细胞培养支原体检测

[size=3][font=宋体]（[/font][font=Times New Roman]1[/font][font=宋体]）血清一定需要加热灭活[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=宋体]人们通常通过在[/font][font=Times New Roman]56[/font][font=宋体]°[/font][font=Times New Roman]C[/font][font=宋体]加热[/font][font=Times New Roman]30[/font][font=宋体]分钟的办法，来灭活血清中的补体，以及其中可能的微生物（比如支原体）的污染。加热灭活带来的问题是，血清中的氨基酸、维生素和生长因子等也会不同程度的被破坏。[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]Triglia and Linscott [/font][font=宋体]的研究发现（[/font][font=Times New Roman]1[/font][font=宋体]），胎牛血清中的补体含量很低，即使在未稀释的胎牛血清中，也观察不到溶血现象。另外[/font][font=Times New Roman]37[/font][font=宋体]°[/font][font=Times New Roman]C[/font][font=宋体]的加热能够有效灭活补体。所以对胎牛血清而言，并不需要通过专门的热灭活来灭活其中的补体。[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=宋体]早期的血清制备中的滤膜的孔径大于[/font][font=Times New Roman]0.22um[/font][font=宋体]，不能有效的去除支原体的污染。热灭活可以去除支原体的污染。但是现在血清制备中的终端滤膜的孔径为[/font][font=Times New Roman]0.1um[/font][font=宋体]甚至小到[/font][font=Times New Roman]0.04um[/font][font=宋体]，所以血清中一般没有支原体的污染。[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][font=宋体][size=3]综合上面的观点，除非有特别的情况，标准厂家生产的胎牛血清一般不需要加热灭活。[/size][/font][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][font=宋体][size=3]需要说明的是，有些厂家生产的胎牛血清质量并不符合标准。所以如果您的胎牛血清来自一家可信度不高的厂家，那么为了安全起见，还是以加热灭活为好。[/size][/font][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=宋体]（[/font][font=Times New Roman]2[/font][font=宋体]）培养液中一定要加抗生素[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][font=宋体][size=3]随着超净台技术的提高，和超净台在细胞培养中的广泛使用，在细胞培养过程中如果操作规范，引进污染的机会并不大。同时抗生素的使用大大增加了支原体等微生物污染的机会，所以普通的细胞培养，最好不要加抗生素。[/size][/font][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=宋体]（[/font][font=Times New Roman]3[/font][font=宋体]）细胞培养室要异常的洁净[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=宋体]由于以前超净台技术比较差，在超净台开启的时候，外面的灰尘可能飘到超净台里，笔者曾经见过的一个老式的没有空气过滤装置超净台，仅使用紫外线灯灭菌，这样实验室的清洁就显得很重要。现代的超净台从原理上来说，超净台外的污染源是很难到达超净台里面的[/font][font=Times New Roman]([/font][font=宋体]见文章[/font][font=Times New Roman]5[/font][font=宋体]：超净台的挑选和使用[/font][font=Times New Roman])[/font][font=宋体]。所以保持细胞培养室一定程度的清洁固然有助于减少污染的机会，但是过度的清洁，比如用[/font][font=Times New Roman]0.2%[/font][font=宋体]新洁尔灭拖地板，或者在培养室内加紫外线灯消毒，并不需要，更重要的是实验操作的规范。