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双向电泳篇 1. 重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽,直接跑 2D 的一向吗? 一般情况下是可以的。但当上样量特别大时,可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收,这样跑完 1D 和 2D 胶后,会有很多横向条纹。所以在这种情况下,最好在重泡胀后,将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。 2. 为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少,暴露出了胶条的背面? 这是因为 BioRad 的电泳槽有个盖子。为了固定电泳槽中的胶条,这个盖子上设计了对应的突起,以便压住胶条。由于虹吸作用,这个突起会导引矿物油到相邻的空电泳槽,从而降低有胶条的电泳槽中的矿物油液面。如果由此把胶条暴露在空气中,那对等电聚焦的影响将是毁灭性的。为了防止这个现象的发生,可以在相邻的空电泳槽里,也加入适量( 80 %满)的矿物油。 3. 跑第一向时,为什么要设定一个电流的最大值电压(50 μ A/ 胶)? 电流的平方和功率成正比。电流增大,功率增大,放出的热量也随之增大,就会导致胶条的温度增加。当温度超过 30 摄氏度时,缓冲液里的尿素就容易解离,产生一些极性分子,从而对等电聚焦产生影响。 4. 跑第一向时,为什么刚开始的电压比较低,而后逐渐增高? 刚开始时,体系内的带电小分子比较多(比如无机盐和双极性分子)。所以在这个阶段,电流主要是由这些小分子的移动所产生的。由于这些分子质量小,移动他们不需要很高的电压。当这些小分子移动到他们的目的地时(无机盐移动到极性相反的电极;两性分子移动到对应的 pH 条带),体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务,逐渐向所对应的 pH 区域移动。 5. 跑第一向时,为什么会产生一条蓝色的条带,并逐渐向酸性端移动? 蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。溴酚蓝也是 pH 指示剂,当它移动到酸性区时( pH4 ),颜色会变成黄色。溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后,蛋白质大分子聚焦之前。 6. 跑第一向时,为什么电压总达不到预定值? 当上样量比较大时或体系内盐分比较多时,聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。 7. 跑第一向时,在电压达到预定值后,电流为什么会降低? 当上样量比较少时,所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的 pH 值区域值,从而变成中性分子。这样,体系的电阻越来越大,在恒定的电压下,电流就会越来越小。 8. 跑第一向时,为什么在两个电极丝附近有气泡产生? 等电聚焦完成后,所有的蛋白质都移动到了相应的 pI 值区域,而成为中心分子。这是加在体系上的电压就开始电解水分子,在阳极产生氧气,在阴极产生氢气。 9. 重泡胀缓冲液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么,双极性分子的作用是什么? 硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性,特别是碱性蛋白的溶解性。双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性。当蛋白移动到相应的 pH 值后,就变成了中性分子。而不带电荷的蛋白质分子容易聚集,从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率,可能会造成竖的脱尾。而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相互作用,防止它们的聚集。 10. 怎样估计 2D 胶上蛋白质点的分子量和 pI 值? 可以用 BioRad 生产的 2D 胶标准蛋白来校准。也可以用体系内已知蛋白来做比对。 11. 为什么 2D 胶上的蛋白点有横的和竖的脱尾? 横的脱尾可能是: 1 )一向等电聚焦不完全; 2 )某些蛋白质本身的原因(糖蛋白); 3 )蛋白的丰度太高。竖的脱尾是因为跑二向时,蛋白的溶解度不好。 12. 什么成分会影响 2D 胶的效果? 核酸,盐,去垢剂等等。 13. 2D 胶的上样量应该在什么范围? 上样量和样品有关。样品内蛋白种类多的上样量要大些,这样每个点才有足够的量被检测到。一般的全细胞裂解体系,上样量大概在 100 微克(银染)到 500 微克(考染)之间。 14. 我的蛋白质浓度很低,应该用什么方法来浓缩? 蛋白质的浓缩有很多方法。大致有超滤法,沉淀法和透析法。超滤比较温和,对蛋白质不会有修饰和改变,蛋白的种类一般不会有丢失。它的缺点是总样品的量可能会减少(被膜所吸附)。另外超滤对样品的要求比较高。甘油,去垢剂都会堵塞滤膜,影响超滤的效果。沉淀法比较快速,容易操作,对盐,甘油,去垢剂的耐受性好。缺点是可能会有部分种类的蛋白没有被沉淀下来(丢失)。沉淀法中,又以 TCA 法最为普遍使用。使用 TCA 法时,一定要用冷的纯丙酮清洗蛋白沉淀两次,去处残留的 TCA 和其他沉淀下来的杂质。透析法只使用于量比较大的样品,量小时,操作困难。 透析法可以和超滤法联用。先把样品透析到一个比较干净的环境( 不含盐,甘油,去垢剂或其它杂质,比如碳酸氢氨溶液),然后再进行超滤。
