无标记细胞成像分析

6月6日，深圳市倍捷锐生物医学科技有限公司（以下简称：倍捷锐）在厦门成功举办 “光学无标记高内涵定量相位成像产品发布会”， 正式发布两款基于自主研发的定量相位成像技术的生物成像产品系列:Basic系列与Pro系列。Basic 系列（来源：倍捷锐）Basic系列产品可实现高速、动态的活细胞分析，支持微流控分析、AI细胞识别等功能，可用于活细胞的高通量筛选等应用，同时兼容荧光成像系统。Pro系列（来源：倍捷锐）Pro系列产品具备更高精度与更强功能定制能力，可实现细胞精细结构的定量分析、活性与产量分析、细菌种类分析等，支持深度定制及荧光成像功能，服务于科研及合成生物等方向。无标记高内涵成像成像对比（来源：倍捷锐）倍捷锐致力于开创新性先进光学成像技术，并以无标记高内涵显微术-定量相位成像技术（QPI）作为核心，拓展其在生物医学的产业方向的应用。QPI技术能够定量表示细胞产生的形貌和动态变化，无需标记染色，只需通过测量被测微观物体透射光（或反射光）的相位延迟，即可生成反映物体形态学和动力学的图片。因此，QPI技术能够实现对细胞无损、长时间成像分析，降低对荧光等耗材的依赖。倍捷锐科技有限公司成立于2018年，坐落在香港科学园内。创始人来自麻省理工学院、香港中文大学、波士顿大学等高校。公司致力于开发国产创新先进光学成像产品，并以定量相位成像技术作为核心，拓展其在生物医学、微纳加工、材料等产业方向的应用。团队历经三年多时间，借助香港中文大学的科研实力，构建了完善的产学研转化模式，实现了细胞特性、血液分析多维度的检测技术积累。目前，倍捷锐团队拥有包括美国地区在内多项自主核心知识产权，完成3代原型机开发，与斯坦福、清华大学、浙江大学等国内外多所高校合作，原型产品已进入科研、工业领域实际应用。

活体光学成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物发光（bioluminescence）技术与荧光（fluorescence）技术。生物发光是用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA，今天，生物发光标记物可以标记到任何一种基因上，使对基因功能的全面细致研究成为现实。而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP, Cyt及dyes等）进行标记，利用荧光蛋白在外源光源或是内源发光照射下被激发产生的荧光作为检测信号。研究人员能够利用一套非常灵敏的光学检测仪器直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。 该技术可被广泛应用于标记细胞或基因的示踪及检测；基因治疗在活体动物体内直接的观察和检测；基因组、蛋白组学、药学及生物技术在活体动物内的研究；药物及化学合成药物的药物代谢及毒理学监测；食品菌落生长成像；皮肤医学中皮肤疾病的体内成像；法医鉴定；微孔板成像，例如：免疫分析、报告基因、基因探针和嗜菌作用分析等；荧光团的体内成像，例如：Alzheimer疾病研究中结合嗪的β-淀粉沉淀物分析；转基因植物中通过报告基因对生理周期节奏的研究；凝胶成像分析等等。 但在研究过程中，研究者们必须事先用基因技术进行荧光素酶基因标记，或者某种荧光报告基团标记。目前活体光学成像系统的知名制造商，如Berthold、GE、Xenogen、Photometrics、Carestream Health等，不仅为客户提供先进的仪器，也提供具体实验所需的整套解决方案，包括试剂、实验手册、特殊用途的质粒、细胞株、转基因动物、细胞处理和动物处理设施等配套技术支持。出色的多任务处理能力，人性化的整体设计，便捷精确的操作系统，使实验室影像分析领域进入了一个全新的时代。 下面以研究干细胞活体移植后的存活率为例，简介一两种内源性荧光色素标记的实验方法，供专业人士参考。 用荧光色素DiD标记 间充质干细胞 1. 