笔者曾经工作过的一个细胞培养室，维护实验室清洁的工作就是每天拖一次地板，每天大家进出并不换鞋换衣服，在[/font][font=Times New Roman]2[/font][font=宋体]年多的时间内从没有发生过任何污染。[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=宋体]（[/font][font=Times New Roman]4[/font][font=宋体]）在超净台上使用酒精灯[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][font=宋体][size=3]事实上使用酒精灯会造成空气对流，从而带起超净台面上的灰尘，反而增加污染的机会。更何况还增加了火灾的隐患。[/size][/font]

每天对待细胞比孝敬爹妈还用心，那真是捧在手里怕碎了，含在嘴里怕化了，看在眼里怕丢了 ，培养细胞时有哪些惨痛经验教训可以分享呢?早走早脱身，从此专注黑生物1. 严格无菌操作，多喷喷酒精，要是对灭菌的东西不放心，自己包自己送自己烘干。　　2. 不要和别人共用试剂耗材，自己准备一套。　　3. 有可能的话在拿到新细胞的时候做好支原体衣原体检测。　　4. 水浴锅很脏，生化培养箱要是得手动加湿的话盘里的水也会很脏，勤换 (灭菌水加进去)。　　5. 晚上离开的时候最好给细胞房照紫外，超净台是用完就开。　　6. 最好的是同一时间就你一个人在用细胞房在养细胞。　非科班出身经验分享　　1. 别怕浪费。枪头什么的只要有可能污染就换，如果用酒精灯就什么都稍微烤一下，别直接放到火上，离一段距离。　　2. 动作要既轻柔又有力。动作太重会有一堆一堆的气泡，动作太轻就吹不下来... 刚开始的时候吹细胞太痛苦了，稍微一下就起泡。后来就是吹的时候枪里的培养基不要一次全都压出来，留一点，枪的最头部尽量深的在液面以下。　　3. 离开过操作台的东西再进操作台之前一定要用酒精喷一遍，包括一切实验耗材、仪器、以及你带着手套的手。　　4. 实验结束后对实验台的消毒。紫外什么的，用前用后都照个 30 分钟。　　5. 身体的各个部分尽量的少接触不需要接触的地方的地方。比如实验台，又比如培养箱内部。　　6. 细胞的密度根据细胞的性质、传代的时间以及自己的心情来定。培养基的话最多最多不要超过 2 天就要换一次。细胞可以不传代，但是培养基是一定要换的。　　大概就是，不该碰的地方不碰，有影响的地方少碰; 该使劲的时候绝对不含糊，不该使劲的地方一定忍住。如果是比较简陋的操作台就一定要摆个酒精灯，所有操作紧密围绕在酒精灯周围进行。如果是高级台子就多用酒精喷喷。感觉生物的实验，心疼钱就还是不要做了。　　最后一点点绝对非科班的经验。癌细胞真是坚挺。有一次实在是不想传了，放了 5 天吧，感觉都长了几层出来，培养基都黄了。抱着试一试的心情传了一次，又坚强的活过来了。当然，状态肯定也差的很了。　换种心情，好好生活!　　养了三年细胞，各种肿瘤细胞，说一点自己的看法：　　1. 培养细胞前，可以看看细胞特点说明书，包括细胞正常生长的状态图、传代、培养基的类型等。　　2. 不同细胞生长周期不同，有的生长很快，比如说 MDA-MB-231，传代的时候取离心悬液的十分之一就已经足够了，有的又是特别慢，等的人心焦，BT474 就是，传代是一分二，复苏起始的时候两周多才能长满，所以就要在培养细胞的过程中多多摸索了。　　3. 对于娇弱的细胞，就得细心呵护了，胰酶消化不能过久，吹得时候要轻柔，离心时候也要注意转速和时间，每天都要去看一下细胞，肉眼观察培养基状况、显微镜下观察细胞生长状况。　　4. 冻存细胞复苏后第二天最好更换一次培养基。　　5. 培养箱隔一段时间彻底用酒精棉擦洗一次。　　6. 养细胞最大的教训：不能偷懒!　细胞虐我千百遍，我待细胞如初恋。　　1. 不管买的细胞、惠赠的细胞，刚拿到手赶紧做两件事：检测是否有支原体污染; 迅速扩增冻存。　　2. 发现有污染迅速处理掉，特别是当你养了很多种细胞时; 细菌污染，真菌污染很容易发现，支原体污染的话，细胞会长的慢，买个支原体检测的 kit 定期检测一下。　　3. 细胞房日常的值日清洁是必须的，此外还要定期熏蒸。　　4. 细胞的传代一定要规律，保持相同的 confluency 和传代时间间隔，不要随心所欲或者拖延。　　5. 注意个人卫生。　靠内心感动细胞　　1. 自己的细胞自己养，血的教训。　　2. 在生物安全柜 (或者超净台)，枪头，血清管，血清，培养基，瓶子都足够好，并且细胞房有良好的卫生措施 (比如隔离服，手套，口罩，清洁，HEPA 等等) 且不违法操作原则的情况下，你其实很难污染。　　3. 