引物与模板随机退火；紧接着在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下发生链置换反应，并最终完成扩增。结合了MDA法和PCR扩增法的特点，即由一组随机引物启动扩增（每个引物具有通用引物序列和随机碱基），随机引物与模板均匀杂交，随后在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下发生链置换反应，最终完成扩增示意图特点该方法实现了高度均匀的扩增，产物产量较高，操作较为简单；但仅产生基因组的稀疏覆盖，实验的条件需要较多优化。 MDA可以实现更好的基因组覆盖，产物片段长；但对模板质量要求高，可能产生非特异性产物。一种实现基因组广泛覆盖和均匀扩增的技术，灵敏度高，产物产量高。技术平台：目前，国内外研究机构使用的大规模单细胞测序技术平台主要有五种：Illumina® Bio-Rad® Single-Cell Sequencing Solution、BD Rhapsody™ Single-Cell Analysis System、10x Chromium Single Cell Gene Expression Solution、ICELL8 Single-Cell System和C1™ 单细胞全自动制备系统。国内也有多家企业进军单细胞测序领域，产品包括新格元自动化单细胞处理系统、万乘基因高通量单细胞测序平台、达普生物星海单细胞测序建库系统、墨卓生物高通量单细胞测序平台、德运康瑞痕量单细胞测序平台和原位测序平台等。各个平台各有特点，这里主要简单介绍一下两种应用较多的技术，即10X Genomics 公司的Chromium( 液滴法) 及 BD 公司的Rhapsody( 微孔法)。10x Genomics单细胞测序技术：10X Genomics单细胞测序起源自Drop-Seq技术，应用液滴微流体技术分选单细胞，将单个细胞与含有条形码（Barcode）和引物的凝胶珠一起包裹于油滴中；然后每个油滴中的凝胶珠溶解， 细胞裂解释放mRNA，通过反逆转录产生用于测序的带条形码的cDNA，cDNA在液体油层破坏后进行文库构建，使用测序平台对文库进行测序检测，即可一次性获得大量单细胞的基因表达数据。该平台具有“三高（high）两低（low）”的特点：即通量高，细胞捕获效率高，细胞活性要求高（大于90%），分析时长低，成本低。 图2. 10X Genomics Chromium Controller技术原理示意图3.2 BD Rhapsody单细胞测序技术：BD公司推出的这款Rhapsod™单细胞分析系统采用了Cytoseq分子标签技术，能为单细胞中每个转录本标记特异性分子标签，实现单细胞水平上基因表达谱的绝对定量。同时，将每个细胞标记上特异性细胞标签，实现了高通量平行建库。该技术在基因扩增和后续的测序部分等整体流程与10x Genomics单细胞测序技术相近，主要区别在于起始的单细胞分离和捕获技术。该技术并非基于微流控芯片技术，而是基于蜂巢板技术，基于微孔来保证单细胞的捕获，避免了10x Genomics单细胞测序技术中存在的概率碰撞对捕获效率从影响。细胞悬液经注入孔注入后，自然沉降到反应孔中，随后， 将磁珠同样由注入孔注入，即可在单个反应孔中捕获其中的细胞。微孔和纳米孔方法允许稀释的细胞悬浮液在每孔一个珠子和一个细胞的条件下与寡聚结合珠一起沉降到皮升大小的孔中，从而保证了单孔中是单细胞捕获。 图3. BD Rhapsody技术原理示意图4、应用实例：目前，单细胞基因组测序技术的应用可以归纳为两大类，即应用于人类细胞图谱研究和非细胞图谱研究。单细胞基因组学的优势就在于能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性。自2017年“人类细胞图谱计划”提出以来，单细胞测序技术已陆续揭示了多个组织器官的单细胞图谱，如通过对肾脏肿瘤进行单细胞测序，发现肾肿瘤细胞之间的突变频率和位置不尽相同，每个细胞的突变状态和转录情况也均不相同，表明肾肿瘤更加具有异质性，需要开发更加有效的细胞靶向疗法。2022年发表在Nature杂志上的研究，对人脑血管系统的单细胞图谱进行了分析，描绘出海马和皮质的脑血管细胞组成：内皮细胞、相邻的壁平滑肌细胞 (SMC) 和周细胞、血管周围的免疫细胞和星形胶质细胞等，这些细胞在大脑不同区域存在差异并沿动静脉轴变化，沿动静脉轴的细胞组成异质性产生了大脑健康所必需的功能分段的循环、代谢和渗透特性。揭示了人类大脑血管系统的细胞组成和分子特征，提示了阿尔茨海默病（AD）风险因素在人类中的进化转变，有助于对人类大脑健康基础的了解、疾病机制和治疗靶点的发现[8]。随着单细胞基因组覆盖范围扩大、通量提升以及多组学技术的不断进步，单细胞基因组学技术将为丰富发育谱系树、生殖细胞突变模式、癌症进化、基因组功能和微生物群落的分辨研究等提供策略[9]。参考文献：[1] Xia Y, Gawad C. Bringing precision oncology to cellular resolution with single-cell genomics[J]. Clinical and experimental metastasis, 2022(1):39.[2] Liang J, Cai W, Sun Z. Single-cell sequencing technologies: current and future. J Genet Genomics. 2014 Oct 20 41(10):513-28. doi: 10.1016/j.jgg.2014.09.005. Epub 2014 Oct 18. PMID: 25438696.[3] Wang Y, Navin N. Advances and Applications of Single-Cell Sequencing Technologies[J]. Molecular Cell, 2015, 58(4):598-609.[4] Gross A, Schoendube J, Zimmermann S, Steeb M, Zengerle R, Koltay P. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 2015 Jul 24 16(8):16897-919. [5] Gawad C, Koh W , Quake S R. Single-cell genome sequencing: current state of the science[J]. Nature Reviews Genetics, 2016.[6] Grün D, van Oudenaarden A. Design and Analysis of Single-Cell Sequencing Experiments. Cell. 2015 Nov 5 163(4):799-810.[7] 徐晓丽 吴凌娟.单细胞全基因组扩增技术与应用.[J]生物化学与生物物理进展 .2019.46(4)[8] Yang A C , Vest R T , Kern F , et al. A human brain vascular atlas reveals diverse mediators of Alzheimer's risk[J]. Nature, 2022, 603.[9] Evrony G D, Hinch A G, Luo C. Applications of Single-Cell DNA Sequencing[J]. Annual Review of Genomics and Human Genetics, 2021, 22(1).相关会议推荐：第六届基因测序网络会议来袭！六大会场，含单细胞和空间组学会场，点击下图免费报名！点击链接进入会议官网：https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/geneseq2023/

一个世纪之前，诺贝尔奖得主、德国化学家Paul Ehrlich 曾经说过：如果我们可以设计出特异性靶向某个病原体的化合物，那么，我们就可以在不伤害宿主的基础上杀死这一病原体【1】。多年过去了，尽管Ehrlich尝试了多种方法来寻找特异性肿瘤靶点，但精准抗癌，也就是在不伤害机体的情况下靶向杀伤肿瘤细胞这一概念，似乎仍停留在概念阶段【2】。时隔多年，以免疫细胞修饰为基础的免疫治疗，包括抗体-药物偶联物（antibody-drug conjugates，简称ADCs）、双特异性T细胞衔接器（bispecific T cell engagers，简称BiTEs）和嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T cells，简称CAR-T）似乎是现今的新方向。有报道指出，靶向CD19的CAR-T疗法，可以将一些B细胞淋巴瘤的治愈率提高至43%～71%【3】，但是，有40%患者出现一定程度的神经损伤。这一“脱靶效应”很可能是由其他表达CD19的细胞类型引起的【4】。事实上，作者通过提取数目稀少的血脑屏障壁细胞，并进行全基因组单细胞测序确定，上述CAR-T疗法靶向B细胞淋巴肿瘤的同时，也会靶向这些壁细胞。这也说明，单细胞全基因组测序这一方法，不但可以预测免疫治疗的脱靶效应，还可以以数据为基础分析出特异的靶标。2021年12月13日，来自美国斯坦福大学Caleb A. Lareau，Ansuman T. Satpathy和来自Cartography 公司的Kevin R. Parker 在Cancer cell上发表题为Charting the tumor antigen maps drawn by single-cell genomics的评论性文章，全面展示了这一研究方法。在概念上，作者认为，寻找和确定免疫治疗的靶点应该基于数据。下图展示了通过结合大尺度但细胞图谱和特定肿瘤分析来确定抗原靶点。高通量的单细胞全基因组测序数据库可以提供肿瘤细胞抗原的潜在靶点以及这些靶点是否存在于其他细胞上。接下来，作者阐述了目前精准抗癌的现状和存在的问题。首先，目前在临床上精准抗癌的靶点主要有三类：一是在肿瘤细胞和正常体细胞上同时表达的细胞特异性标签，比如上述针对B细胞的CD19。这一类目前应用最为广泛，并且，如果其对应的体细胞不算十分重要的话，这一诊疗方案可以说是行之有效；二是与正常体细胞相比，在肿瘤细胞上过表达的分子，比如HER2。靶向这类分子可以使得杀伤作用更为精准和强大，并且，其过表达程度，还可以表征肿瘤发展水平；三是特异性表达在肿瘤细胞上的分子，比如1997年发现的NY-ESO-1【5】。当然，高通量基因组学数据库显示这一分子还表达在免疫豁免器官和组织，比如睾丸和胎盘。这也就是说，仅通过传统手段来确定表达靶标分子的细胞类型不够精确，还需要高通量单细胞基因组数据库来进行有力补充。其次，上述数据库可以用来预测和减低免疫治疗的脱靶效应所带来的细胞毒性。如上述靶向CD19治疗B细胞淋巴瘤案例所示，免疫治疗常常会出现脱靶效应。虽然研究脱靶效应对病人的副作用这方面至关重要，但是从单细胞基因组学分析来确定特定免疫疗法对正常体细胞的影响也十分必要。接下来，作者表明，单细胞全基因组测序这一方法也适用于表达量十分稀少的细胞类型，比如CD4+T细胞，CD4的RNA水平很低，但是蛋白质水平却很高，这一类分子需要高通量数据库进行修正。最后，作者提出了单细胞全基因组测序所面临的挑战：一是如何界定某一类型细胞重要与否，并且，随年龄、性别等影响，其重要性是否有所区别。二是如何确定一标准，使得某分子在肿瘤细胞与体细胞的表达量超过这一标准，才可以认定为是潜在靶标。三是影响抗原表达水平的因素都有什么。最后，理论上可行的靶标在临床上也可能出现各类未知问题。综上所述，作者给出了有别于组织学水平和单一突变水平研究肿瘤以及肿瘤治疗的方法，也就是基于高通量单细胞全基因组测序和图谱数据分析方法。并预测，这一方法可以在预测免疫治疗靶标和临床精准抗癌方面发挥重要作用。原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ccell.2021.11.005

多细胞生物由复杂的层次性机制来维持稳态。在组织层面上，这种稳态通常由细胞内基因调控网络和细胞外环境中各种信号介导的相互作用共同维持。因此，具有空间分辨率的单细胞组学技术对理解组织微环境具有重要意义。现在国际上已有多种空间组学方法(如转录组、蛋白组)来测量单细胞级别的空间信号分布，但是仍然缺乏空间代谢组的分析方法。　　SEAM方法采用高空间分辨质谱成像结合机器学习算法，实现了组织原位代谢异质性可视化、单细胞核图像识别、代谢特征信息提取以及单细胞的聚类、差异化分析，从而能够让研究者系统的解析组织中单细胞的“代谢指纹图谱(metabolic fingerprint)”(图1)。由于器官或组织中的单个细胞的代谢物图谱存在明显的空间分布的异质性，因此，定位单个细胞在组织网络中的位置、区分相关代谢物的指纹图谱差异、确定重要代谢物的分子组成有重要意义。　　图1.SEAM在单核分辨率下捕捉到空间代谢异质性　　为了验证新方法，清华大学张奇伟、张新荣团队解析了野生型小鼠肝脏组织中的空间代谢异质性，发现了肝细胞代谢异质性亚群。这一发现和前人通过蛋白或者基因表达所验证的肝组织分区现象(Liverzonation)有着高度一致(图2)，有效证明了SEAM方法的可靠性和准确性。　　图2.SEAM在小鼠肝脏中通过代谢指纹图谱分析发现Liverzonation现象　　作者还对人肝纤维化中的代谢异质性进行了空间代谢组和空间转录组联合分析。发现在肝纤维化样本中存在有两种代谢差异的肝细胞亚群，它们和纤维化区域的距离在不同样本间存在有统计学差异(图3)。通过代谢组和转录组的共同分析，发现其中的存在有谷丙酰胺的上调以及其对应代谢相关的跨膜转运蛋白的基因表达上调。虽然单细胞转录组的研究已经取得长足进展，与转录组及其表型研究密切相关的代谢组研究在单细胞水平目前还缺少方法。本文提出的“SEAM”方法，系统解析了组织空间中的单细胞代谢组，对于整个单细胞技术领域的进步具有重要的推进作用。　　图3. SEAM在人类肝纤维化样本中发现代谢极性　　相关成果以“SEAM是一个研究组织微环境的单细胞核空间代谢组学方法”(SEAM is a spatial single nuclear metabolomics method for dissecting tissue microenvironment)为题于10月4日发表于《自然方法》(Nature Methods)。论文第一单位是清华大学自动化系。共同通讯作者是清华大学北京信息国家研究中心、医学院张奇伟教授，清华大学化学系张新荣教授，清华大学原副研究员陈阳(现中国医学科学院基础医学研究所研究员)。共同第一作者为清华大学自动化系博士生原致远、生命科学学院博士生周启明、化学系博士生蔡乐斯。中日友好医院潘林教授在本工作中参与了病理切片相关实验指导和细胞类型鉴定。北京协和医院郑永昌教授提供了临床样本。清华大学北京市中医药交叉研究所李梢教授为项目研究提出积极建议。项目由国家重点研发计划，国家自然科学基金以及北京信息国家研究中心基金等项目提供经费支持。　　论文链接：https://www.nature.com/articles/s41592-021-01276-3