先用胰蛋白酶消化待标记材料，使之成为一定密度的悬浮液； 2. 从细胞培养箱中取出间充质干细胞，吸取含原有培养基的细胞悬浮液进行标记； 3. 用10 ml Mg/Ca-free PBS （不含钙镁离子的磷酸缓冲液）清洗细胞，吸去PBS， 钙镁离子会影响胰蛋白酶的活性，必须小心； 4. 加入预热的0.05% 胰蛋白酶液，加液量以T75型瓶为例，每瓶加5ml， 确保瓶的表面被完全覆盖； 5. 在细胞培养箱中37° C 孵育约 5 分钟； 6. 然后在显微镜下确认细胞已经完全分散，如果有细胞贴壁情况，轻拍若干次或延长孵育时间直至酶解消化完全成功； 7. 加入等量含 10% FCS的培养基中和胰蛋白酶； 8. 用移液器反复吸取几次确保细胞均匀分散； 9. 然后移取细胞悬浮液至15ml 已灭菌的有盖聚丙烯离心管中； 10. 400 RCF离心5 分钟； 11. 小心移去上清液，不要扰动细胞； 12. 将细胞重新悬浮于DMEM 并进行计数； 13. 需要待标记细胞在无血清DMEM溶液中的密度应为1x106 /ml ； 14. 每ml细胞悬浮液加入5 ?L DiD 染色液； 15. 用移液器将染色液与细胞悬浮液混合均匀； 16. 在6孔低附着性细胞板上37 °C 孵育20分钟； 17. 孵育完全后移取细胞悬浮液至15ml 已灭菌的有盖聚丙烯离心管中； 18. 400 RCF离心5 分钟； 19. 小心移去染色液，不要扰动细胞； 20. 用PBS清洗细胞，用移液器反复吸取几次确保细胞均匀分散； 21. 重复洗三次； 22. 细胞重新计数并用台盼蓝染色法检测细胞活性； 23. 可以进行活细胞成像了！ 用荧光色素ICG标记 人胚胎干细胞 1. 必须先准备好吲哚菁绿溶液（血容量、心输出量、肝功能测定剂）作为对照品 ，然后使之与转染试剂鱼精蛋白（抗凝血作用）混合； 2. 测出1ml吲哚菁绿溶液的活力，然后在100 ?L DMSO中溶解ICG； 3. 向混合物中加入 400 ?L Dulbecco的改良Eagles 培养基 (DMEM + 10% 胎牛血清)， 震荡均匀，吲哚菁绿溶液终浓度为2mg/ml； 4. 加入转染试剂鱼精蛋白，鱼精蛋白作为对照品的载体，使之能够有效进入细胞； 5. 在300 ?L ICG 和 300 ?L 无血清Dulbecco改良 Eagles 培养基中混入 5 ?L 硫酸鱼精蛋白溶液, 使之终浓度为 10mg/ml,； 6. 震荡5分钟使之形成复合物，标记溶液制备完毕； 7. 从 hESC 10mm Petri 培养皿中移去原有培养基； 8. 加入5ml预热的 DMEM； 9. 加入制备好的鱼精蛋白/ICG 溶液， 37 °C下孵育1h； 10. 孵育完全后移去染色液； 11. 用5 ml PBS漂洗培养皿以清除染色液； 12. 移去 PBS 再加入 5ml 0.25 % 胰蛋白酶液，37 °C下孵育5分钟使之酶解，适当震摇培养皿效果会更好； 13. 用移液器反复吸取几次确保细胞均匀分散； 14. 加入等量含 10% KSR的培养基中和胰蛋白酶； 15. 然后移取细胞悬浮液至15ml 已灭菌的有盖聚丙烯离心管中，400 RCF离心5 分钟； 16. 在全培养基中悬浮细胞； 17. 如果还有细胞团块，可以移去原有培养基用10ml预热的全ESC培养基重新悬浮细胞，重复酶解再离心； 18. 在这一点上，鼠源饲喂细胞需从hESCs中分离； 19. 然后将细胞悬浮液移至涂布琼脂的10 cm 培养皿中； 20. 37 °C 孵育 45 分钟，注意不要晃动培养皿，如此鼠源饲喂细胞会贴壁而干细胞保持悬浮； 21. 从Petri 培养皿中移出已标记的单细胞人胚胎干细胞悬浮液； 22. 细胞重新计数并用台盼蓝染色法检测细胞活性； 23. 可进行活细胞成像了！

