质谱短肽链分析

抗体药物中的糖链对抗原性、生物活性、高级结构的稳定性均有很大的影响，因此直接关系到药品的安全性和有效性。由于培养工艺条件的变化会导致抗体药物中的糖链分布不均匀，所以在生产阶段对糖链的管理非常重要。现阶段虽然在日本药典中并未收录糖链的测定方法等内容，但在相关领域有关于介绍测定方法的需求。 本文为您介绍使用超快速液相色谱仪“Nexera X2”和高灵敏度荧光检测器“RF-20AXS” 对抗体药物中的糖链进行分析的方法。该测定方法使用了Core-Shell 型快速分析液相色谱柱“AerisTMPEPTIDE XB-C18”。 因为该色谱柱用于分离分子量较小的肽或进行肽图分析，所以可有效分离抗体药物中所含的糖链与杂质。 岛津荧光检测器RF-20Axs RF-20Axs是带温控功能的分光荧光检测器，采用新光学系统，实现了领先世界水平的高灵敏度。通过附加流通池的温控功能，大幅提升了峰响应对环境温度变化的稳定性。采用帕尔贴元件温控荧光检测器的流通池，可以将流入流通池中的样品的温度保持恒定。伴随温度变化发生荧光强度变化的化合物也可以进行稳定的定量分析。　 了解详情 请点击“使用荧光检测器RF-20AXS 对抗体药物进行高灵敏度糖链分析” 关于岛津 岛津企业管理（中国）有限公司是（株）岛津制作所于1999年100%出资，在中国设立的现地法人公司，在中国全境拥有13个分公司，事业规模不断扩大。其下设有北京、上海、广州、沈阳、成都分析中心，并拥有覆盖全国30个省的销售代理商网络以及60多个技术服务站，已构筑起为广大用户提供良好服务的完整体系。本公司以“为了人类和地球的健康”为经营理念，始终致力于为用户提供更加先进的产品和更加满意的服务，为中国社会的进步贡献力量。 更多信息请关注岛津公司网站www.shimadzu.com.cn/an/ 。

大家好，本周为大家分享一篇最近发表在Analytical Chemistry上文章，High-Throughput, Quantitative Analysis of Peptide-Exchanged MHCI Complexes by Native Mass Spectrometry1。该文章的通讯作者是美国基因泰克公司的Wendy Sandoval研究员。　　癌症疫苗是通过利用肿瘤细胞相关抗原，来唤醒人体针对癌症的免疫系统。常见的策略是通过对病人的肿瘤细胞样本进行基因测序来寻找特征性抗原肽，该抗原肽会与I类主要组织相容复合体(MHCI)相结合并呈递至CD8+细胞表面，通过与CD8+细胞表面受体相结合从而诱导免疫反应。为了实现整个过程，研究人员通常会结合基因测序和计算机预测结果设计多个候选抗原肽，每个候选肽都需要通过实验测试来确认它与MHCI分子的结合能力以及相关免疫原性。此外，考虑到编码MHCI的基因具有多态性，候选抗原肽还需要与不同等位基因编码的MHCI分子进行测试。因此，本文开发了一种高通量方法，利用非变形质谱快速筛选候选抗原肽并表征形成的肽-MHCI复合物(pMHCI)。　　pMHCI复合物中抗原肽的体外载入一直以来都是难点，因为MHCI复合物(包括HLA和β2M亚基)本身并不稳定，需要长度为8~10的多肽链载入到MHCI的凹槽以保持完整。本文则通过利用紫外光裂解肽-MHCI复合物(UV-MHCI)的肽交换实现抗原肽的载入，具体步骤如图1A所示，通过紫外光照，UV-MHCI中的高亲和肽被切割转为低亲和肽段，该低亲和力肽段极易发生肽交换，通过监测新的pMHCI复合物的形成实现对候选肽的评估。目前常用的检测pMHCI形成的工具包括ELISA、TR-FRET以及2D-LC-MS。然而这些方法仅能提供有限的信息关于肽交换、pMHCI分子质量，对形成的pMHCI复合物无法进一步的表征。事实上，pMHCI复合物对后续诱导免疫反应至关重要。　　图1. 癌症疫苗的免疫监测的示意图：A) 筛选流程，B检测方法。　　为了确认非变性质谱(nMS)能否用于pMHCI复合物表征以及肽交换率的检测，作者对UV-MHCI以及6个标准肽段进行了考察(图2)。未经UV照射的UV-MHCI MS谱图(图2A)可以观察完整的UV-MHCI复合物以及丢掉紫外光裂解肽的MHCI。