全日程更新|8月30日开播！31位嘉宾云聚第六届细胞分析网络会议iCCA2023（点击查看）8月31日，第六届细胞分析网络大会（iCCA2023）特设【单细胞分析技术】专题会场，12位嘉宾在线分享！在线免费向听众开放报名，欢迎报名参会！报名链接: https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/icca2023  （点击报名）分会场设置日期上午下午08月30日类器官与器官芯片08月31日单细胞分析技术（上）：微流控/质谱单细胞分析技术（下）：测序/代谢组学09月01日细胞治疗产品的CMC质量控制分析细胞成像分析技术iCCA 2023 交流群 精彩报告 速览 微流控芯片质谱联用细胞药物代谢分析方法研究林金明 清华大学 教授【摘要】细胞是生物体结构和功能的基本单位。了解细胞的组成、结构和功能，探索细胞的生命活动，对于人类认知与掌控生物体生命活动的基本规律有着十分重要的意义。微流控芯片技术，结合先进的质谱检测、分子成像、生物信息学等技术，为细胞生物学研究提供了强有力的研究平台，也为改变细胞生物学的研究方式提供了可能。本次讲座将结合我们研究组近期的科研工作，简要介绍微流控芯片质谱联用技术在细胞药物代谢领域的进展和研究成果，探讨微流控芯片技术在中药的代谢分析研究中所面临的挑战和发展方向，为扩大其在生物医学领域的研究和应用提供参考和可能的思路。 基于有源数字微流控的单细胞分选和操控系统马汉彬 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 研究员【摘要】 相对于传统数字微流控，有源矩阵数字微流控基于薄膜半导体技术，其阵列规模、样本体积和操控精度均有指数级提升。该平台能够高效的生成大规模微滴阵列，无需借助微纳结构，便可实现单细胞微滴样本生成，并在二维平面内进行样本的可编程控制。高通量单细胞分泌分析技术研究陆瑶 中国科学院大连化学物理研究所 研究员【摘要】分泌是细胞的基本行为，介导通讯、免疫保护等功能。由于细胞存在异质性，往往只是细胞群中的小部分细胞主导分泌相关功能，群体细胞检测无法分辨这些多功能性细胞，必须发展单细胞分析工具进行相关研究、应用。但传统单细胞分泌分析技术存在检测信息不全面的不足，难以满足研究、应用需求。基于此，我们利用微流控芯片发展单细胞分泌因子多维、动态、互作等创新分析技术，显著提高了当前活体单细胞分泌分析技术检测能力，在药物/疫苗开发、疾病诊断、免疫学研究等领域具有重要的科学意义和十分广阔的应用前景。实时单细胞多模态分析仪的应用丁琳 江苏瑞明生物 高级产品经理【摘要】实时单细胞多模态分析仪的应用案例 （1）助力药物开发和药物载体开发； （2）检测细胞代谢标志物，信号分子和酶活为生物传感器开发提供表征工具。。单细胞结构脂质组学及生物医学应用马潇潇 清华大学 长聘副教授【摘要】单细胞分析是揭示细胞间异质性的关键技术，对基础生物学研究，疾病标志物筛查及新药研发均有重要意义。目前，单细胞脂质组分析仍面临诸多技术挑战。本报告介绍本团队在单细胞结构脂质组技术及应用方面的最新研究进展。单细胞固有电学特性高通量流式分析技术研究赵阳 中国科学院微电子研究所 副研究员【摘要】面对单细胞固有电学特性测不快、传感原理不明等难题，我们提出一种基于交叉压缩通道的检测方法，将检测通量提升了1万倍。并设计了一种基于物理模型快速求解器的实时阻抗流式细胞分析仪（piRT-IFC），实现了“细胞进，结果实时出”的全流程自动化处理能力，并验证其在未知细胞样本上具有相较神经网络加速方法更好的泛化能力。基于单细胞测序的肿瘤免疫研究：从机制到疗效预测胡学达北京百奥智汇科技有限公司 副总裁【摘要】 靶向 CTLA4、PD-1 和 PD-L1 等免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint inhibitor, ICI）的发现和临床应用彻底改变了癌症临床治疗的局面。免疫治疗为抗肿瘤带来突破，但只有部分患者发生响应，建立响应与持久性精准预测体系是目前该领域最关键的科学与临床问题。通过单细胞组学研究ICI治疗过程中肿瘤微环境免疫细胞动态演化规律与互作特征，能够发现具有抗肿瘤特异免疫响应驱动作用的细胞类型与分子标记。我们鉴别了不同患者对PD-1治疗不同耐药机制，寻找在响应或耐药患者中差异富集的细胞类型和特征表达基因，作为克服PD-1单抗耐药的治疗靶点创新智造助力单细胞组学标准化和规模化左亚军 深圳华大智造科技股份有限公司 产品市场中心产品经理【摘要】 创新智造助力单细胞组学标准化和规模化 1. MGI 单细胞组学全流程解决方案 2. 单细胞行业进入湿实验标准化时代 3. DNBelab C系列单细胞新品和应用案例。新一代中通量FISH技术、自动化仪器开发及其在精准诊断中的运用曹罡 深圳理工大学 教授【摘要】生物大分子（蛋白质、DNA、RNA等）在组织、细胞内的精确定位对生命体维持正常功能扮演着重要角色。在单细胞水平高通量的检测生物大分子的原位空间组学新技术对理解生命的重要生理功能及疾病的发生发展有着重要意义。目前从一代测序到高通量基因测序技术和单细胞测序都需要从细胞、组织提取核酸，丢失基因的空间位置与病理、组织学特征等信息，只能获得一个维度的基因序列信息。空间基因原位测序与原位检测技术可以整合基因序列信息与空间位置信息，必将对基因测序与病理诊断有着巨大的推动作用！近年来我们实验室开发了相关的高通量单细胞生物大分子（蛋白质、DNA、RNA等）空间组学和新一代FISH解析技术的开发及其仪器开发。此外，我们也将这些技术运用到肿瘤精准诊断中，以期推动肿瘤的精准治疗。单细胞核酸编码扩增分析赵永席 西安交通大学生命分析化学与仪器研究所 教授【摘要】团队开发的肿瘤类器官精准药物芯片筛选（Tumor Organoid Precision Medicine On-chip Screening Platform, TOPMOS）平台可在短时间内高通量培养出大小可控、均一性高的肿瘤类器官，实现高仿生化模拟体内微环境和高精度模拟体内药代动力学，能与现有常规检测设备匹配，实现多药物多浓度的快速药敏测试。单细胞转录组学解析前列腺管腔干细胞身份属性以及谱系可塑性郭旺昕 深圳湾实验室 博士后（高栋课题组）【摘要】前列腺成体干细胞身份属性的解析对研究前列腺组织的损伤修复和肿瘤起始都具有重要的意义。然而正常前列腺成体干细胞的身份属性存在巨大的争议，是前列腺研究领域悬而未决的重要科学问题。因此，我们利用单细胞转录组测序技术系统分析了35129个正常成年雄性小鼠前列腺细胞，发现前列腺管腔细胞可以分为Luminal-A、Luminal-B和Luminal-C三个细胞亚群。进一步阐述了Luminal-C细胞通过自我更新和分化维持前列腺管腔细胞谱系，证实了Luminal-C细胞可以作为前列腺肿瘤的起始细胞。单细胞测序技术与应用解析崔淼 深圳湾实验室 工程师/测序平台负责人【摘要】近几年来，单细胞测序技术发展迅速，与传统测序方法相比起来，其对解决生物材料的低获取量和生物异质性等问题尤为重要。凭借这一技术，研究者们可在单细胞水平上面研究生物进程和一些疾病的发生发展，包括肿瘤进化和癌变、早期胚胎发育、神经细胞异质性等。本次报告将从多方面逐一介绍单细胞测序技术：包括单细胞测序技术概念及发展历程、单细胞测序技术原理及实验设计、单细胞测序技术操作流程及注意事项、单细胞测序条件选择、单细胞测序技术应用等。温馨提示:1) 报名后，直播前一天助教会统一审核，审核通过后，会发送参会链接给报名手机号。填写不完整或填写内容敷衍将不予审核。2) 通过审核后，会议当天您将收到短信提醒。点击短信链接，输入报名手机号，即可参会。

抗原特异性对T细胞功能至关重要，但由于技术局限，其在T细胞高通量多组学分析中常常被忽略。美国德克萨斯大学奥斯汀分校的研究团队揭示了一种用于抗原特异性CD8+T细胞的高通量、高维度单细胞分析方法。该研究成果于近日发表在《Nature Immunology》上，题为：High-throughput and high-dimensional single-cell analysis of antigen-specific CD8+ T cells。　　研究人员提出了一种对T细胞抗原受体（TCR）高通量、高维度的测序方法（TetTCR-SeqHD）,该方法可同时分析数万个单细胞的同源抗原特异性、TCR序列、靶向基因表达和表面蛋白表达。研究人员使用已知抗原特异性、TCR序列的人类多克隆CD8+T细胞，验证该方法对抗原特异性的检测准确度超过98%。研究还评估了抗原特异性的CD8+T细胞、带有病原体靶点表型特征的CD8+T细胞的基因表达水平和表型差异。　　总之，TetTCR-SeqHD是一种分析人类和小鼠T细胞反应的有效方法,极大地提升了人们对多种疾病环境中 T 细胞免疫反应的认识。 　　论文链接：　　https://www.nature.com/articles/s41590-021-01073-2　　注：此研究成果摘自《Nature Immunology》期刊，文章内容不代表本网站观点和立场，仅供参考。

细胞异质性作为细胞系统中一种普遍存在的现象，受到生物研究领域的日益关注。在传统的群体分析中，单个细胞的独特差异往往被整体的平均值所掩盖，而这些被忽略的细节恰恰构成了细胞分化过程中的关键线索。随着微阵列芯片、核酸测序、质谱等技术的进步，对单一细胞进行基因组、转录组、代谢组和蛋白组分析已不再遥不可及。特别是核酸扩增技术的进步极大地推动了基因组、转录组在单细胞层面的测序技术的应用。尽管取得了这些进步，但在单细胞层面对蛋白质和代谢物的分析仍然面临重大挑战，这主要是由于它们的量有限且缺少有效的扩增手段。本文提出了一种新的策略，通过一次性单细胞蛋白质组和代谢组分析（scPMA），可以在单次LC-MS/MS分析中同时获取单个细胞的蛋白质和代谢物信息。通过这种策略，研究人员能够整合单个细胞的多组学数据，以深入理解细胞内部相互作用的网络和调控细胞状态的复杂机制。scPMA策略共包括以下三个部分（图1）：单细胞捕获及分离、纳升级样品预处理、一次性LC注入和质谱检测。前两个环节都是基于课题组前期自制的机械装置操作完成的，最后一部分才是scPMA策略的亮点。在常规分析流程中，由于蛋白质组和代谢组在物理化学特性上的根本差异，它们通常需要匹配不同的质谱检测技术。因此，在传统的样本预处理阶段，蛋白质和代谢物会被分离，随后各自经历特定的处理流程，并最终分别进行LC-MS/MS检测。然而，这些额外的分离和处理步骤不仅增加了分析的复杂性，而且往往不可避免地会导致样本的损失，特别是在处理单细胞水平的微量样本时，这种损失尤为显著，可能对研究结果的准确性和可靠性造成影响。基于此，作者希望能够开发一种易于使用的方法来实现同一单细胞个体的蛋白质组和代谢组同步分析。图1 一次性单细胞蛋白质组和代谢组同步分析示意图实际上，代谢物和蛋白酶切后的肽段在C18反相色谱柱上的保留时间是存在差异的。如图2所示，在作者设置的45 min梯度下，大部分A549细胞酶切的肽段在9至17 min的范围内就已流出（图2a），而此时流动相中乙腈的最高含量仅为40%。而A549细胞产生的代谢物则主要分布在17 min之后，只有极少部分是在17 min以前流出（＜10）（图2b）。导致这些现象的根本原因是肽段与代谢物之间疏水性的差异，因此，该策略更适合蛋白组与有一定疏水性的代谢物分析。得益于C18的有效分离，可以在色谱梯度的不同时间段针对不同的样本成分（肽段/代谢物）设置不同的质谱检测参数（图2c）。有效的色谱分离加与之匹配的双区域质谱检测便可实现一次性单细胞蛋白质组和代谢组双重分析。与之前的单组学的结果相比，scPMA策略在定量深度上并无明显差异（图2d-f）。图2 单蛋白质组和代谢组分析与scPMA的性能比较 通过scPMA策略，研究者们能够对单个肿瘤细胞（包括A549、HeLa和HepG2细胞）进行双重组学分析，平均定量了816、578和293个蛋白质以及72、91和148个代谢物。并利用UMAP聚类和随机森林机器学习模型，基于单细胞的蛋白质组、代谢组和双重组学信息，实现了对细胞类型的初步分类（图3、4）。根据结果可得知，细胞在代谢组中的异质性要大于蛋白组。图3 scPMA策略分析单个肿瘤细胞（包括A549、HeLa和HepG2细胞）图4 基于单细胞的蛋白质组、代谢组和双重组学信息对细胞进行分类随后，作者还利用scPMA方法在单细胞水平上研究了多柔比星对肿瘤细胞的诱导作用（图5）。对比药物处理组的各个单细胞样本发现给药后不同的单细胞在蛋白质表达上存在着异质性，这也是在群体分析中无法观察到的现象。与未给药的细胞相比，给药组共鉴定出255个差异蛋白(图5b、c)，一些肺癌细胞中过表达的蛋白显著降低。大部分的差异蛋白涉及的通路与DNA、染色质、核小体的合成有关（图5g）。同样，给药组和未给药组中鉴定出的代谢物也被用于UMAP聚类(图5d)和差异分析。差异分析结果(图5e、f)显示，93种代谢物有差异表达。其中，多柔比星仅在给药组检测到。值得注意的是，在给药组的各个细胞中，多柔比星丰度有明显的离散分布，甚至有10倍的丰度差异。这一结果表明不同的细胞个体具有不同的药物吸收水平，从而表现出明显的细胞异质性，这可能为进一步深入探索提供启发。基于差异蛋白质组和代谢组信息，利用MetaboAnalyst 5.0进行联合通路分析，分别富集出62条和234条相关通路。其中有37条显著相关的通路涉及的差异蛋白和代谢物与核糖体、DNA复制等药物作用机制有关（图5i）。图7.氘代差异分析流程示意图这些结果展示了scPMA策略在单细胞分析中的潜力，尤其是在药物干预研究中的应用前景。同时，这项工作也证明了一次性获取单细胞蛋白质组和代谢组信息的可行性，为未来在细胞分化、衰老和肿瘤免疫等领域的研究提供了新的工具。本文2024年发表在Analytical Chemistry上，One-Shot Single-Cell Proteome and Metabolome Analysis Strategy for the Same Single Cell。该文章的通讯作者是来自浙江大学化学系微分析系统研究所的方群教授。