上述条件不完备的情况下，就要多注意无菌操作了：比如要用的东西提前拿到台子里照啊 (不过这个其实也不大好，因为会挡住紫外线)，使用前 SDS+酒精擦台子，进出超净台一定要酒精擦手。　　4. 少对细胞说话，多靠内心来感动它们 (是的! 心不诚是不可以的!) 至少 1 天看 1 次。　养细胞很容易　　养细胞真的不难，最关键几点：　　1. 所有的东西使用最好的，如果你用的血清、培养皿、培养基、胰酶什么的都是进口的，真的很难相信你会把细胞养坏。　　2. 动作要快，胰酶消化，换液什么，细胞暴露在空气中的时间越少越好。另外，要掌握好胰酶消化时间，所谓的细胞状态差，很多时候是传代的原因。　　3. 有时间的话，需要细胞计数，传相应数目的细胞到培养皿中，可以大致清楚细胞的生长曲线，不会临时要处理，手足无措。　　4. 要做什么心里要非常清楚，合理安排时间，细胞房的实验穿插进行，可以节省很多时间，也不会耽误别人的实验。　　5. 个人的实验器具自己收一套，不要和别人混用，最近换了什么新的东西稍微记一下，试剂一旦怀疑污染，马上丢。　　6. 细胞房不能进去太多人，避免相互干扰。　细胞养不好，自挂东南枝　　现在一大型药企养细胞做检测，工作量很大，很多地方都没办法非常仔细的做。但是两年下来只出现过一次污染，总结一下心得：　　1. 好的洁净室，空调系统跟得上。　　2. 好的生物安全柜，硬件跟的上。　　3. 瓶子移液器吸头大都是进口，耗材跟的上。除了这些就是自己的操作习惯了。　　4. 任何东西不要从敞开的瓶口上面经过。　　5. 虽然酒精灯会干扰安全柜气流但是还是需要一盏用来勤烧瓶口。　　6. 实验时所用材料的位置摆放要顺手，污染源和已灭菌物品要分开放置。　养细胞就像打仗　　细胞饲养涵盖的内容太广了，而且不同种类细胞的饲养难度以及技术要求不同，肿瘤细胞，成纤维细胞，上皮细胞... 甚至各类干细胞... 每一种都有自己的生长要求。如果只是单纯的一般性操作，大同小异，个人觉得练好技术的情况下注意几点就好:　　1. 各种无菌，从培养基到操作过程再到培养箱，时刻注意无菌。本人曾经所在的实验室出现过大规模污染并最终导致所有细胞集体毁灭... 教训惨痛。　　2. 培养基的配制一定要做好梯度摸索并详细记录，否则细胞死都不知道怎么死的。　　3. 尽量提高操作熟练度，减少培养皿在培养箱外的滞留时间，细胞很脆弱，经不起折腾，不像人，热了有空调，冷了能烤火。　　4. 把握好培养基更换的时间，不同细胞类型时间不同，早了浪费试剂，晚了可能全军覆没。　　5. 经验很重要，养细胞的很多经验你是无法在公开的书籍和资料上找到的。多向实验室前辈学习，他们会让你少走很多弯路，真的。　　养细胞就像打仗，知彼知己，百战不殆。只有了解你养的对象，才能把他养好。　细胞就是矫情　　养细胞细胞这个东西呢有的时候真说不清。养过一段时间的巨噬细胞，一开始操作各种谨慎小心，随时默念各种无菌原则，培养基什么的都用的进口的，其实国产货真的不差，有钱就是任性! 但细胞还是萎靡不振，两个多星期过后实在懒得管，换液等操作也很随意的草草进行，酒精也懒得喷，结果这货却开始疯长，过了几天居然达到一天要传一次代，而且数量甚至可以一传三， 所以说，有的细胞就是矫情。

最近我养细胞发现小黑点现象很严重，原来对“黑胶虫”一说嗤之以鼻，认为那不过是自欺欺人的借口，觉得怎么也不会发生在自己身上。但是真的就碰上了：要来的细胞传代以后就出现细胞间黑点，细胞空泡化，很多类似凋亡、坏死的细胞，最终细胞漂浮，完全死亡。上述现象很像所谓的“黑胶虫”。我感觉实际是支原体感染以后细胞生长不好造成的碎片和感染原虫的混合体。这种现象的直接原因是支原体等原虫感染，间接表象是小黑点，被以讹传讹成为了“黑胶虫”。光镜下看不到支原体，但是可以看到支原体感染的终末现象——细胞凋亡坏死，释放出大量碎片，看起来就像小黑虫子。查找类似的帖子——很多人是更换血清后出现这种问题；说空气传播的可能是一个培养箱的人都用了同一种血清，而不是可以通过培养箱空气传播；感染最可能是牛源性的支原体，通过产道或血行感染，所以兽用的泰乐菌素比较有效。用plasmocin等抗支原体的药物有效;用巨噬细胞共培养有效（吞噬支原体）；很多人更换进口血清就好了。感染也有个疾病谱，在质和量上从低烈度到高烈度，所谓“细胞生长不受影响”，其实是感染的烈度不高而已；烈度高的感染就出现细胞大量空泡形成，细胞间空旷地带出现大量黑点，细胞最终凋亡、坏死，漂起来。有些国产血清写着建议灭活，其实是挂羊头卖狗肉，那个56度30分钟更多的是为了杀杀支原体的。实际上也有杀不死的。但可以降低产品的风险。我用阿奇霉素（有针对支原体衣原体功效）75-100ug/ml的浓度洗了细胞和加入培养基中，小黑点确实明显抑制。不过我想根治就很难了。据说invivogen公司的plasmocin可以根治，不过就成本来说不如直接更换血清。以上是自己个人总结的一点看法。建议不要总拿子虚乌有的“黑胶虫”来说事。多考虑看不到的支原体，不要还停留在培根时代——只相信自己眼睛看见的。