MHCI复合物被认为是气相解离产生的，因为没有活性肽的稳定作用，MHCI很难存在于溶液相中，溶液中没有MHCI，“空壳”的MHCI只有可能是质谱中UV-MHCI的气相裂解产生的。图2B证实了这一观点，经紫外光照射后，紫外光裂解肽由高亲和力转为低亲和力，从MHCI上脱落，MHCI解离成HLA和β2M亚基，谱图中能观察到HLA和β2M亚基信号。确认了MHCI是由peptide-bound population产生的信号，作者开始用该方法去定量标准肽的肽交换率。如图2C为UV-MHCI与标准肽孵育并过夜UV照射得到的谱图，仅观察到完整的pMHCI以及“空壳”MHCI的信号，说明实现了100%的完全肽交换。如图2D，肽交换率随孵育时间改变，2小时孵育时间足以实现最大肽交换。　　图2. nMS表征UV光照A)前B)后的UV-MHCI复合物，C)nMS测定UV-MHCI与标准肽的肽交换率，D)标准肽肽交换率随时间的变换情况。　　为了提高分析通量，减少样本消耗，作者在nMS基础上开发了SEC-nMS和CZE-nMS系统。作者用SEC-nMS系统测定了50个候选肽的交换率，说明该系统能够进行中或大规模的数据采集。相比较SEC-nMS而言，CZE-nMS系统具有更高的灵敏度和通量，样品体积消耗从微升减少至纳升，分析时间也缩短为2 min(图3A)。检测信号与进样量呈线性关系，注射体积为3 nL时，最低检测限为6 ng(图3BCD)。作者测定了67个候选肽跨越4种等位基因编码的MHCI分子的肽交换率(图3E)。此外，通过将UV-MHCI复合物同时与四种以上的候选肽进行孵育可在单个实验中同时检测它们的相对肽交换率以及与MHCI结合的亲和力(图3F)。作者还提出Vc50这个概念，即导致50%的pMHCI复合物发生解离的碰撞电压，可作为评估pMHCI复合物稳定性的重要参数。　　图3. 使用CZE-MS系统高通量分析pMHCI复合物　　除了检测pMHCI复合物的形成，测定肽交换率，nMS还可以对形成的复合物进行进一步的结构表征。如图4所示，native top-down的分析策略可获得多层次的结构信息。本文使用的Orbitrap Eclipse “Tribrid” 质谱，图4A为完整pMHCI的MS1谱图，图4B为施加源内电压(SID)促使蛋白解离为亚基，图4C是将14+ pMHC单独分离出，为后续HCD活化做准备。图4D为pMHCI复合物经HCD解离后的MS2谱图。图4E和图4F则分别为对肽段以及HLA亚基进行top-down测序的结果。这些多层次的结构信息能够帮助区分HLA亚型、阐明候选肽的序列，包括一些PTMs、二硫键信息。这些结构细节可能会影响候选肽与MHCI分子间的亲和力甚至是后续T细胞受体的识别。　　图4. Native top-down分析策略获得pMHCI复合物的多层结构信息　　总之，本文将非变性质谱(nMS)与分子排阻(SEC)或毛细管电泳(CZE)分离技术相结合用于高通量筛选pMHCI复合物中的候选肽。该方法能够直观确认pMHCI的完整性，Vc50可作为评估复合物气相稳定性的重要指标，通过native top-down分析策略可获得多层次的结构信息。以上所有确保了后续临床T-细胞实验的正常进行。　　撰稿：刘蕊洁　　编辑：李惠琳　　原文：High-Throughput, Quantitative Analysis of Peptide-Exchanged MHCI Complexes by Native Mass Spectrometry　　参考文献　　1. Schachner LF, Phung W, Han G, et al. High-Throughput, Quantitative Analysis of Peptide-Exchanged MHCI Complexes by Native Mass Spectrometry. Anal Chem. 2022 10.1021/acs.analchem.2c02423. doi:10.1021/acs.analchem.2c02423