p style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="text-indent: 2em font-size: 16px "/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="text-indent: 2em text-align: justify "10月28日，中科院城市环境研究所崔丽研究员团队在期刊《Analytical Chemistry》上发表耐药基因水平基因转移最新研究。文章标题为“/spani style="text-indent: 2em text-align: justify "Phenotypic Tracking of Antibiotic Resistance Spread via Transformation from Environment to Clinic by Reverse D2O Single-Cell Raman Probing”。/ibr//ppimg src="https://img1.17img.cn/17img/images/202012/uepic/6221444b-ddc8-474b-b2fc-01abdfc691fd.jpg" title="企业微信截图_20201216144900.png" alt="企业微信截图_20201216144900.png" style="text-align: center max-width: 100% max-height: 100% "/br//pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="font-size: 16px "原文链接：/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "a href="https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.0c03218?ref=pdf" target="_blank"span style="text-indent: 2em font-size: 16px text-decoration: underline "https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.0c03218?ref=pdf/span/a/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(0, 0, 0) "strong【研究背景span style="text-indent: 2em "】/span/strong/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="font-size: 16px font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai "微生物耐药是一个危害公共卫生安全的全球性问题。耐药基因（antibiotic resistance gene，ARG）在环境或临床中出现并传播扩散。在这一过程中，水平基因转移（Horizontal gene transfer，HGT）现象起着不可忽视的作用。HGT的一个主要途径是转化（transformation）——受体细菌摄取胞外DNA（extracelluar DNA，eDNA）。这些eDNA多是细菌主动分泌或者裂解过程中释放的质粒DNA以及片段化DNA，常常携带着ARG。环境充当着ARG储库的角色，威胁着临床治疗。因此了解ARG从环境到临床转移的过程是必要的。/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="font-size: 16px font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai "在上述问题的研究中，常规方法依赖耐药菌的选择性培养或是报告基因标记eDNA技术。前者需要已知被筛选微生物的培养条件，且无法筛选出耐药但扩增不活跃的微生物。后者需要对eDNA等进行改造，不能反应实际的HGT情况。/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="font-size: 16px font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai "近年新兴了一种联合正向D2O标记的单细胞拉曼光谱方法用于微生物抗性区分。微生物利用环境中的D2O合成相关的生物分子，可以通过拉曼光谱的C-D带（2040-2300 cmsup-1/sup）进行表征。抗性环境中敏感菌与耐药菌会表现出不同D2O摄入，进而表现出不同的C-D峰情况。然而微生物不仅摄入D2O，还会摄入其他含H元素的营养物质，这导致单位时间C-D谱带的增长较低。同时较短时间的孵育也降低了该方法的灵敏度。span style="font-size: 16px font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai color: rgb(0, 112, 192) "strong作者团队改进并提出了反向D2O-单细胞-拉曼检测技术（reverse D2O single-cell Raman (Raman-rD2O) probing，Raman-rD2O）。微生物预先在D2O中孵育，后置换为含抗生素的H2O环境孵育并被检测。作者确定了该方法的有效性并利用该方法研究了HGT过程.。/strong/span/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="font-size: 16px font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai "/span/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202012/noimg/94849f8b-b936-4174-925c-1ed3894541ed.gif" title="ac0c03218_0007.gif" alt="ac0c03218_0007.gif"//pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(0, 0, 0) "strong【实验设计span style="text-indent: 2em "】/span/strong/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "这项研究中，为了评价微生物耐药性，作者建立了Raman-rD2O方法，确定了其有效性，以及灵敏度。之后在大肠杆菌体系中确认了水平基因转移的情况。接着评价了与来自于复杂环境中质粒共孵育的大肠杆菌对各抗生素（meropenem，vancomycin，ampicillin，cefradine以及ciprofloxacin）的耐药情况，并确认了该方法比传统培养方法更加准确。最后提出了一种用于反映ARGs传播风险的计算方法。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(0, 0, 0) "strong【结果讨论span style="text-indent: 2em "】/span/strong/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strongRaman-rD2O方法区分耐药菌以及敏感菌的灵敏度/strong/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "对colistin耐药的FIT10（B. cereus）以及colistin敏感的DH5α（E. coli）菌株进行D2O培养12h。转移至含抗生素colistin的无D2O环境进行培养，取不同时间点进行拉曼图谱采集，结果如图 1。在C-D峰处可以看出，耐药菌FIT10峰强逐渐变低，非耐药菌DH5α无明显变化。/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202012/uepic/324d314b-6c4d-41d3-97cd-3f0d1f1ad776.jpg" title="002.jpg" alt="002.jpg"//pp style="text-align: center "strong图1/strong/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "图 1. 预先标记同位素D微生物在含0.125 mg/L colistin的LB培养基中培养0、0.5、1、4、8小时后的单细胞拉曼光谱（a）耐药菌FIT10，（b）敏感菌DH5α。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "采集含colistin培养条件下FIT10以及DH5α的单细胞拉曼图谱并统计C-D比值（CD/(CD + CH)），结果如图 2a-Ⅰ。另外比较了含ampicillin条件下的DH5α-Ampr以及DH5α数据，如图 2a-Ⅲ。可以看出该方法能够区分耐药菌以及敏感菌，且适用不同抗生素。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "从图 2a-Ⅱ/Ⅲ以及2b数据，可以看出正向标记方法4h后才能观察到差异。因此反向标记方法是优于正向标记的。/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 394px height: 526px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202012/uepic/3db3bf0c-fe48-4a7e-8d06-4679a9ed238e.jpg" title="003.jpg" alt="003.jpg" width="394" height="526"//pp style="text-align: center "strong图2/strong /pp style="text-align: justify text-indent: 2em "图 2. (a-Ⅰ，a-Ⅲ) 反向D2O方法下，不同时间点的colistin耐药FIT10、ampicilin耐药DH5α-Ampr以及DH5α的C-D比值统计结果；(a-Ⅲ，a-Ⅳ) 正向D2O方法下结果；(b) 1× MIC抗生素浓度下培养1h，反向D2O、正向D2O的单细胞拉曼图谱C-D区域结果。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strongspan style="text-indent: 2em "利用Raman-rD2O方法揭示转化过程中ARGs的水平基因转移/span/strong/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "作者比较了实验组JM109（E . coli）以及对照组DH5α、DH5α-Ampr 菌C-D比值。JM109预先与携带bla基因（编码抗ampicilin蛋白）的pMD19-T质粒共孵育。从图 3可以看出，DH5α组维持高的C-D比值，DH5α-Ampr 组比值降至6.4%以下。而JM109组分为了高比值群体以及低比值群体。这意味着JM109组中部分微生物获得了bla基因并表达，从而能在含ampicilin环境中进行代谢生长。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strongHOOKE单细胞分选仪助力耐药基因水平基因转移研究/strong/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "为了验证这一假设，作者利用strong长光辰英科仪（HOOKE instruments）的单细胞分选仪（PRECI SCS）/strong，对各样品进行了单个细胞分选。对分选的单个微生物进行全基因组扩增后，通过PCR验证bla基因的携带情况。从图 3b可看出，DH5α组无bla基因，DH5α-Ampr 组携带bla基因，部分JM109组携带bla基因。这一结果印证了bla基因转移的假设。/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202012/uepic/32f0c549-ecc1-41a1-a8b5-dc7775175666.jpg" title="006.jpg" alt="006.jpg"//pp style="text-align: center "strong长光辰英科仪（HOOKE instruments）单细胞分选仪HOOKE PRECI SCS/strong/pp style="text-align: center "a href="https://www.instrument.com.cn/zc/1835.html" target="_blank"span style="text-decoration: underline "（点击进入单细胞分析专场查看更多仪器信息）/span/a/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "作者统计了不同采集个数下耐药菌个数并计算了转化频率（Transformation Frequency = 转化菌个数/（10× 拉曼采集总数），10为微生物1h时扩增倍数）。采集数目大于40时，转化频率趋近4.33 × 10sup-2/sup。该结果与传统平板培养方法得到的5.07 × 10sup-2/sup一致。/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 398px height: 795px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202012/uepic/5d4cd009-861e-4257-864f-d39b0a4467bb.jpg" title="004.jpg" alt="004.jpg" width="398" height="795"//pp style="text-align: center "strong图3/strong/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "图 3. （a）预标记同位素D的E. coli DH5α（敏感对照），E. coli DH5α-Ampr（抵抗对照）以及转化了含bla基因质粒的接受菌E. coli ，经过含ampicillin的LB培养基孵育1h，采集拉曼光谱并统计C-D比率。每个点对应一个拉曼结果。阈值6.4%为未经过D标记的抗性转化子的C-D比值的平均值+3倍标准偏差；（b）PCR产物（针对质粒上bla基因）的电泳结果，1-3道为高C-D比值的敏感接受菌，4-6为小于10% C-D比值的耐药接受菌，7为不含质粒的E. coli DH5α，8为含bla基因的E. coli DH5α-Ampr；（c）质粒（携带bla基因）的转化频率（线）以及转化频率的标准偏差（柱）。利用单细胞Raman-rD2O方法对不同拉曼图谱采集个数下结果进行了统计。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong通过单细胞Raman-rD2O评价复杂环境中质粒介导的eARGs转化现象/strong/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "作者提取了土壤中的质粒并与E. coli共孵育。通过单细胞Raman-D2O，分析了不同抗生素下（meropenem，vancomycin，ampicillin，cefradine以及ciprofloxacin）的拉曼C-D比值。从图 4a可以看出，ampicillin，cefradine以及ciprofloxacin组出现了水平基因转移现象。考虑到土壤等环境中质粒对受体微生物增殖能力的影响，不同质粒编码导致同一抗性等问题，作者引入了传播效率（Spread Efficiency = 转化菌个数/拉曼采集总数）来评估传播风险。就图 4b结果来说，传播效率ampicillin（1.5 × 10sup-1/sup） cefradine（8.6 × 10sup-2/sup）和ciprofloxacin（6.7 × 10sup-2/sup） meropene（0）m和 vancomycin（0）。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "作者同时计算了Raman rD2O方法的转化效率，ampicillin (1.9 × 10sup-3/sup) ciprofloxacin (5.9 × 10sup-4/sup) and cefradine (8.8 × 10sup-4/sup) meropenem and vancomycin (0) 。而传统平皿培养方法下的转化效率数值小于上述80-100倍。传统方法低估了HGT的程度，一方面存在携带抗性基因但在极端环境下不可培养鉴定的微生物（viable but nonculturable，VBNC），另一方面存在接受质粒导致扩增速率大幅降低（1000倍）的微生物。而在传统方法中过夜培养后，这种差异变得更加的明显。/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202012/uepic/59c22524-2c5b-489a-8645-ba9dd52fd408.jpg" title="005.jpg" alt="005.jpg"//pp style="text-align: center "strong图4/strong/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "图 4. （a） E. coli DH5α（敏感对照）C-D比值，以及接受菌E. coli 的C-D比值。接受菌经同位素D预标记后，与从土壤提取质粒进行共孵育。后分别在meropenem，vancomycin，ampicillin，cefradine以及ciprofloxacin条件下孵育1h。每一个点对应一个单细胞拉曼图谱。C-D比值小于6.4%的为不带D标记的耐受转化子；（b）携带抗meropenem，vancomycin，ampicillin，cefradine以及ciprofloxacin基因的质粒的传播效率。星号表示比较具有统计学意义（单因素方差分析ANOVA，P 0.001）。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(0, 0, 0) "strong【结论span style="text-indent: 2em "】/span/strong/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "利用单细胞拉曼反向D2O检测方法能够可靠且快速的从表型上追踪耐药从环境到临床的扩散。方法具有很高的灵敏度，能够在大量受体菌种识别出那些少量的抗性转化子。单细胞水平的检测避免了繁琐的培养过程，可以直接计算传播效率，能够表征临床相关抗生素的不同风险。该方法后续未来可用于破解影响抗性质粒转移以及持续的因素。通过与基因型研究的联系，能更好的理解环境质体（environmental plastidome）传播风险。也是一种研究HGT机制的新手段。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "strong关于作者/strong/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 134px height: 170px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202012/uepic/698827c5-ef1f-459f-935d-7b76ee9361ab.jpg" title="459b1093-fe12-4d67-bfb0-17b9f500ce02.jpg" alt="459b1093-fe12-4d67-bfb0-17b9f500ce02.jpg" width="134" height="170"//pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai "崔丽 (Li Cui)，研究员，博士生导师，国家优秀青年科学基金获得者，中科院青年创新促进会会员。2002年获厦门大学化学系学士学位，2008年获厦门大学理学（物理化学专业）博士学位。2008.9-至今在中科院城市环境研究所工作，2010. 10评为副研究员，2019.01评为研究员。英国牛津大学（2015.8-2016.2），兰卡斯特大学（2015.2-2015.7）和瑞士伯尔尼大学访问学者（2009.11-2010.2）。至今已在化学和环境国际主流刊物J. Am. Chem. Soc., Anal. Chem.（7篇）, Environ. Sci. Technol., Water Res，J Mem Sci, Soil Biol. Biochem，J Phys Chem等发表论文45篇。先后承担国家自然科学基金项目5项，科技部项目1项，省市基金3项。strong研究领域：/strong环境分析化学（微生物为主），尤其是利用单细胞拉曼/表面增强拉曼光谱，并与稳定同位素标记技术联用，开展环境微生物的研究，如抗生素抗性、氮磷微生物利用过程、生物膜、纳米毒性等。/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "strong关于长光辰英/strong/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "长春长光辰英生物科学仪器有限公司（长光辰英科仪，Hooke Instruments）成立于 2017年，坐落于风景秀美的塞外春城长春，由海外归国团队、长春奥普光电技术股份有限公司（上市公司）、上海合森生物科技有限公司和自然人等股东投资设立的高技术企业，注册资金 3350 万人民币，拥有自主知识产权，主要开展光学、生物学、医学等领域科学仪器的研发、生产、销售及技术服务等工作。/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 387px height: 272px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202012/uepic/3d0c783e-ca60-46fb-9bd0-1d6225cdfed8.jpg" title="hooke instruments 长光辰英-仪器信息网.jpg" alt="hooke instruments 长光辰英-仪器信息网.jpg" width="387" height="272"//pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="text-indent: 2em "辰英科仪自主研制的单细胞分选仪PRECI SCS具有独特的可视化分选功能，所见即所得，精准实现目标细胞的逐一分离。采用独特的激光与物质相互作用原理，对于复杂生物样本中形态各异的细胞，可实现非标记状态下的精准分离。对于百纳米级的单个微生物细胞也同样适用。/span/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202012/uepic/1d280178-fb1f-4040-bbbc-fa069b8e6821.jpg" title="006.jpg" alt="006.jpg"//pp style="text-align: center text-indent: 0em "strong图5. 单细胞分选仪HOOKE PRECI SCS/strong/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 343px height: 196px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202012/uepic/571c4847-8a4f-4ce9-a1ca-cf9eeabdab49.jpg" title="微信图片编辑_20201216145515.jpg" alt="微信图片编辑_20201216145515.jpg" width="343" height="196"//pp style="text-align: center text-indent: 0em "strong图6. 拉曼单细胞分选仪HOOKE PRECI SCS-R300/strong/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "PRECI SCS具有可视化、精准、广泛适用等特点。分选过程不依赖标记，可与形态、拉曼、荧光等多种识别方式结合，多种机型可选，满足不同应用需求。搭载潜心研制的HOOKE IntP智能软件，实现单细胞图像智能识别、一键自动分选、全自动细胞获取等。设备操作流程简易，为单细胞测序、未培养微生物开发、工程细胞筛选、细胞图谱绘制等研究提供完美解决方案，助力前沿科学研究。strongspan style="font-size: 14px color: rgb(165, 165, 165) "（文源：长光辰英）/span/strong/p