请问,双向电泳的电源电压要求多大。
一、实验原理:2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离,第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同,而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。二、实验步骤:1. 样品的溶解取纯化后的晶体蛋白3.0mg,加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右,共处理一个小时。其中每隔10~15分钟振荡一次,然后13200rpm离心15min除杂质,取上清分装,每管70ul,-80℃保存。2. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA(牛血清白蛋白)用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。取7个10ml的离心管,首先在5个离心管中按次序加入0ul,5ul,10ul,15ul,20ul 的BSA溶解液,另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液,再在每管中加入相应体积的双蒸水(总体积为80ul),然后,各管中分别加入4ml的Bradford液(原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用),摇匀,2min在595nm下,按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值,再测样品OD值。(测量过程要在一个小时内完成)。3. 双向电泳第一向——IEF(双向电泳中一律使用超纯水)3.1 水化液的制备称取2.0mg 的DTT,用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05% 的溴酚兰,3.5ul(0.5%v/v)IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀,13200rpm离心15min 除杂质,取上清。在含300ug 蛋白(经验值)的样品溶解液中加入水化液,至终体积为340ul,振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质,取上清。3.2 点样,上胶分两次吸取样品,每次170ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧,再用镊子拨开 Immobiline DryStrip gels (18cm,pH 3-10)胶条,从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品。注意:胶条使用前,要在室温中平衡30分钟;加样时,正极要多加样,以防气泡的产生;压胶时不能产生气泡;酸性端对应正极,碱性端对应负极;样品加好后,加同样多的覆盖油(Bio-Rad),两个上样槽必须与底线齐平。3.3 IPG聚焦系统跑胶程序的设定(跑胶温度为20℃)S1 (30v, 12hr, 360vhs, step)S2 (500v, 1hr, 500vhs, step)S3 (1000v, 1hr, 1000vhs, step)S4 (8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad)S5 (8000v, 5hr, 40000vhs, step) 共计44110vhs, 19.5小时其中S1用于泡胀水化胶条,S2和S3用于去小离子,S4和S5用于聚焦3.4 平衡用镊子夹出胶条,超纯水冲洗后,在滤纸上吸干(胶面,即接触样品那一面不能接触滤纸,如果为18cm的胶条要将两头剪去),再以超纯水冲洗,滤纸吸干(再次冲洗过程也可省略),然后用镊子夹住胶条以正极端(即酸性端)向下,负极端(即碱性端)向上,放入用来平衡的试管中(镊子所夹的是碱性端,酸性端留有溴酚兰作为标记),用平衡液A,平衡液B先后平衡15min. 注:平衡时要注意保持胶面始终向上,不能接触平衡管壁。平衡第二次时,在沸水中煮Marker 3min,剪两个同样大小的小纸片,长度与一向胶条的宽度等同,然后吸取煮好的Marker,转入SDS-PAGE胶面上,保持紧密贴合;同样在第二次平衡时,煮5%的琼脂糖10ml.4. 双向电泳第二向——SDS-PAGE4.1 配胶(两根胶条所用剂量)分离胶:(T=8% 80 ml):溶液于真空机中抽气后再加APS和TEMED30 % 丙烯酰胺储液 21.28ml分离胶buffer 20ml 10%APS 220ul TEMED 44 ul双蒸水 38.72ml浓缩胶:(T=4.8% 10ml)30 % 丙烯酰胺储液 1.6ml浓缩胶buffer 2.5ml 10%APS 30ul TEMED 5ul双蒸水 5.9ml4.2 灌胶将玻璃板洗净后,室温晾干,然后,将电泳槽平衡好,玻璃板夹好,再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏胶,倒入正丁醇压胶,凝胶后(这时会出现三条线),用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再用滤纸除水后,倒入浓缩胶,正丁醇压胶,凝胶后,用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再加入超纯水,用保险膜封好。