淀粉样变性是一种罕见而复杂的疾病，通常涉及多个器官，其中肾脏是最容易受累的器官之一。金域医学每年诊断超过400例淀粉样变性肾病的病例。为了更好地帮助医生进行精准的诊断、分型和治疗，金域医学于2020年成立了淀粉样变性研究中心，依托病理学、质谱学、基因测序等多个技术平台，通过多学科协作机制为临床上的疑难病例提供精准的诊断依据。最近，这些技术平台再次协同合作，成功帮助一位年过半百的患者揭示了下肢水肿的真正原因。这一成功案例突出了金域医学在淀粉样变性领域的卓越研究和诊断能力，为患者提供了宝贵的医疗支持，同时也有望为医学领域的淀粉样变性疾病研究和治疗提供更多的见解。这一联合努力强调了金域医学对罕见病领域的承诺，以确保患者获得最佳的医学护理和治疗。多技术平台联合揭示，罕见淀粉样变性分型一位52岁的患者，双下肢水肿持续了整整一个月。临床医生根据尿蛋白、血浆蛋白和血肌酐等检测结果，初步诊断为肾病综合征。然而，确诊肾病的关键还需要进行肾脏活检以明确病理类型。肾穿刺样本被送至金域医学进行病理检查，结合组织形态学、超微病理和免疫病理结果，金域的病理医生最终确诊为淀粉样变性肾病，并初步排除了轻链型淀粉样变性肾病。淀粉样变性的不同分型会有不同的病因和治疗方法。为了明确分型，金域病理医生与临床医生充分交流后建议进行质谱分析。在病理医生的指导下，质谱技术人员采用激光显微切割仪采集了组织切片上的刚果红阳性部位，然后使用高级质谱技术进行蛋白鉴定分析。结果显示，患者被诊断为AApoAI型淀粉样变性，这是与载脂蛋白A1相关的淀粉样变性。AApoAI型淀粉样变性是一种遗传性疾病。为了更准确地了解其遗传特点，金域医学的分子遗传室进行了全外显子组测序检测，结果显示存在APOA1基因NM_000039.2:c.220TC(p.Trp74Arg)杂合变异，这在其他家族性内脏淀粉样变性患者中也被多次报道。综合了病理、质谱分型和基因检测的结果，最终为患者确定了AApoAI型淀粉样变性（遗传型）的确诊。这个漫长的15天的探索之旅终于落下帷幕，患者也终于得到了合适的治疗方案。成立淀粉样变性研究中心，深入探索罕见疾病金域医学的淀粉样变性诊断绝不容忽视。在国内，只有寥寥数家实验室具备如此全面的检测能力，令淀粉样变性无处可藏。金域医学以领先的病理学、质谱学、基因学等多技术平台为依托，于2020年创立了淀粉样变性研究中心，至今已成功完成近千例样本检测。中心汇集了跨领域的专家团队，包括病理学、质谱学、基因学等领域的专家，这支团队可与临床医生进行多学科协作，深度探讨罕见病例，全方位提升专业服务水平。为更好地满足临床需求，金域医学最近对淀粉样变性分型项目进行了全面升级，特别为疑难病例提供了多平台检测。同时，病理医生还提供综合性的诊断报告和MDT（多学科会诊）服务，进一步促进淀粉样变性的精准分型。这一综合性方法可确保每位患者都得到最专业的诊断，为罕见疾病的早期发现和治疗提供坚实支持。

相关新闻：Pittcon 2014新品速递：光谱、x射线　　仪器信息网讯 2014年3月2日-6日，Pittcon 2014(Pittsburgh Conference on Analytical Chemistry and Applied Spectroscopy，匹兹堡展览会)在美国伊利诺斯州芝加哥召开。仪器信息网作为国内唯一行业媒体参加了本次展会。下面介绍此次展会上各大厂商展出的质谱、波谱相关新品。　　展会上，AB SCIEX展出了CESI&ndash MS新品，该产品采用超低流速毛细管电泳电喷雾离子化技术，将毛细管电泳(CE)及质谱(MS)结合，特别适用于生物制药领域，可以缩短新药的上市时间，预先发现潜在风险。　　沃特世推出了创新的ionKey/ MS系统，该系统通过iKey微流分离装置将UPLC分离整合到质谱仪上。iKey微流分离装置只有智能手机一样的大小，但包含了流路连接、电子设备、ESI接口、色谱柱加热器、eCord智能芯片，以及1.7&mu m颗粒填充的内径150 µ m通道。该设备能够连续进行数百个UPLC分离，同时确保重复性，并且分析性能不会降低。此外，即插即用，简化用户操作。 　　布鲁克推出了新款autoflex speed MALDI-TOF (/TOF) ，该仪器提高了生物标志物发现、聚合物分析、脂质和糖链分析、质谱成像等的分析效率。　　布鲁克还展示了第二代的GC-APCI-MS接口，它实使布鲁克的色谱和质谱仪更加方便的连接。