p style="text-indent: 2em "1952年，美国细胞生物学家威尔逊曾提出，“一切生命的关键问题都要到细胞中去寻找答案。”纵观近50年来荣获诺贝尔奖生理学或医学奖和化学奖的重大突破，70多个都与细胞生物学密切相关。/pp style="text-align: center text-indent: 2em "img title="20197282317511500.jpg" style="max-height: 100% max-width: 100% " alt="20197282317511500.jpg" src="https://img1.17img.cn/17img/images/201907/uepic/8e8f4b00-dde2-40b2-8c13-4213c687f8ec.jpg"//pp style="text-align: center text-indent: 0em "span id="_baidu_bookmark_start_182" style="line-height: 0px display: none "?/span研究团队进行相关实验/pp style="text-align: center text-indent: 0em "图片来源于网络/pp style="text-indent: 2em "作为研究细胞生命活动规律的科学，细胞生物学在科学家的显微镜下经历了近180年的历史，但细胞对人类来说依然是“黑箱”一般的存在。如今，研究人员正在尽力通过对单个细胞进行研究来阐明细胞的“天性”。/pp style="text-indent: 2em "自2014年起，在国家自然科学基金重大项目“单细胞多组分时空分析”支持下，中国科学家在有关单细胞生物学的重大科学问题上取得了一系列进展。/pp style="text-indent: 2em "span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong没有两个细胞是完全相同的/strong/span/pp style="text-indent: 2em "如果把细胞环境比作一个社会，每个细胞就是一个独立的人。/pp style="text-indent: 2em "在对人类社会的研究中，不仅个体的特征和行为值得关注，研究所处环境中个体之间相互协调或对抗作用等关系以及群体所产生的集体行为，也相当重要。细胞研究亦是如此。/pp style="text-indent: 2em "多年来，通过对细胞的研究，科学家已经对生命体的生长发育、遗传变异、认知与行为、进化与适应性等若干生命科学问题有了较为清晰的认识。不过，在清华大学副教授陆跃翔看来，这些还远远不够。/pp style="text-indent: 2em "“在之前的研究中，科学家探索出细胞新陈代谢、生命运动过程中的各种表征方法，如蛋白表达分析、基因转录检测（反转录PCR）等，这些方法更多的是在大样本的细胞中进行观察与测量后，得到一个平均结果。”陆跃翔解释到。/pp style="text-indent: 2em "然而，没有两个细胞是完全相同的。这些平均结果掩盖了细胞之间微小的差异，这些差异可能在某些关键生命过程如细胞分化、肿瘤的发展过程中起着决定性作用。/pp style="text-indent: 2em "为了获取细胞生理状态和过程中更准确、更全面的信息，科研人员将目光瞄准单个细胞。/pp style="text-indent: 2em "“单细胞内部的生命活动，可以被认为是生物活性分子之间复杂的化学反应的结果，正是这些分子的时空分布、结构、功能及其相互作用方式，决定了细胞增殖、分化、凋亡以及重大疾病发生、发展、迁移等过程。”陆跃翔分析道。/pp style="text-indent: 2em "但是想要研究这些生物活性分子形成的精密复杂的相互作用和调控网络并非易事。它不仅要求科学家了解其化学成分，更要理解它们之间相互作用的复杂过程，以及在细胞内部细胞器中特定位置的作用区域和时空变化。/pp style="text-indent: 2em "strong2014年，国家自然科学基金委员会发布重大项目“单细胞多组分时空分析”申请指南，/strong清华大学化学系教授张新荣组织的研究团队的申请获批。他们凝练出strong荧光探针制备与合成、新型时空分辨成像方法以及在细胞内生物分子相互作用/strong研究等关键科学问题。/pp style="text-indent: 2em "“我们希望发展建立适于单细胞中多种生物活性分子时空分辨的荧光分析新方法，驱动生命科学和基础与临床医学研究进步。”谈及科学目标，张新荣如是说。/pp style="text-indent: 2em "span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong新技术带你深入了解“社会”/strong/span/pp style="text-indent: 2em "如何实现这一目标？在张新荣看来，这需要从单细胞中多组分分子的时空信息获取方法出发。为此，项目组将其分为“荧光探针制备与合成”“新型时空分辨成像方法”以及“细胞内生物分子相互作用”三大方向进行攻关。/pp style="text-indent: 2em "strong要了解细胞这个独特的“社会”，首先需要的是一台可以钻进细胞内部获取关键分子信息的“放大镜”。因此，荧光探针制备与合成至关重要。/strong/pp style="text-indent: 2em "针对单细胞中极低含量分子检测问题，山东师范大学教授唐波课题组综合运用共轭聚合物信号放大、无光源激发、光谱红移、核酸杂交链式放大等技术，构建了若干超灵敏的分子与纳米荧光探针，实现了细胞及活体中某些活性分子浓度皮摩尔水平的原位、动态检测。/pp style="text-indent: 2em "同时，细胞中生理过程的发生和发展往往不是一类分子的孤立事件，涉及到多种分子的参与。因此课题组还开发了一系列的两组分、三组分和四组分同时检测的荧光探针，并设计了多模态探针来获取更丰富的成像信息。/pp style="text-indent: 2em "“本项目的一个重要特色工作是时任中国科学院上海应用物理研究所研究员樊春海课题组基于框架核酸构建的多组分分析探针和成像方法。”张新荣介绍，框架核酸是一类人工设计的结构核酸，具有尺寸精确、结构精确、修饰精确的特点，通过精确的化学修饰，可以将多种小分子及大分子探针负载到框架核酸上，实现多组分探针的可控构建。/pp style="text-indent: 2em "不过，实现探针在亚细胞区域内对胞内生物活性分子的精确定位和实时检测可并不那么容易。/pp style="text-indent: 2em "“细胞核内分子密度大且背景荧光特别高，导致人们对单分子的观察非常困难。传统光学显微成像分辨率，不足以解析染色体DNA的构造。”陆跃翔告诉记者，尤其在超高空间分辨率的前提下，要实现持续的动态观察，对荧光探针和成像方法都提出了更大的挑战。/pp style="text-indent: 2em "在活细胞超分辨成像方面，北京大学生物动态光学成像中心研究员孙育杰课题组研发了高性能探针Gmars-Q，使其在光照时进入暗态，从而延长成像时长，比已有最好探针的活细胞超分辨成像时间长一个数量级，这种超高分辨成像技术实现了纳米尺度的活细胞核内动态观测。/pp style="text-indent: 2em "“Gmars-Q的独特机制打开了基于蛋白结构和动力学优化荧光蛋白的设计策略。”德国卡尔斯鲁厄理工学院教授Gerd Ulrich Nienhaus曾对此给予高度评价。/pp style="text-indent: 2em "strong在现代分析化学的发展中，大科学装置的应用也越来越受到科学家的重视。/strong/pp style="text-indent: 2em "依托中国科学院高能物理研究所和中国科学院上海应用物理研究所的两台strong同步辐射光源，/strong樊春海课题组和中国科学院高能物理研究所研究员高学云课题组开展了strong同步辐射X射线细胞成像方法/strong的研究。/pp style="text-indent: 2em "实验团队通过搭建X射线全场三维成像平台，合成了一系列X射线成像探针，发展了细胞成像算法，实现了单细胞的X射线三维成像。为了应对单一技术无法在高分辨率下同时实现细胞的结构与功能定位的挑战，课题组又发展了X射线与超分辨荧光联用技术，实现了在纳米分辨下的细胞结构与功能融合成像的突破。/pp style="text-indent: 2em "已有研究发现DNA不仅有序列信息，还有三维结构信息。基于此，北京大学教授、中国科学院外籍院士谢晓亮课题组通过对sgRNA改造，开发了一种全新的活细胞染色质DNA的多色、稳定标记系统，实现对活细胞内基因位点的长时间连续观察追踪。/pp style="text-indent: 2em "2018年，该重大项目迎来一项重磅突破。谢晓亮课题组在《科学》上发表文章，介绍他们在单细胞水平研究双倍体哺乳动物细胞的基因组结构研究方面取得的成果。利用新发展的Dip-C技术，项目组构建了人源双倍体细胞的具有高空间分辨率的单细胞基因组三维结构。/pp style="text-indent: 2em "“这种结构分型对研究细胞功能有着至关重要的作用，也为唐氏综合症等染色体非整倍体疾病提供了研究和干预手段。”谢晓亮说。/pp style="text-indent: 2em "strongspan style="color: rgb(255, 0, 0) "让基础研究走出实验室/span/strong/pp style="text-indent: 2em "对于细胞“社会”的深层解析，不仅为了阐明各种生命现象与本质，科学家更是希望据此对这些现象和规律加以控制和利用，以达到造福人类的目的。在该重大项目支持下，诸多研究展现出了良好的社会应用前景。/pp style="text-indent: 2em "“许多疾病的研究和治疗最终都必须回归细胞水平。”在张新荣看来，一系列单细胞多组分时空分析技术能够有效加深人们对生命现象的本质理解，也有助于了解疾病机理，进而促进生物医药科学和相关产业的发展。/pp style="text-indent: 2em "strong“项目研发的诊疗一体化功能纳米探针，为相关重大疾病成因、诊断提供表征手段和依据，对疾病的早期预警以及提高疾病治愈率有着重要意义。/strong”张新荣讲道，部分创制的探针已经进行了市场转化，基于探针建立的荧光成像技术也成为国家重大新药创制课题中药效评价的关键技术之一。/pp style="text-indent: 2em "例如，唐波课题组研究的“超高灵敏度—可逆探针”能够在活体水平上示踪炎症发生发展过程中超氧阴离子的浓度水平及动态变化过程，缩短了药物临床试验周期，提高了药物筛选效能。为即将进入临床Ⅱ、Ⅲ期的鼻敏胶囊、咳敏胶囊、结肠炎栓3个中药新品种的作用靶点、药效评价研究提供了技术支撑。/pp style="text-indent: 2em "而基于同步辐射装置的X射线细胞显微成像技术，分辨率很容易达到数十纳米，可以在大视场下实现完整细胞的纳米分辨无损成像，与荧光显微装置相比具有巨大优势，在细胞显微成像方面也展现出了巨大的应用前景。/pp style="text-indent: 2em "然而，对于人类来说，走进细胞“社会”是一个任重而道远的过程。还有无数未知的奥秘等着科学家去探索。/pp style="text-indent: 2em "张新荣表示，该重大项目成果为下一步融合多种分析方法、发展全器官跨尺度高灵敏三维成像提供了基础。/pp style="text-indent: 2em "“通过研发同步辐射X射线相衬—电镜融合成像，有可能在全脑三维微米精度地图引导下选取局部特征区域进行纳米精度的结构解析，大幅降低高精度神经网络解析的盲目性。在特定位点，也可利用荧光分子成像和质谱分子解析，进一步作功能研究。”项目组成员表示，在有关“社会”的探索与发现之旅上，中国科学家一直砥砺前行。/p