近年来，红外光谱和显微成像技术有了突飞猛进的发展,尤其是在生命科学领域，得益于红外光谱技术对于分子结构的敏感性，其能够在无任何标记的情况下实现对生物样品成分的鉴定和分布解析，这对于不便于荧光标记的一些生物样品鉴别十分有利。然而目前大多数的红外光谱空间分辨率受限于红外光的衍射限，只有10-20 μm，且依赖于红外光波波长。另外多数红外检测设备对于生物样品制样过程也有着严格要求，如样品切片厚度，细胞和组织尺寸，含水量，需要荧光染色等，这对于生命科学研究非常不利。 针对上述问题，美国photothermal spectroscopy corp公司经多年潜心攻关，研发出非接触亚微米分辨红外拉曼同步测量系统—mirage，该设备凭借其有的光学光热红外（o-ptir, optical photothermal infrared）技术克服了上述问题，将红外光谱的空间分辨率提升至亚微米（~500 nm）；无需制备薄片，直接测试较厚样品，大地简化了制样过程、提高测试效率；同时可实现无接触式地快速简易测量，有效避免了传统atr模式下的散射像差和交叉污染。且该设备在反射模式下所得谱图与透射模式下ftir完全一致，还可以选配透射模式，十分适用于液体样品和一些特殊混合样品，大的扩展了光热红外在生命科学领域的应用范围(如图1所示)。这项先进技术让mirage有别于传统的红外测试设备，能够对生命科学领域的常用样本，诸如细胞爬片，病理组织切片，单细胞细菌等有良好的兼容性，并让活细胞观测成为可能。除此之外，mirage还可与拉曼光谱进行联用，实现同时同地相同分辨率的ir和raman测试，且无荧光风险，能够帮助研究者更快速全面的确定所分析生物样品的化学组成信息。图1. o-ptir光学光热红外显微镜，工作原理及钙化乳腺组织的o-ptir红外成像图 光学光热红外o-ptir在生命科学领域应用的显著优势：1.亚微米的空间分辨率；2.可直接获取液体中活细胞的红外成像；3.灵敏度高，可直接观测单细胞 (如细菌、哺乳动物细胞等)；4.无米氏散射干扰，即使在细胞边缘也不受影响；5.高的光谱分辨率；6.无需直接接触即可测量软组织的红外光谱；7.可实现红外和拉曼同步测量；8.可实现超过10 μm厚的样品测试，直接置于载玻片上观察分析；9.可配置化的红外光源；典型案例分析：1.感染疟原虫的红细胞表征 疟原虫属寄生虫引起的疟疾是威胁生命的主要疾病之一，而疟原虫引发的感染周期十分复杂，因此在细胞和分子水平观察疟原虫的变化对于研究疟原虫的致病有着重要意义。agnieszka m. banas等人通过使用o-ptir对疟原虫感染的红细胞在亚微米尺度的分子特征变化进行了表征，结果显示正常红细胞的蛋白呈现环状分布，而感染后的红细胞蛋白质则呈现无规则分布。通过对比传统ftir与基于o-ptir技术能够发现，o-ptir能够提供更为详细的图像分辨率并且能够测量红细胞不同位置的光谱信息。而传统ftir受制于米氏散射限制，效果较差。图2. 对比ftir与o-ptir对红细胞成像的结果：(a)红细胞的白光图；(b)图a中红色方块放大的区域；(c,e)ftir的蛋白/脂质空间分布的红外成像；(d,f)o-ptir的蛋白/脂质空间分布的红外成像；(g)红细胞的ftir红外光谱；(h)红细胞的o-ptir红外光谱 (g,i)疟原虫感染红细胞和正常红细胞的pca（pc1&pc2，pc1&pc3）得分；(h,j)疟原虫感染红细胞和正常红细胞的pca（pc1&pc2，pc1&pc3）得分 参考文献：b. [malaria] “comparing infrared spectroscopic methods for the characterization of plasmodium falciparum-infected human erythrocytes” (nature communication chemistry, https://doi.org/10.1038/s42004-021-00567-2). advantages: 1, 3, 4, 5, 6 2.单个病毒的红外成像 受制于红外限分辨率的限制，单个病毒的红外光谱成像一直以来都是十分困难的，对于只有100 nm左右的病毒进行红外光谱成像显得十分无力。