新的接口在保持优良的气相色谱分离性能的同时可提供更高的灵敏度和更好的动态范围。　　在此次展会上，岛津展示了Crude2Pure(C2P)，该仪器是世界上第一台自动净化/粉末化技术，减少操作时间，使得研究人员把重点放在合成和分离目标化合物的重要工作。基于纯化方法的增强，C2P可以与制备液相色谱使用。从复杂的天然物和低分子量的有机化合物中纯化目标化合物，这种创新在各种领域，包括制药、食品科学、化学、政府和学术研究提升效率。　　此外，岛津还展出了LCMS-8050 三重四极杆液质、气相色谱GC-2014、Nexera HPLC/UHPLC Method Scouting System和基于色谱原理的UF-Amino氨基酸分析仪。　　波谱方面，布鲁克在发布会上发布了核磁以及超导磁体。布鲁克minispec小核磁MQ和MQ-1系列，易于使用并且成本低。复杂的固体脂肪含量(SFC)的分析，是minispec小核磁的主要应用之一。　　布鲁克Ascend&trade Aeon 900超导磁体是一种不用液氮，使用氦再液化技术的超导磁体系统。它提供可以长期、放心的操作，无需用户维护。传统900兆的磁体需要占用两层实验室。凭借在超导材料、连接技术和磁体设计方面的进步，新的紧凑型Ascend&trade Aeon 900磁体可以放置在单层实验室。　　赛默飞展出了微型核磁共振波谱仪picoSpin 80，该仪器是一款强大的，高分辨的分析仪器。这款仪器是先前获得R&D 100和爱迪生奖的picoSpin 45基础上改进而来。

激活您云端的超高分辨质谱分析服务及培训 “蛋白质药物质谱分析培训班”由北京亦庄生物医药园公共技术服务平台主办，赛默飞世尔科技有限公司协办。北京亦庄生物医药园公共技术服务平台基于赛默飞 Q Exactive Orbitrap的超高分辨质谱平台将于2014年8月正式投入运营，该平台将为北京乃至全国生物制药企业提供蛋白质药物质谱分析服务。为使超高分辨质谱平台的服务更具效率，平台将推出“云质谱”模式，并且于2014年8月-11月举办“蛋白质药物质谱分析培训班”，为质谱使用者提供理论知识学习和上机实践的机会。 目前国内的质谱分析服务普遍模式是：客户提供原始样品，服务方给出最终报告。亦庄生物医药园超高分辨质谱平台不但提供此类服务，更进一步推出了“云质谱”模式。“云质谱”服务形式为：用户提供处理后样品，服务方出具原始质谱数据，客户自行分析质谱数据 目前很多用户缺乏使用超高分辨质谱的经验，尤其是数据分析的能力不足，为减少用户使用超高分辨质谱的技术障碍，使平台发挥最大的效能，平台将举办“蛋白质药物质谱分析培训班”。该培训班作为“云质谱”模式的启动按钮：课程将贯穿样品处理、质谱采集、数据分析全过程。培训重点为样品处理与数据分析，相关内容如下： 主要内容：单克隆抗体结构分析、ADC药物分析、肽指纹图谱解析及蛋白药物的修饰、二硫键和寡糖的分析。延伸内容：残留细胞蛋白鉴定、蛋白代谢分析、未知肽段测序等。讲师聘请：聘请的讲师具有10年以上大分子质谱应用经验。教材编写：为本课程专门编写国内唯一的蛋白质药物分析中文教程。授课方式：小班授课（不超过15人），人人上手操作。 “蛋白质药物质谱分析培训班” 现已启动报名（由于名额有限，目前优先亦庄地区企业，8月8日之前报名或一次性选择三阶段课程可享受8折优惠），费用及课程安排请点击网址了解详细：http://www.etownbio.com/AdviceCentre/Technicalexchanges/2014/0717/100.html 电话咨询：徐女士：400-808-5631/010-56315257/13301051769牛博士：010-56315258/13810097007 （pFind、pNovo、pLinks为中国科学院计算技术研究所pFind团队版权所有系列软件，特授权使用。在此对pFind团队表示感谢！）