前言B 细胞具有产生针对多种靶标的抗体的独特能力，可提供针对感染的保护，同时还有助于免疫失调环境中的发病机制。人类 B 细胞分为五个群体：过渡、幼稚、非转换记忆、转换记忆和浆细胞。识别和分类人类 B 细胞的功能亚群，阻碍了作者在自身免疫中选择性靶向致病性 B 细胞和在疫苗接种中诱导记忆反应的能力。为了表征外围成熟的人类 B 细胞，本文作者开发了一种高度复用的单细胞筛选方案，通过使用大规模细胞术来量化 351 个表面分子的共表达。基于作者的研究结果，作者提出了一种分类方案，将来自外周血、骨髓、淋巴结和扁桃体四个组织的的 B 细胞分为 12 个独特的亚组，并构建了具有表面表型、代谢、生物合成活性和对免疫激活的信号反应特征的广泛单细胞图谱。这个人类 B 细胞身份图谱将使研究能够在稳态、疫苗接种、感染、自身免疫和癌症的背景下进一步确定 B 细胞亚群的功能。本篇为斯坦福大学研究团队在 Immunity期刊（IF:43.474）发表的题为 “An Integrated Multi-omic Single-Cell Atlas of Human B Cell Identity”的研究成果，采用改进的质谱流式细胞仪、流式细胞术等研究方法，成功量化了百万级人类B 细胞上 351 种表面分子的共表达模式。通过鉴定了差异表达的分子，对比VDJ 序列、代谢谱、生物合成活性和信号反应。提出了新的 B 细胞分类方案：在四种淋巴组织中鉴定出 12 个独特的亚群，包括 CD45RB + CD27 -早期记忆群体、类别转换的 CD39 +扁桃体常驻群体和有效响应免疫激活的 CD19 hi CD11c +记忆群体。该分类框架和基础数据集为进一步研究人类 B 细胞身份和功能提供了资源。技术流程研究结果1.高度多重的单细胞表面筛选揭示了人类 B 细胞表面蛋白质组为了识别区分 B 细胞亚群的分子，作者开发了多重筛选的方法，并量化了健康人类 B 细胞上 351 种表面抗原上的共表达模式（图1A）。通过设计了 12 个质谱抗体组，每个组由 9 个用于子集的保守分子和 30 个对每个组独特的可变分子组成。门策略可以实现四个典型 B 细胞亚群：过渡、幼稚、非转换记忆和转换记忆（图1B）。在设置了一个严格的阈值（图 1 C）后，作者确定了 98 个在人类 B 细胞上表达的表面分子（图 1D)。作者的单细胞筛选策略实现了对人类 B 细胞表达的表面分子的可靠鉴定。图1 |高度多重的单细胞表面筛选揭示了人类 B 细胞表面蛋白质组a)实验概述 (n = 2 个捐助者)。b)典型种群的代表性门控。c)屏幕上分子阳性的代表性阈值。d)总 B 细胞（顶行）的百分比阳性和 B 细胞表达的分子子集（底行）的中值表达。2.差异表达分析揭示了幼稚 B 细胞的无反应特性通过规范门控策略识别组织B 细胞的成熟状态：从过渡到幼稚、非切换和切换记忆。为了探究在整个过程中发生的蛋白质组学变化，作者评估了所有分子的子集中每个成对组合之间的表达差异。作者绘制了 61 个差异表达分子（图2A ）。正如预期的那样，未成熟的同种型 IgD 和 IgM 在过渡和幼稚亚型中富集，而经典记忆分子 CD27 在记忆细胞中富集。CD305在抗原缺乏经验的细胞中比记忆细胞富集， CD45RB (RB) 是 CD45 的同种型，优先在记忆细胞中表达。作者绘制了幼稚细胞与其他子集的比较（图2B），作者发现幼稚细胞表达的与运输相关的分子数量少于任何其他子集，这表明它们对刺激的反应较小。事实上，幼稚细胞对 16 种转运分子的中位表达值最低，在所有 46 种转运分子中平均表达最低（图 2C）。作者探索了这种趋势在 GO 术语中是否一致，并发现幼稚细胞在 30 个术语中的 19 个具有最低的平均表达值（图 2 D）。事实上，当对所有 98 个分子的中位表达值进行平均时，幼稚细胞的平均值最低，这表明它们比其他 B 细胞亚群处于更无反应的状态。这些发现证实了幼稚 B 细胞的无反应特性。图2 | 差异表达分析揭示幼稚 B 细胞a)子集的每个成对比较的中值表达差异。所有非白色瓷砖都是显著的（p 0.005）。b)比较的火山图，与 GO 术语“运输”相关联。框中列出的显著不同的分子按表达差异幅度的递减排序。c)转运分子 (颜色) 的中值表达。所有转运分子的中位表达平均值（黑色）。d)与 GO 术语相关的分子的中值表达平均值 (颜色)。所有分子的中值表达的平均值（黑色）。e)在幼稚细胞中表达更高的六种分子的表达 (p 0.005)。3.CD45RB 标记人类记忆 B 细胞并识别早期记忆群体为了找到唯一识别不同 B 细胞的标记，作者以无偏方式分析了所有 B 细胞中分子的共表达模式。作者生成了统一UMAP图，通过使用所有 12 个试管的供体汇集数据来展示保守分子的表达（图 3A）。作者绘制了与保守分子相关的分子，并按功能和相关保守标记进行展示（图 3 B）。在 UMAP 坐标上叠加规范门控标签，尽管表型相似，但细胞被规范门控视为不同的子集（图 3C）。大多数 CD27 +细胞也是 RB +，而 RB + CD27-群体包含 25% 未封闭的细胞（图 3 D 和 3E）。鉴于 RB + CD27 -细胞和 CD27 +细胞在 UMAP 上的共定位，作者假设这些细胞代表在当前分类方案下未被识别的记忆细胞群。为了评估 RB 和 CD27的记忆细胞谱，作者前瞻性地从健康的人类 B 细胞（n = 2 个供体）中分离出 CD27 × RB双阳细胞，并通过下一代测序对 IgH 基因座进行测序（图 3 F）。作为抗原暴露的代表，作者测量了互补决定区 3 (CDR3) 之外的 IgH 基因座中核苷酸的供体汇集突变频率（图 3 G）。正如预期的那样，CD27 +细胞具有相对较高的突变负担，在接触抗原后通过体细胞超突变 (SHM) 获得。作者量化了四个种群在一系列多样性顺序中的多样性并发现 RB - CD27 -细胞的多样性最高，而 RB + CD27 +细胞的多样性最低（图 3 H）。作者进一步探索来自一个群体的细胞是否倾向于与来自任何其他群体的细胞克隆相关（图 3 I）。作者发现来自四个群体中的每一个的细胞都更有可能与来自同一群体的细胞共享克隆谱系，而不是来自不同群体的细胞（图 3J)。这表明 RB 和 CD27 的表达在克隆谱系中是高度协调的，正如对响应抗原结合而表达的两种分子所预期的那样。总之，这些发现提供了强有力的证据，表明 RB 的表达是外周血记忆 B 细胞的指示，并且与 CD27 的缺失相结合，可用于对早期记忆群体进行分类。图3 | CD45RB 标记人类记忆 B 细胞并识别早期记忆群体4. 将 B 细胞分为表型和同型不同的亚群系统筛选了数十种在 B 细胞中差异表达的分子，因此作者假设作者可以将 B 细胞分类为更细粒度的亚群。作者对新鲜、健康的人类外周血 B 细胞（n = 3 名供体）进行了染色，细胞降维成十个不同的群体，包括两个幼稚和六个记忆子集（图 4 B）。表面表达谱提示成熟顺序排列（图4B）。七种不同分子的特征表达以手动门控每个群体，因此也用于标记该方案中的群体：CD11c、CD73、CD95、CD27、CD38、RB 和 CD19（图 4 C D）。子集倾向于在图上形成独特的岛屿，为作者的分类方法提供正交验证 （图 4 D）。为了评估子集之间的表型相似性，作者计算了中值表达谱之间的成对欧几里得距离（图 4 E）。对于每个群体，作者量化了表型最相似的子集。RB + CD27 -记忆和 RB + CD27 + CD73 -彼此最相似，进一步验证了 RB + CD27 -细胞作为记忆子集的状态。在汇总数据（图 4 F）中， 组织 B 细胞也会导致跨个体供体存在同种型。通过规范门控，30% 的 IgG +细胞和 20% 的 IgA +细胞由于缺乏 CD27，这表明 CD27 单独作为记忆分子的不足（图 4 G）。相比之下，作者的方法正确地将超过 99% 的 IgG +和 98% 的 IgA +细胞分类为记忆细胞。已知 Ig 同种型的使用会影响下游效应器功能和分化模式。因此，作者还在同种型的基础上组织了 B 细胞，并观察到BCR 复合物的两种成分的不同表达模式：表面 Ig 和 CD79b（图4H）。鉴于这些趋势，作者探索表型或同种型是否对预测表面 Ig 和 CD79b 的表达量贡献更大。作者创建了单细胞多元线性回归模型，其中细胞的表型标记和同型标记用于预测 CD79b 或表面 Ig 的表达（图4H）。尽管两者都提供了丰富的信息，但细胞的同种型对预测两种分子的表达的贡献超过了细胞的表型。总而言之，这些发现表明，作者的高维分类将外周血 B 细胞组织成十个表型不同的亚群，比典型的门控策略更准确地划分细胞。此外，这些表型分区显示出同型限制，这进一步有助于 B 细胞的身份。图4 | 将 B 细胞分为表型和同型不同的亚群5. B 细胞亚群功能的研究提示了不同的代谢、生物合成和免疫信号活性特征为了研究作者改进的 B 细胞分类方案的功能特性，作者探索表面蛋白是否表示其他潜在功能细胞过程的差异。作者对来自其他供体（n = 9 个供体）的健康人外周血单核细胞 (PBMC) 进行了染色，并使用质谱仪组来探索 B 细胞代谢谱、生物合成活性和免疫信号传导特征（图 5A）。作者量化了与四种代谢途径相关的八种酶的表达：糖酵解或发酵、ATP 感应、氧化磷酸化和脂肪酸氧化 (图5B )。幼稚细胞在所有亚群中的表达最低，而 RB + CD27 -记忆细胞具有介于幼稚和记忆亚群之间的中间代谢特征。这些通路使用的差异可能是由于不同的功能作用，因此不同的代谢需求。通过将 5-溴尿苷 (BRU) 和嘌呤霉素标记与质谱仪相结合，量化从头RNA 和蛋白质合成以及功能和表型特征。作者发现转录活动几乎不能解释在翻译活动中观察到的差异 (图 5 C)，突出了这两个过程的差异调节。CD19 hi CD11c +记忆细胞具有最高的中位转录活性，其次是 CD73 +幼稚细胞，其具有最低的中位翻译活性（图 5D)。发现转录活性浆细胞中的翻译活性和 CD184 表达高于转录lo浆细胞（图 5E)。这种转录活跃的群体可能是长寿命的浆细胞，而转录不活跃的群体可能是短寿命的浆细胞。为了评估亚群之间免疫激活敏感性的差异，作者用不同剂量的 BCR 交联剂和 CD40 配体刺激 B 细胞 10 分钟，然后用包含抗B 细胞信号传导固有的磷酸化靶标（图 5A）。作者测量了脾酪氨酸激酶 (pSYK) 和下游磷脂酶 Cγ2 (pPLCγ2) 的磷酸化（图 5F）。作者在双轴等高线图上可视化了 BCR 复合信号级联中两个分子 SYK 和 PLCγ2 的磷酸化状态变化，并发现子集之间的分布变化存在鲜明对比（图 5 H）。为了量化信号响应，作者计算了推土机在基线细胞和受刺激细胞之间的距离，发现这两个记忆群体以及浆细胞比所有其他子集的响应性明显更高（图 5 I）。作者量化了表型和同种型使用的相对贡献，以预测代谢途径表达、生物合成活性和信号响应的表达（图 5J)。总的来说，这些发现表明作者的表型分类捕获了代谢途径使用、生物合成活性和对免疫激活的信号反应的功能差异。图5 | B 细胞亚群功能的研究揭示了不同的代谢、生物合成和免疫信号活性a)实验工作流程 (n = 9 捐助者)。6. 淋巴组织特异性 B 细胞群的表征为了将人类 B 细胞分析的范围扩大到外周血之外，作者分析了来自外周血的骨髓 (n = 3)、扁桃体 (n = 3)、淋巴结 (n = 1) 和其他外周血样本 (n = 4)一个新的健康捐赠者队列（n = 11），通过大规模细胞术（图 6A）。为了探索组织之间 B 细胞表达的整体差异，作者评估了所有分子的供体组织表达差异。作者确定了至少一对组织之间存在差异表达 (p 0.005) 的 21 个分子，并绘制了它们的分布，按功能组织（图 6 B）。淋巴结也明显偏向未成熟同种型（图 6 C）。然而，扁桃体没有富集任何抑制分子（图 6 B），主要由具有记忆表型的细胞组成（图 6 C 和4 G）。为了评估组织内 B 细胞表型的组成，作者绘制了子集比例图，并且根据同种型数据，作者发现淋巴结大量富含 CD73 +幼稚细胞（图 6 D）。为了评估组织的差异性，作者根据子集组成计算了每个组织之间的成对曼哈顿距离（图 6 E）。作者确定了外周血中不存在的两个亚群：生发中心 (GC) B 细胞，存在于扁桃体和淋巴结中，以及一个 CD39 +扁桃体群（图 6 D)。GC 细胞是 CD38 +和 CD32 - (图 6 F)。图6 | 淋巴组织特异性 B 细胞群的表征a)实验工作流程 (n = 11 捐助者)。b)分子的小提琴图在至少两种组织中显著差异表达 (p 0.005)。研究讨论为了探究原代细胞的深层表型多样性，作者开发了一种高度多重的单细胞表面筛选，并将其应用于识别可以分离人类 B 细胞亚群的分子。这种方法使作者能够区分四种淋巴组织中的 12 个 B 细胞亚群并关联它们的功能特征。作者确定了六个记忆群体，证实了先前关于小鼠和人类抗原识别后表型多样化的报道。作者还确定了一个 CD19 hi CD11c +记忆群体，它与在自身免疫、感染和衰老背景下描述的几个群体具有一些共同特征。卡内尔等人，2017）。在这个群体中，作者通过 CD27 表达分离细胞，发现 T-bet 和 PD-1 在 CD27 - CD19 hi CD11c +记忆细胞中富集，类似于在 T 细胞中看到的效应记忆表型。在这里，作者通过对健康个体中多组学整合进行的深度表型分析揭示了新的、更细的B群体确定，全面映射了人体血液和淋巴组织中的 B 细胞身份。对几个细胞过程中表型与同种型使用的贡献的定量评估突出了对超越谱测序和同种型身份进行分析以了解人类 B 细胞免疫功能的必要性。研究结果作为未来研究在疫苗接种或疾病背景下研究体液免疫反应的资源，描述的群体和分子可能对于理解 B 细胞介导的发病机制或保护至关重要。