yi zhang等人使用o-ptir技术成功实现对单个痘病毒进行了检测，并成功观测到了病毒的外形，并对病毒表面的蛋白的光谱进行了表征。图3.单个痘病毒的光谱和成像表征。(a)痘病毒的干涉散射图像 (b)痘病毒1550cm-1波束下的mip图像 (c)痘病毒1650cm-1波束下的mip图像 (d)随机选取病毒上4个点的光谱 参考文献：“vibrational spectroscopic detection of a single virus by mid-infrared photothermal microscopy” (analytical chemistry, https://dx.doi.org/10.1021/acs.analchem.0c05333). advantages: 1, 3, 4, 5, 6 3. 光学光热红外o-ptir与raman光谱协同分析固定或活的单细胞 英国曼彻斯特大学的peter gardner教授近期发表了他们关于活(和固定)细胞振动光谱分析的新研究结果。作者使用光学光热红外o-ptir与raman光谱，并借助于两个激发源（qcl和opo激光器），对细胞进行了宽光谱范围的覆盖，从而使所有与生物学相关的分子振动都能被检测到，且保持一致的亚微米的空间分辨率。此外，红外光谱采集与拉曼光谱有效的结合起来，在相同的激发位置，形成振动互补，得到一套完整的振动光谱信息。如下图所示，该红外和拉曼的组合方式可以用来分析液体环境中固定或活细胞的亚细胞结构，其中的蛋白质二次结构及富脂体均可以在亚微米尺度上被有效地识别出来。 图4. o-ptir观测固定未染色mia paca-2细胞成像。(a)固定的未染色的mia paca-2细胞的光学图像；(b)红色方块区域的放大图像；(c)opo波束段的o-ptir红外光谱；(d)qcl波束段o-ptir的红外光谱；(e)黑色区域的拉曼和红外光谱 参考文献d. [mammalian cancer cell] “analysis of fixed and live single cells using optical photothermal infrared with concomitant raman spectroscopy” (analytical chemistry, https://dx.doi.org/10.1021/acs.analchem.0c04846). advantages: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 74. o-ptir与s-xrf联用探究阿尔兹海默症阿尔兹海默症是老年痴呆症常见的病因之一，而淀粉样β蛋白沉淀是引发ad的重要病因之一，因此对于淀粉样β蛋白分布的研究就显得十分重要。nadja gustavsson等人通过o-ptir成功观测到了神经中的淀粉样β蛋白分布，并且结合s-xrf分析发现铁簇与淀粉样β-折叠结构和氧化的脂质存在共定位关系。这项研究充分预示了o-ptir/s-xrf联合技术可在ad疾病的研究中发挥重要作用。图5.单个神经元的o-ptir与x光荧光成像。（a）单个神经元的光学（左）与o-ptir图像（中和右）（b）神经元上铜、铁的分布（c）铁与蛋白叠合图（d）铁与脂质的叠合图参考文献[neuron] “correlative optical photothermal infrared and x-ray fluorescence for chemical imaging of trace elements and relevant molecular structures directly in neurons” (“light: science & applications” https://doi.org/10.1038/s41377-021-00590-x) advantages: 1, 3, 4, 5, 6 用户单位： 用户评价：