近年来，以三氟乙酸（TFA）为代表的超短链全氟烷基化合物（超短链PFAS）大量赋存于城市河水中这一问题已对城市生态及饮用水生产带来了巨大挑战，监测和精确定量饮用水源中的超短链PFAS已经迫在眉睫。针对高极性的超短链PFAS，高效环保的超临界流体色谱质谱联用技术可以提供良好保留和高灵敏度检测结果。背景介绍PFAS是一类广泛用于消费品和工业生产的含氟有机化合物。全氟辛烷磺酸(PFOS)和全氟辛酸(PFOA)是两种含八个碳的全氟烷基酸类化合物（PFAA），因具有较高的环境持久性和毒性，已在全球范围内逐步淘汰。然而，取而代之的是一些超短链（C1&minus C3）（图1）和短链（C4&minus C7）PFAA，其在环境、血液及尿液样本中正在被广泛检出【1,2】，引发了人们对健康影响的担忧。图1 超短链（C1&minus C3）全氟烷基化合物特别是含量较高的三氟乙酸被认为含有损坏生育能力和儿童发育毒性，正在全球范围内引起广泛关注。据欧洲新闻网报道，欧洲农药行动网络（PAN Europe）及其成员于5月27日联合发布了一项研究报告，对来自10个欧盟国家的23个地表水样本和6个地下水样本的联合调查发现，所有检测的水样中均检测到PFAS，其中23个样本（79%）的TFA浓度超过了欧盟饮用水指令中“PFAS总量”的拟议限值；而在检测到的总PFAS中，TFA占总量的98%以上【3】。TFA是含有两个碳的全氟羧酸，属于超短链（C1&minus C3）全氟烷基化合物。其在环境中普遍存在，主要来源包括PFAS农药、氢氟碳化物制冷剂、污水处理和工业污染（图2）。尽管目前对TFA的生物毒性效应研究有限，考虑到其持久性和全球传播特性，正在引起全球多国的密切关注【4,5】。图2 杀虫剂、杀菌剂和药品中的碳键全氟甲基在环境条件下通过氧化裂解转化为TFA特色应用方案使用高效环保的超临界流体色谱（SFC）分离技术，结合超高灵敏度三重四级杆质谱检测器，岛津中国创新中心开发了包括TFA在内的五种超短链PFAS快速分析方法。与反相液相色谱不同，SFC可以充分保留仅有一到三个碳的超短链PFAS，有效降低基质的干扰（图3）。图3 SFC-MS/MS和LC-MS/MS分析超短链PFAS色谱对比图（1ng/mL标液）使用SFC-MS/MS对纯水配置的系列标准溶液进行分析，可得到良好线性和较低检测限（见表1），进一步，对不同地表水样品进行检测，结果发现，均检测到一定量TFA，使用内标法定量，分别为几百个到几千个ppt，说明TFA在城市水体都存在较为严重的污染（图4、图5）。图4 SFC-MS/MS分析地表水样品1中超短链PFAS图5 SFC-MS/MS分析地表水样品2中超短链PFAS表1 SFC-MS/MS分析水样中超短链PFAS线性和检出限总结采用超临界流体色谱串联三重四极杆质谱仪（SFC-MS/MS）建立超短链（C1&minus C3）全氟烷基化合物的快速分析方法。由于超临界流体色谱独特的分离选择性，使用SFC-MS/MS分析种类繁多的PFAS，可以得到与反相色谱截然不同的溶出顺序和出峰行为。SFC-MS/MS可作为反相液相色谱质谱联用技术一种有力补充，对超短链PFAS进行更准确定量。随着对PFAS及其降解产物（TFA等）认识的不断深入，全球各国需要加强对这些持久性化学品的监管和限制, 旨在减少PFAS污染，保护生态系统和人类健康。超临界流体色谱串联三重四极杆质谱仪（SFC-MS/MS）注解*：超临界流体色谱（SFC）：使用超临界流体作为流动相的色谱分离技术。以超临界流体CO2为流动相的SFC分离技术不仅高效而且节能环保，作为一种绿色分离技术在制药、食品和石油领域得到越来越广泛的应用。参考文献1. Guomao Zheng, Stephanie M. Eic, Amina Salamova. Elevated Levels of Ultrashort- and Short-Chain Perfluoroalkyl Acids in US Homes and People. Environ. Sci. Technol. 2023, 57, 42, 15782–15793.2. Isabelle J. N., Daniel H., Hanna L. W., Vassil V., Ulrich B., Karsten N., Marco S., Sarah E. H, Hans P. H. A., and Daniel Z., Ultra-Short-Chain PFASs in the Sources of German Drinking Water: Prevalent, Overlooked, Difficult to Remove, and Unregulated. Environ. Sci. Technol. 