单细胞测序在疾病诊断和细胞异质性研究中发挥着重要作用。然而目前的单细胞测序手段需要将细胞消化并裂解才能够进行，而细胞状态在这一操作中不可避免的会发生改变，因此很难掌握细胞真实的基因表达情况，尤其对于基因通路上表达变化的检测为不利。近期苏伊士理工大学使用FluidFM创建了一种原位活细胞基因测序方法，这种方法能够在不杀死细胞的情况下完成对细胞的测序工作。通过这种技术该团队成功完成单细胞RNA基因测序，并通过这种方法检测到了细胞的基因表达和细胞周期状态变化。下面本文就这项工作的具体内容进行阐述。1. Live-Seq测序技术简述由于单个细胞的RNA总量仅有10 pg。为了实现无损的单细胞测序，该团队先使用FluidFM对现有的scRNA-Seq单细胞测序的方法进行了优化。为了尽可能的接近Smart-Seq的测试条件，该团队采用了先将缓冲液吸入探针，然后再进行细胞提取的操作。这样可以确保所提取的RNA能够很快与缓冲液混合，从而避免RNA的降解。通过这一方法，该团队成功实现了IBA细胞的测序，证明了这种方法的可行性（图1）。图1. Live-Seq技术a. Live-Seq技术的示意图和代表图片，黑色箭头指代液面；b. IBA细胞测序的质量控制图（n=10）。2. Live-Seq技术分析细胞系和细胞状态为了证实Live-Seq的有效性，该团队对多种细胞系进行了测序，这其中包括IBA细胞、小鼠脂肪干细胞和祖细胞（ASPCs）以及脂多糖处理的RAW264.7细胞和Mock处理的RAW264.7细胞。通过对这些细胞系进行测序发现，该方法能够区分上述细胞系，并且在特征基因检测中能够找到每种细胞所对应的特征基因，证明了Live-Seq方法的有效性（图2）。图2. Live-Seq单细胞测序区分细胞型及细胞状态a. 实验方法示意图，使用LPS和PBS对RAW细胞进行处理；b. 前500个高度易变基因的tSNE图；c. 前十的细胞型、细胞状态差别基因的热图；d. 小鼠基因图谱预测，使用前100个标记基因的团簇；e. Live-Seq对比scRNA-Seq的锚点分析，显示两者没有显著差异。3. Live-Seq技术对细胞的活力基本没有影响Live-Seq技术的显著优势在于提取过程中不会破坏细胞。通过对提取前后的测序对比可以发现，提取组与空白组之间的团簇没有显著性差异。并且通过对细胞形态的观察，发现细胞的形态基本没有改变，并且多数细胞仍然能够正常分裂（图3）。图3. Live-Seq对细胞活力的影响a. 细胞实验的示意图；b. Live-Seq测序后不同时间点（1h,4h）的scRNA-Seq的tSNE图；c.不同时间点scRNA-Seq所有能够发现差异的基因（共12个）；d.不同时间点的细胞形态图片。4. Live-Seq技术能够记录细胞下游分子表型事件由于Live-Seq对细胞生理状态影响小，因此能够监测在细胞代谢过程中的基因变化。通过对比LPS处理的巨噬细胞周期实验发现，Live-seq技术与对照组的细胞代谢水平相比没有明显变化，因此这种方法测量的数据十分接近细胞代谢中基因表达的真实水平。通过测序对比LPS处理与空白的测序结果发现Nfkbia与Tnf的表达为相关。这一结果也验证这种测序方法在检测细胞下游表型时的优势。图4. Live-Seq技术的单细胞纵向分析a. 实验示意图；b. 不同处理细胞的mCherry强度变化；c. 3~7.5h之间mCherry强度变化；d. Tnf-mCherry强度变化的线性回归模型；e. Nfkbia与Tnf在Live-Seq测序中的表达关系；f. Nfkbia与Tnf在scRNA-Seq测序中的表达关系；g. Live-Seq测序中细胞处于S期的评分；h. Live-Seq测序中细胞周期的mTnf-mCherry强度变化；i.Tnf-mCherry的荧光强度增量（3~7.5h）。5. Live-Seq技术对同一细胞多次测序Live-Seq技术的无损性甚至能够实现对单个细胞的多次测序。通过对单个细胞两次提取后细胞活力变化的观察中发现，细胞的活力即使在2次提取后仍没有发生明显的变化，基因型分析也没有发现明显的基因表型改变。图5. Live-Seq对细胞的多次提取j.连续测序的示意图和代表图像；k.Live-Seq的tSNE图；l.整合Live-Seq和scRNA-Seq的tSNE图。 6. 总结Live-Seq是一种十分具有前景的单细胞测序的新方法，得益于FluidFM技术的无损提取的优势，Live-Seq技术除了能够实现传统测序的功能外，还降低了细胞的损伤，能够提供更加原生和真实的测序信息。这种特点甚至让单细胞的基因表达动力学研究成为可能。相信随着这种技术自动化的提高，将为单细胞测序技术带来更多可能。 参考文献：[1]. Genome-wide molecular recording using Live-seq, Wanze Chen, Orane Guillaume-Gentil, Riccardo Dainese, Pernille Yde Rainer, Magda Zachara, Christoph G. Gäbelein, Julia A. Vorholt, Bart Deplancke, bioRxiv 2021.03.24.436752 DOI: https://doi.org/10.1101/2021.03.24.436752

目前科学家对人类细胞如何互相作用以组成不同组织与器官的认识仍然十分有限。近年来，一系列单细胞测序的研究工作揭示了正常组织与疾病状态下的单细胞图谱，描绘了组织中多种细胞类型及其丰度与互作，但这些工作往往局限于单一器官。系统性地比较多种组织间的细胞类型及其转录组的异同，有助于科学家理解器官特异性的细胞状态分化。2022年5月12日，Science杂志在线发表了Tabula Sapiens Consortium、Eraslan、Domínguez Conde、Suo等研究人员报道的4篇跨组织人类单细胞图谱的研究，共涉及来自68位捐献者的30余种组织类型，超过100万单细胞，涵盖500种以上细胞类型。北京大学张泽民课题组受邀于Science同期发表Perspective观点文章，对以上研究进行了总结，并对将来单细胞测序技术在疾病研究与药物研发中的应用进行了展望。跨组织单细胞测序揭示了组织间保守的细胞特征。Eraslan等人通过比较多种器官中的巨噬细胞，发现了保守的巨噬细胞发育路径，即monocyte前体在组织中发育为高表达HLAII、行使免疫功能的巨噬细胞类群，与高表达LYVE1、行使血管支持与免疫细胞浸润抑制功能的巨噬细胞类群。跨组织单细胞测序发现了组织特异性的细胞状态。记忆T细胞是经过抗原刺激后的T细胞，Domínguez Conde等人发现了三类CD8记忆T细胞亚型，分别为分布在血液丰富组织中的TEM/EMRA细胞，分布在肠道中的TRM细胞，以及主要分布在脾脏与骨髓当中的TRM/EM细胞，这些T细胞亚型各自特异表达的细胞因子受体可能是形成组织差异性分布的机制。对组织间细胞构成的比较识别了稀有的细胞类型。Tabula Sapiens Consortium发现来自肺、心脏、子宫、肝脏、胰腺、脂肪、肌肉等组织的内皮细胞有着各自独特的转录组特征，提示了高度组织适应的功能。同时胸腺、血管、前列腺、眼球来源的内皮细胞更为相似。泛组织研究的方法发现了心脏内皮细胞的特异性marker SLC14A1，提示了心脏内皮细胞可能的适应性代谢功能。同时，Eraslan等人发现了稀有的细胞类型，包括前列腺中的神经内分泌细胞与食管中的肠系神经。跨组织单细胞图谱同时提示了疾病相关的细胞类型。Eraslan等人以肌肉疾病为例研究了单基因遗传病中的潜在致病细胞类型。研究发现在一种影响神经-肌肉细胞信号传递的疾病中，仅神经与肌肉连接处的肌肉细胞富集该类疾病的相关基因。同时，对受体-配体进行的分析发现细胞间互作失调是肌肉疾病的成因之一。例如在一种致死性的肌肉疾病中，ERBB3突变会导致肌肉细胞与施旺细胞（一种生成神经元旁髓鞘的细胞类型）的互作失调。这一系列跨组织单细胞测序数据集同时为药物副作用和安全性研究提供了重要的参考。虽然新药的分子靶向性不断提高，但全身系统性的给药仍然是最主流的方式，使得药物副反应成为重要的临床问题。对这一系列跨人类组织的单细胞数据集进行基因表达查询将大大助力于新药研发的毒性预测，将毒副作用识别在人体试验之前。本期Science发表的四项跨组织单细胞测序研究代表了构建综合性人类细胞图谱的重要里程碑。将来的研究有必要在更大队列的人群中进行探索与验证。同时，将跨组织的研究方法应用于疾病研究十分重要，例如肿瘤。理解组织保守性与组织特异性的肿瘤发生过程对开发泛癌种与癌症类型特异的肿瘤药物至关重要。例如，对肿瘤免疫的认识促进了靶向PD1抗体药物在多种癌症类型中的成功。近年来张泽民课题组报道了一系列泛癌种的髓系细胞与T细胞单细胞测序研究，这一系列研究方法适合被推广至更全面的细胞类型和患者队列，并最终使科学家在单个基因、细胞、组织与表型层面系统性地理解疾病与生物学过程。