2022 56, 10, 6380-6390.3. 欧洲水体中的PFAS污染引发关注：塞纳河等河流中令人惊讶的三氟乙酸浓度.【微信公众号：新污染物监测与分析】4. Cahill, T. M. Increases in Trifluoroacetate Concentrations in Surface Waters over Two Decades. Environmental Science & Technology, 2022, 56,9428-9434.5. Thomas M. Cahill. Assessment of Potential Accumulation of Trifluoroacetate in Terminal Lakes. Environ. Sci. Technol. 2024, 58, 6, 2966–2972.本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

2012年5月21日，岛津公司发布了最新加强版Accurate Glycan Analyzer 2 (缩写AGA2)：将生物相关多糖数据库与AXIMA Resonance独特的MSn特点相结合。 多糖在生物过程中扮演着重要角色 ，并参与蛋白相互作用及细胞表面识别机制，尽管在这些研究领域多糖较少受到关注。这在某种程度上归因于多糖复杂的分支结构，这使多糖复杂分支结构的研究和结构解析成为高度专业的学科。直到今天，AGA2的发布！ AXIMA Resonance 集MALDI的易用性、多级MSn、TOF的准确度与高分辨率于一身， 为挑战下一代复杂结构及序列解析提供了一套独特的全面解决方案。AXIMA Resonance从MS到多级MSn，每级MS保证高质量分辨率、高质量精确度以及高灵敏度。高性能多级MSn 分析使得Resonance成为糖链结构研究的理想工具。 The AXIMA Resonance结合AGA2数据库，该数据库涵盖多级MSn 谱图实测值，母离子峰值选择可达MS4。最终结果谱图被诠释用以还原出最有可能的多糖结构。 该产品是岛津、日本产业技术综合研究所(AIST)以及三井情報株式會社(MKI)的多方合作成果, 并由日本新能源· 产业技术综合开发机构(NEDO)资助。AGA2根据生物合成多糖创建，仅包含明确的、已表征的生物相关多糖1,2。 新数据库除增加了新物种外，AGA2系统现在能够使用常用的荧光标记方案，包括2-氨基吡啶(2-AP / PA), 2-氨基苯酸(2-AA)和 2-氨基苯甲酰胺(2-AB)，并且允许任何种类的荧光标记。 您可以从www.shimadzu.com/an, 或当地岛津办公地点获取AGA2系统的产品手册。关于岛津 成立于1875年，岛津公司作为高科技开发领导者，拥有建立在以科学技术为社会作贡献基础之上卓越创新的历史。岛津维持着全球销售网络、服务、技术支持以及分布在六个大陆的应用中心，并与遍布超过100个国家、经过严格培训的经销商建立了长期合作伙伴关系。 MALDI业务部门是具备60年质谱仪设计与制造背景的Kratos Analytical Ltd一部分，总部在英国曼彻斯特。更多信息请查询www.shimadzu.com/an.致谢AGA2数据库属于日本产业技术综合研究所(AIST)，授权给MKI。搜索软件是三井情報株式會社(MKI)的产品。AGA2使用的科研成果由日本新能源· 产业技术综合开发机构(NEDO)支持。AXIMA和AXIMA Resonance是岛津公司产品商标。