海洋是地球上最大的活跃碳库。海洋微生物在全球碳循环中具有重要作用，而由于大部分海洋微生物尚难以培养、原位代谢功能难以测量等技术瓶颈，关于海洋微生物光合固碳的原位功能机制等重要问题存在争议。中国科学院青岛生物能源与过程研究所与英国牛津大学、英国谢菲尔德大学、山东省海洋科学研究院等合作，基于CO2固定活性靶向性的拉曼分选耦合单细胞基因组（scRACS-Seq）等仪器、手段，揭示了海水中原位进行光合固碳的SAR11类群，并发现它们以视紫红质作为捕光系统来驱动海水中CO2的固定。近日，相关研究成果发表在《生物设计研究》（BioDesign Research）上。　为了识别海洋微生物组中哪些细胞在原位固定CO2，青岛能源所单细胞研究中心高级工程师荆晓艳、助理研究员公衍海和博士徐腾带领的研究组，利用稳定同位素13C标记的无机碳底物饲喂新鲜海水样品，通过单细胞拉曼光谱中类胡萝卜素等色素特征峰的“红移”现象，建立了在免培养前提下原位固定CO2之单细胞的识别和测量流程。基于单细胞中心等研制的scRACS-Seq系统，科研人员建立了针对CO2固定活性等代谢表型的功能靶向性单细胞拉曼分选与测序方法。运用scRACS-Seq体系，该研究在中国山东省青岛崂山湾真光层海水中识别和分选到一系列进行海洋原位固碳代谢的Pelagibacter属单细胞（Pelagibacter属单细胞来自SAR11等类群）。基于SAR11单细胞全基因组序列（覆盖度最高达到100%）的进化分析、基因功能预测与代谢途径重建，研究表明：它们具有完整的类胡萝卜素合成途径，印证了上述单细胞拉曼光谱基于色素峰红移来识别和表征CO2固定活性的原理；发现了基于视紫红质的光激活质子泵系统，包括双加氧酶（Dioxygenase enzyme）、视紫质光敏感蛋白（Proteorhodopsin）、F-型ATP合成酶（F-type ATPase）等关键蛋白；它们拥有大部分进行CO2固定的Calvin-Benson循环途径的基因。研究提示，这些SAR11细胞可能通过基于视紫红质的光激活质子泵系统，来驱动基于Calvin-Benson循环的海水原位固碳。为了验证这一假设，研究将这些SAR11单细胞基因组中四个预测为视紫质光敏感蛋白的基因在大肠杆菌中进行异源表达。结果证实，它们能够合成视紫质且其中的两个基因与GenBank中的基因均无显著同源性，属于一类全新的视紫质光敏感蛋白。因此，这些视紫红质介导的光激活质子泵系统或是SAR11在海水中原位进行光合固碳的能量引擎。SAR11难以培养且研究工具匮乏，但本研究在单细胞精度揭示了SAR11的代谢表型组和完整基因组，从而建立了视紫质光敏感蛋白和海水原位CO2固定之间的功能关联。这一原创的“拉曼介导靶向单细胞基因组”（scRACS-Seq）仪器体系，克服了当前“拉曼介导靶向元基因组”手段通常难以在单个细菌细胞精度获得高覆盖度基因组的瓶颈，因而对于环境中生命暗物质的功能探索和机制解析具有共性的方法学意义。研究工作得到国家重大科研仪器研制项目等的支持。论文链接单细胞精度的海洋微生物组功能靶向性拉曼分选与测序技术（scRACS-Seq）

iPSC简介2006年Takahashi和Yamanaka突破性发现使终末分化、谱系受限的成体细胞：如皮肤活检来源的成纤维细胞、外周血来源的T淋巴细胞、毛囊细胞等，通过转录因子OCT4、SOX2、KLF、c-MYC、NANOG和LIN28的强制异位表达直接将其重编程为多能状态的细胞，这些细胞被称为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)。iPSC与胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESC)有相似的基因表达、表观遗传谱和分化潜能，可产生任何类型的体细胞。并且避免了ESC基于使用胚胎来源细胞和可能导致异常发育的体外受精胚胎的伦理问题，因此iPSC在医疗领域里具有更好的应用和产业化发展前景。iPSC应用和挑战描述任何人类疾病和药物发现的病因学和病理生理学的主要关键组成部分是需要一个生理相关的疾病实验模型，无论是体外还是体内或两者，需要忠实地概括各自的病理生理学和临床表现。因此基于人类iPSC的疾病模型可以无限供应临床相关的表型细胞、以及它们具有的衍生潜力，可以加速阐明生物医学研究中疾病的病因机制，应用于新药发现、药物效价测试、预测药物安全性药理学/毒理学研究，以及基于iPSC的再生细胞疗法，有望治疗心脏病、帕金森、视网膜和角膜疾病、肝脏衰竭、糖尿病、脊髓损伤等疾病。然而将iPSC治疗方法真正有效转化为临床环境，保证患者安全，还需解决：临床级iPSC的衍生和通用细胞系的生物库建立；需要定义iPSC及其差异化治疗细胞产品可接受质量属性；致瘤性问题；免疫排斥反应；选择同种异体或自体 iPSC 以获得更有效的细胞治疗的难题；iPSC 谱系表型细胞和细胞系变异的异质性；基于iPSC的多基因、散发性和迟发性疾病的患病模型的挑战；需要大量的患者iPSC以实现更有效的病因学和临床转化；iPSC衍生的表型细胞缺乏成熟度；遗传的不稳定性等挑战。iPSC-CM研究和面临的问题心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)作为全球主要的死因之一，每年会导致约1790万人死亡，所以迫切需要可以延缓疾病进展并且可以改善心脏功能和预防衰竭的治疗方法。而目前的药物、介入或手术方法可能会改善临床结果，但由于无法促进心脏组织修复和再生，因此使这种治疗方法的成功率得不到提升。人类诱导多能干细胞(hiPSC)技术的出现以及随后在培养物中分化和建立心肌细胞（cardiomyocytes，CMs)的能力，为实现人类心脏再生疗法创造了可能性。作为分化CMs的连续和生物学相关来源，hiPSC-CM是心血管研究界的宝贵工具，不仅可用于治疗CVD，还可用于模拟人类心脏发育和疾病、研究潜在机制以及筛选具有疗效和心脏毒性的新药。由于hiPSC-CM由不同的细胞亚群组成，这些细胞亚群是异质的、未成熟的、表达胎儿基因表达谱，并且与成人心肌细胞相比收缩力减少，因此hiPSC-CM疾病模型的准确性和实用性仍然有限。此外，随着hiPSC-CMs的成熟和蛋白质表达动态的波动，大量样品分析的分辨率变得不足。由于其异质性导致心室样、心房样和节点样亚群，需要严格表征hiPSC-CM，并应对其成熟度、身份和功能进行筛选。为此，需要进行单细胞分析模式以了解这种异质性。细胞异质性研究方法虽然单细胞测序技术在分析单细胞转录组学和基因组信息的通量和规模方面取得了进步，但由于任何一个细胞中存在的蛋白质含量非常低，因此难以满足对定量、单细胞蛋白质组学技术的需求。此外，蛋白质组的复杂性和广泛的浓度范围（fM到高nM）带来了额外的挑战。为了在单细胞水平上进行生化蛋白质表征分析，高灵敏度工具是必不可少的。来自ProteinSimple的单细胞蛋白质分子技术：Milo是一种基于微流体的芯片电泳技术。可以克服单细胞蛋白质组学方法面临的障碍。Milo操作流程将细胞悬浮液加载到Milo芯片上，这样单个细胞就可以安放在芯片上的各个微孔中。然后Milo裂解细胞，产生单细胞裂解物，通过分子量电泳分离每个单细胞裂解物中的蛋白质，然后使用紫外线在Milo芯片中捕获蛋白质。然后，对目标蛋白进行一级抗体和荧光二级抗体进行免疫荧光捕获。通过使用开放格式的微阵列扫描仪对芯片进行成像，并使用Scout™ 软件对图像进行分析，以进行定量的自动数据分析。Milo追踪定量不同iPSC-CM亚型与免疫荧光和流式细胞术等其他单细胞分析系统不同，单细胞Western Blot技术Milo可以提供分子量大小信息，以及在单细胞水平测量蛋白质表达时的免疫结合信息，赋予额外的特异性。这种分子量分级步骤可以分辨不同物种的不同蛋白质亚型或区分脱靶抗体结合。为了表征CMs亚型标志物，通过Milo检测了肌球蛋白调节轻链2心房亚型（MLC2A或MYL7）及其心室亚型（MLC2V或MYL2）的蛋白质表达。可以观察到Milo鉴定了三个亚群，这些亚群由MLC2A或MLC2V的单一表达或共表达组成。Milo检测到hiPSC-CM亚型特异性心室和心房标记物MLC2V和MLC2A，在45秒的电泳运行时间内，迁移到总泳道长度的60%（图A）。使用Milo-Scout™ 软件通过找到典型峰形与源自原始荧光图像的一维强度图的卷积的局部最大值来识别峰中心。检测到的MLC2A、MLC2V和GAPDH峰的峰中心位置也由泳道指数显示（图B），显示出单个Milo芯片上所有孔的峰迁移的均匀性。为了评估芯片位置（图C）是否影响峰面积量化，比较了空间不同块之间计算的峰面积方差：每个块区域之间的差异小于2.5%（图D）。应用优化的Milo的检测方法研究hiPSC-CM随时间的异质性，观察整个分化时间线中蛋白质表达的变化。在第17、23和30天从培养物中提取hiPSC-CM细胞，检测MLC2A和MLC2V蛋白质表达。结果显示，共表达MLC2A和MLC2V阳性细胞的比例在整个分化过程中增加，而仅表达MLC2A(MYL7+)的细胞比例随时间减少。且三个亚群中每个亚群中的细胞百分比在所有芯片中一致重现。为了了解在整个分化过程中每个标记物的表达水平在hiPSC-CM亚群中的变化，在hiPSC-CM分化的第17、23和30天对MLC2V和MLC2A的表达进行了量化。随着分化的进行，MLC2A的总水平略有增加。然而，MLC2V表达在第23天和第30天之间增加了近三倍（图C）。为了了解驱动MLC2V表达增加的细胞亚群，三个亚群（MLC2A+、MLC2V+和共表达MLC2A+和MLC2V+）被进一步分层（图D）。MLC2V的水平在共表达MLC2A+和MLC2V+亚群中显着增加，以及在单独的MLC2V+亚群中增加。为了进一步了解导致hiPSC-CM分化过程中MLC2V表达显着增加的机制，对先前从三个iPSC系产生的hiPSC-CM进行了Milo分析，其中转录因子NR2F2 (NR2F2GE)、TBX5 (TBX5GE) 的外显子)和HEY2 (HEY2GE) 被CRISPR/Cas9编辑删除。利用这些品系来验证NR2F2、HEY2或TBX5缺陷在单细胞蛋白质水平上对MLC2V表达的影响。结果显示，TBX5GE和HEY2GE hiPSC-CM中MLC2V的单细胞表达显着降低（图E）。此外，MLC2V表达的显着下降归因于共表达MLC2A和MLC2V亚群（图F）。鉴于共表达MLC2A和MLC2V的亚群增加了MLC2V的表达，推测单独表达MLC2A的未成熟hiPSC-CM会随着时间的推移共同表达MLC2V，从而变得更像心室。同时使用预测调节MLC2V（HEY2或TBX5）的转录因子缺陷的两种细胞系时，我们仅观察到MLC2V在共表达MLC2A和MLC2V亚群中表达降低。这可能表明单独表达的MLC2V群体代表了一个独特的细胞亚群，并且该亚群中MLC2V的表达受替代转录因子的调节。结论：随着在基础和转化心脏研究中的应用，hiPSC-CM正被用于心血管疾病和心脏发育研究。然而，由于hiPSC-CM由不同的细胞亚群组成，并且hiPSC-CM蛋白表达动力学随着成熟而波动，一些蛋白分析方法可能因为分辨率不足而无法检测单细胞蛋白异质性，因此hiPSC-CM的单细胞蛋白质组学可能受到依赖抗体结合检测而无法评估脱靶结合技术的限制。单细胞蛋白质分析技术Milo，通过靶点分子量差异和抗体识别特异性蛋白标记物，避免了抗体脱靶结合的现象，同时能够跟踪单细胞亚群蛋白表达随时间的变化，从而能够识别并量化hiPSC-CM中不同的异质性亚群，应用于疾病建模和再生医学治疗研究。参考文献：1 Current Challenges of iPSC-Based Disease Modeling and Therapeutic Implications.2 Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: insights into molecular, cellular, and functional phenotypes.3 Single-cell protein expression of hiPSC-derived cardiomyocytes using Single-Cell Westerns.