参考1 Kameyama A, Kikuchi N, Nakaya S, Ito H, Sato T, Shikanai T, Takahashi Y, Takahashi K, Narimatsu H. Anal Chem. 2005 Aug 1 77(15):4719-25.2 Kameyama A, Nakaya S, Ito H, Kikuchi N, Angata T, Nakamura M, Ishida HK, Narimatsu H. J Proteome Res. 2006 Apr 5(4):808-14. ContactsShimadzu MALDI Business Media RelationsDr Andrew N. Eaton+44 161 444 77+44 7769 250454media@shimadzu.co.ukHigh resolution images available on request关于岛津 岛津企业管理（中国）有限公司是（株）岛津制作所为扩大中国事业的规模，于1999年100%出资，在中国设立的现地法人公司。 目前，岛津企业管理（中国）有限公司在中国全境拥有13个分公司，事业规模正在不断扩大。其下设有北京、上海、广州分析中心；覆盖全国30个省的销售代理商网络；60多个技术服务站，构筑起为广大用户提供良好服务的完整体系。 岛津作为全球化的生产基地，已构筑起了不仅面向中国客户，同时也面向全世界的产品生产、供应体系，并力图构建起一个符合中国市场要求的产品生产体制。 以&ldquo 为了人类和地球的健康&rdquo 为目标，岛津人将始终致力于为用户提供更加先进的产品和更加满意的服务。 更多信息请关注岛津公司网站www.shimadzu.com.cn。

2021年7月22日上午，月旭科技与华东理工大学的色谱分离纯化技术平台联合实验室的揭牌仪式，在启迪漕河泾（中山）科技园紫荆园十号楼隆重举行。出席此次揭牌仪式的领导有华东理工大学教授张维冰、上海市科委基地处副处长张露璐、上海分析仪器产业技术创新战略联盟理事长马兰凤。月旭科技常务副总任兴发、生产副总李崟、市场副总杨慧、新市场营销副总顾皓、研发总监薛昆鹏、应用中心总监陈再洁等。还有恒瑞医药、睿智化学、济川药业、济民可信等客户代表也拨冗前来出席此揭牌仪式。揭牌仪式于上午10时准时开始，首先由月旭科技常务副总任兴发就此次联合实验室的成立的重要意义进行致辞。任兴发先生表示：最近，月旭科技与华东理工大学张维冰教授团队在前期全面合作的基础上，联合申请上海市科委“仪器创新行动项目"，并成功得到资助。“色谱分离纯化技术平台"联合实验室作为项目的重要实施与工程化载体，必将进一步加强产学研联合攻关的优势，使月旭科技在色谱分离纯化技术方向的发展上一个新台阶。任兴发先生致辞结束后，与华东理工大学张维冰教授共同揭牌，月旭科技与华东理工大学的色谱分离纯化技术平台联合实验室正式成立。随后，任兴发先生向华东理工大学张维冰教授颁发“月旭科技分离纯化S席技术顾问"聘书。揭牌仪式结束后，张露璐处长及张维冰教授一行对月旭科技上海公司的分离纯化实验室、应用研发中心进行了参观，领导们对公司的硬件设施水平和员工的精神风貌表示了赞赏，也对公司严谨的管理体系表示了高度认可。参观完公司实验室后，嘉宾一行及公司高层领导，汇聚待客室。并以座谈会的形式对公司发展近况企业文化等、以及分离纯化联合实验室做了详细介绍。在座谈会上。各位领导并对以后与高校的全面合作、产业导入、人才在培训、平台建设等多方面的发展方向进行了深入交流。月旭科技与华东理工大学的色谱分离纯化技术平台联合实验室的落成，是月旭科技校企联合的又一重要阶段，同时也是月旭科技在色谱分离纯化整体解决方案业务发展的有力保障。在今后，月旭科技将就色谱分离纯化技术与华东理工大学展开深入合作，充分发挥联合实验室的作用及优势。为学校提供高质量的实践基地，为企业带来更高价值的共享成果，同时也为色谱分离纯化技术的发展贡献一份合力。