CD8+ T细胞是杀伤癌细胞的最主要细胞类群。肿瘤浸润T细胞中含有应答肿瘤抗原的T细胞。然而伴随着肿瘤发生过程，这些T细胞经常分化为功能失调状态，即T细胞耗竭。调节肿瘤浸润T细胞的治疗方法已经取得了显著的临床效果，但在不同癌症类型之间差异很大。越来越多的证据显示不同癌症类型的微环境对塑造T细胞的组成和状态发挥着重要作用，但迄今为止仍然缺少对不同癌症类型的T细胞的系统比较。单细胞转录组测序 (scRNA-seq) 已成功应用于精细的表征多种癌症的肿瘤微环境，包括肿瘤浸润T细胞。2021年12月17日，北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）、生命科学学院、北京未来基因诊断高精尖创新中心（ICG）张泽民课题组联合北京大学肿瘤医院季加孚、步召德课题组以及北京大学第三医院，在Science上发表了题为Pan-Cancer Single Cell Landscape of Tumor-Infiltrating T Cells的研究论文。结合单细胞基因表达谱和 T细胞受体序列，研究者系统刻画了肿瘤浸润性T细胞的异质性和动态性，并系统比较了癌症类型之间的异同。利用单细胞测序和生物信息技术，研究者之前对三个癌种，即肝癌、非小细胞肺癌和结直肠癌完成了T细胞单细胞水平的研究。为了更好地了解肿瘤浸润T细胞的全貌，了解癌种间的共性和特殊性，本研究收录了更多的癌症类型，包括骨髓瘤、淋巴瘤、肾癌、卵巢癌、子宫内膜癌、食道癌、甲状腺癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌，并广泛收集国际上已发表的类似数据。本研究通过创新生物信息方法，校正混杂因素和批次效应后，有效整合了不同实验平台和实验室来源的数据，从而构建了系统的单细胞水平的泛癌症T细胞图谱，图谱最终涵盖了来自21种癌症类型的316名患者的397,810高质量T细胞数据。本研究一共识别出17个CD8+T细胞类群和24个CD4+T细胞类群。所有T细胞类群都能在至少80%的癌种中找到。比较癌、癌旁组织和外周血的T细胞组成，可以看到明显的差异。外周血的CD8+T细胞由初始T细胞和终末分化效应T细胞主导。癌旁组织则出现较多的记忆T细胞，而癌组织中出现特有的耗竭T细胞。基于香农熵的多样性指数也定量地表明，从外周血到癌旁组织再到癌组织，T细胞组成的多样性逐渐升高。类似的，CD4+T细胞组分的多样性在癌组织中也最高。在癌组织中丰度最高的CD4+T细胞为TNFRSF9+Treg，且其显著高于在外周血和癌旁组织中。这些结果表明，肿瘤微环境明显地重塑了T细胞的状态。研究揭示了 T 细胞亚群的异质性、分化谱系及其与肿瘤生物学特征的关联。对于 CD8+ T 细胞，研究者分别通过效应记忆T细胞和组织驻留T揭示了T耗竭的两种常见主要途径，以及它们在不同癌症类型中的偏好。研究者还提出了表达干扰素刺激基因的 T 细胞作为 T 细胞耗竭的中间状态。对于 CD4+ T 细胞，研究发现肿瘤中的两种T滤泡辅助细胞，并进一步发现其与肿瘤突变负荷相关，提示了肿瘤细胞如何塑造肿瘤微环境。根据肿瘤浸润T细胞的组成，癌症患者可以分为末期耗竭 CD8+ T 细胞占比高与组织驻留记忆 CD8+ T 细胞占比高的两个组群。基于T细胞的肿瘤免疫分型为理解肿瘤浸润T细胞的总体特性提供了一个参考，也将进一步指导开发新的癌症免疫疗法和病人分层。T细胞单细胞图谱的主要发现北京大学前沿交叉学科研究院博士毕业生郑良涛、生命科学学院博士生秦世尚、前沿交叉学科研究院博士后司雯为该论文的并列第一作者，北京大学BIOPIC和生命科学学院张泽民教授、北京大学肿瘤医院季加孚教授和步召德教授、百奥智汇胡学达博士为该论文的共同通讯作者。

p　　每个细胞都是独一无二的，但我们的研究对象往往是细胞群体，忽略了这些细胞之间的异质性。正因如此，单细胞a title="" style="color: rgb(255, 0, 0) text-decoration: underline " href="http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S01-T000-1-1-1.html" target="_self"span style="color: rgb(255, 0, 0) "基因组学/span/a研究受到了越来越多的关注。/pp　　单细胞基因组学领域近年来发展得非常迅速，为人们揭示了复杂生物学体系的许多重要线索，包括微生物群落的生态多样性和人类癌症的基因组。一月二十五日Nature Reviews Genetics杂志发表的一篇重要综述，全面介绍了单细胞a title="" style="color: rgb(255, 0, 0) text-decoration: underline " href="http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S01-T000-1-1-1.html" target="_self"span style="color: rgb(255, 0, 0) "基因组测序/span/a的发展现状。文章的通讯作者是著名科学家、斯坦福大学生物工程系主任Stephen R. Quake。/pp　　Quake也是HHMI 研究员、美国科学院、美国工程院、美国医学院院士。他的主要贡献在于将集成芯片的原理和技术成功地应用于生物学和医学研究，目前名下拥有80项专利，并创办了4家公司。/pp　　这篇文章首先探讨了单细胞基因组测序面临的技术挑战，随后介绍了一些技术进步带来的生物学新发现。重点关注用单细胞基因组测序研究微生物暗物质，评估多细胞生物中遗传嵌合现象的致病作用，尤其是癌症。文章末尾还预测了未来几年单细胞基因组测序可能出现的一些进展。/pp　　前不久，北京大学汤富酬和文路发表的点评被Nature杂志评为了2015年最佳评论文章。这篇文章重点介绍了Hubrecht研究所的单细胞mRNA测序研究，特别是他们开发的RaceID算法。这种聪明的算法能够在复杂的细胞混合物中有效鉴定稀有细胞类型。RaceID假定不同细胞类型强力表达一些特异性的“异常值”基因。只要仔细排除技术和生物学噪音，就可以从测序数据中鉴定到这样的基因。单细胞mRNA测序与RaceID算法结合在一起形成了一个强大的工具，可以帮助人们深入了解健康和病变器官中的各种细胞类型高度表达基因以随机爆发的形式转录，这一现象也被称为转录爆发(Transcriptional bursting)。为了在细菌中研究转录爆发的具体机制，哈佛大学和北京大学生物动态光学成像中心的研究人员开发了一个高通量的单分子分析技术，对各DNA模板的体外转录进行了跟踪研究。这一成果发表在2014年07月的Cell杂志上，文章的通讯作者是著名学者谢晓亮教授(X. Sunney Xie)。谢晓亮教授是单分子生物物理化学和相干拉曼散射显微成像的开拓者之一。近年来他在单细胞测序技术上取得突破，发表了不少重要成果。/pp　　我们知道，单细胞的DNA(大约只有6 pg)无法满足测序的mg级样品量需求。为了从少量样品中获得更多信息，全基因组扩增技术(WGA)应运而生。目前市场上出现了多种扩增试剂盒，但它们的表现还没有一个综合的评估。为此，华大基因的研究人员利用7种试剂盒开展单细胞全基因组扩增，系统地比较了不同WGA方法的优点和缺点，尤其关注变异检测。这项成果于2015年8月发表在《GigaScience》期刊上。/p

为什么我们会感觉到饥饿？为什么进食之后会出现饱腹感？我们能感知到大脑与肠道的紧密联系，以往的研究认为这种感知与触觉、视觉、声音、气味和味觉通过受神经支配的上皮传感器细胞传递到大脑不同，肠道刺激的感知被认为涉及消化系统和中枢神经系统之间信号传递的肠道-大脑连接（gut-brain connection）是以激素转运为基础的，这种基于激素的信号传递大约需要10分钟。在肠道中，有一层上皮细胞将腔与下面的组织分开。分散在该层内的是称为肠内分泌细胞的可电兴奋细胞，它们感知摄入的营养物质和微生物代谢物。与味觉或嗅觉受体细胞一样，肠内分泌细胞在存在刺激时会激发动作电位。然而，与其他感觉上皮细胞不同，肠内分泌细胞和脑神经之间没有突触联系的描述。人们认为这些细胞仅通过激素（如胆囊收缩素）的缓慢内分泌作用间接作用于神经。尽管它在饱腹感中起作用，但胆囊收缩素的循环浓度仅在摄入食物后几分钟达到峰值，并且通常在用餐结束后。这种差异表明大脑通过更快的神经元信号感知肠道感觉线索。来自美国杜克大学医学院的科学家们，利用Milo，揭示迷走神经（vagus nerve）可直接连接着肠道与中枢神经系统。相关研究结果发表在Science期刊上，标题为“A gut-brain neural circuit for nutrient sensory transduction”。Milo单细胞Western Blot 验证肠分泌细胞存在神经突触相关蛋白本文使用与小肠类器官或纯化的肠内分泌细胞共培养的结节神经元，在体外重现了神经回路。并结合单细胞定量实时聚合酶链反应和单细胞Western Blot（Milo）共同对突触蛋白进行检测和评估。利用Milo在蛋白水平进行了进一步的验证：单细胞蛋白质印记结果显示83%肠内分泌细胞含有synapsin-1（分析的198 CckGFP细胞中的164个），与其他肠上皮细胞相比，纯化的CCK-肠内分泌细胞表达突触粘附基因Efnb2、Lrrtm2、Lrrc4 和 Nrxn2，表明这些上皮传感器具有形成突触的机制。为了确定与肠内分泌细胞接触的突触的神经元的来源，本文使用了一种改良后的狂犬病毒(DG-rabies-GFP，能感染神经元，但缺少跨突触传播所需的G糖蛋白)，发现在肠道类器官中，狂犬病比其他上皮细胞更喜欢感染肠内分泌细胞。并且肠内分泌细胞与迷走神经元突触，通过使用谷氨酸作为神经递质，在几毫秒内转导肠腔信号。这些突触连接的肠内分泌细胞（神经足细胞）形成的神经上皮回路通过一个突触将肠腔与脑干连接起来，为大脑打开一条物理管道，以突触的时间精度和空间分辨率感知肠道刺激。也正是这些突触信号神经足细胞告诉大脑肠道中发生的事情，对我们吃的食物做出一定的反馈。

2021年10月4日，清华大学北京信息国家研究中心/医学院张奇伟教授（美国德州大学达拉斯分校客座教授）与清华大学化学系张新荣教授团队合作在Nature Methods杂志上在线发表论文：SEAM is a spatial single nuclear metabolomics method for dissecting tissue microenvironment ，提出一种在单细胞分辨率下进行空间代谢异质性分析的新方法。SEAM方法采用高空间分辨质谱成像结合大数据算法，实现了组织原位代谢异质性可视化、单细胞核图像识别、代谢特征信息提取以及单细胞的聚类、差异化分析，从而能够让研究者系统的解析组织中单细胞的“代谢指纹图谱（metabolic fingerprint）”。由于器官或组织中的单个细胞的代谢物图谱存在明显的空间分布的异质性，因此，定位单个细胞在组织网络中的位置、区分相关代谢物的指纹图谱差异、确定重要代谢物的分子组成有重要意义。为了验证新方法，作者解析了野生型小鼠肝脏组织中的空间代谢异质性，发现了肝细胞代谢异质性亚群。这一发现和前人通过蛋白或者基因表达所验证的肝组织分区现象（Liver zonation）有着高度一致，有效证明了SEAM方法的可靠性和准确性。作者还对人肝纤维化中的代谢异质性进行了空间代谢组和空间转录组联合分析。发现在肝纤维化样本中存在有两种代谢差异的肝细胞亚群，它们和纤维化区域的距离在不同样本间存在有统计学差异。通过代谢组和转录组的共同分析，发现其中的存在有谷丙酰胺的上调以及其对应代谢相关的跨膜转运蛋白的基因表达上调。虽然单细胞转录组的研究已经取得长足进展，与转录组及其表型研究密切相关的代谢组研究在单细胞水平目前还缺少方法。本文提出的“SEAM”方法，系统解析了组织空间中的单细胞代谢组，对于整个单细胞技术领域的进步具有重要的推进作用。该论文的共同通讯作者是清华大学张奇伟教授、清华大学张新荣教授、原清华大学陈阳副研究员（现中国医学科学院基础医学研究所研究员）。共同第一作者为清华大学自动化系、北京信息国家研究中心博士生原致远、清华大学生命科学学院、生命科学联合中心博士生周启明、清华大学化学系博士生蔡乐斯。中日友好医院潘琳教授在本工作中参与了病理切片相关实验指导和细胞类型鉴定。北京协和医院郑永昌教授提供了临床样本。清华大学北京市中医药交叉研究所李梢教授为项目研究提出积极建议。

抗体或激素等重组蛋白在生物制药市场具有良好的发展前景。目前，重组蛋白主要在中国仓鼠卵巢细胞中生产，这种类型的生产非常昂贵的。因此，人们需要开发新的、更便宜的和有效的表达系统。微藻便成为了一种很好的替代品，因为，微藻作为光合单细胞生物，它们的生长不需要昂贵和复杂的培养基，同时也能够在培养基中分泌蛋白质并进行蛋白质N-糖基化。近日，Plant Biotechnology Journal在线发表了题为“Fine-tuning the N-glycosylation of recombinant human erythropoietin using Chlamydomonas reinhardtii mutants”的研究论文。作者主要研究莱茵衣藻N-聚糖免疫原性表位缺失而开发的敲除策略是否适用于治疗蛋白的糖工程，这对于进一步开发微藻生产人类相容性生物制品至关重要。该研究进行了与人促红细胞生成素(hEPO)相关的聚糖的结构研究，以及这些聚糖在野生型莱因哈特氏C.菌株和关键高尔基糖基转移酶受损的突变体中表达。通过在野生型菌株中表达的重组hEPO (rhEPO)的糖蛋白组学分析表明，3个n -糖基化位点与含有4 ~ 5个甘露糖残基、携带核心木糖、核心焦点和o -甲基的成熟n -聚糖100%糖基化。此外，在C. reinhardtii插入突变体中，木糖基转移酶A、B和聚焦转移酶缺陷的表达导致与rhEPOs相关的n -聚糖的核心木糖基化和核心聚焦化急剧减少，从而表明该策略为衣原体制备的生物制品的n -糖基化人源化提供了前景。文献链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.14424