全柱成像毛细管等电聚焦（imaged capillary isoelectric focusing, iCIEF）是一种基于蛋白质等电点（isoelectric point, pI）将其分离的技术，在生物制药行业中被广泛应用于电荷变异体的分析。与传统的毛细管等电聚焦（CIEF）技术相比，iCIEF具有方法开发更快（每个样品仅需10~15min），灵敏度更高，pI值相近的电荷变异体分离更好（分离精度0.01pI），仪器平台稳定性好以及高分析通量等优点。图1 iCIEF分离及UV检测原理虽然iCIEF平台可以将常见的生物治疗产品，如单抗、融合蛋白等按照其等电点进行分离，但受其检测手段的局限性，无法得到更为全面深入的蛋白表征信息。2021年6月，赛默飞世尔科技宣布了与Advanced Electrophoresis Solutions Ltd（AES）的合作， 通过将AES的CEInfinite iCIEF平台与赛默飞的高分辨质谱平台联用，对iCIEF分离的电荷变异体进行表征，从而实现对生物治疗产品更加深入的理解。图2 CEInfinite iCIEF平台今年9月，来自丹麦Symphogen 的首席科学家Dan Bach Kristensen在CE Pharm 2021会议上以视频形式介绍了iCIEF-MS联用的最xin成果。Dan在报告中提到，使用质谱对单克隆抗体进行分子量分析，样品前处理步骤简单，且Orbitrap高分辨质谱平台的高分辨率和高灵敏度等优点可以提供足够多的信息，帮助科研人员从完整分子量层面对产品进行监控。通过将不同原理的液相分离技术，如SEC/CIEX/Protein A/RPLC分别与质谱串联，可以将单克隆抗体的不同类型变异体进行分离，随后得到各个变异体的分子量信息。Dan在他的演讲中举了一个使用iCIEF-MS联用对参比品（-80℃保存）和实验品（48个月，5℃保存）进行对比的示例。通过观察iCIEF-UV图谱，发现相较于参比品，实验品的酸/碱峰均有一定比例的上升。进一步通过质谱数据确认导致酸/碱峰比例增加的具体修饰类型，发现对于碱峰，Orbitrap高分辨质谱的高分辨率和高灵敏度等优点可以最da限度的减少相邻质谱峰的重叠，从而提供更加可信的鉴定结果。最终，通过质谱测定的完整分子量结果，可以得出的结论是实验品中与稳定性相关的产品属性含量上升，而与质量相关的产品属性变化不大

p　span style="FONT-FAMILY: times new roman"　strong仪器信息网讯/strong 2016长春国际质谱研讨会于2016年7月30日-31日在吉林大学召开(a title="" href="http://www.instrument.com.cn/news/20160730/197869.shtml" target="_self"strong相关新闻：2016长春国际质谱研讨会开幕 专家共贺吉林大学70周年庆/strong/a)。探讨气体相离子化学、离子化和离子碎裂机理等质谱基础理论是此次研讨会的核心主题。来自美国、加拿大、 韩国、香港及国内高校、研究所的著名质谱理论和应用专家围绕17个分享报告展开了深入研讨。吉林大学化学学院的硕、博研究生们也参与到了本次活动的学习和交流中。/span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"img title="IMG_0220_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201608/insimg/e334e3ed-60ae-4ba0-8f8c-654b48cc8388.jpg"//span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman COLOR: rgb(0,32,96)"strong研讨会现场/strong/span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman COLOR: rgb(0,32,96)"strongimg title="IMG_9990_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201608/insimg/bffed2c5-4e13-4b27-b7e9-a46655acc265.jpg"//strong/span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="COLOR: rgb(0,32,96)"strongspan style="FONT-FAMILY: times new roman COLOR: rgb(0,32,96)"美国加利福尼亚大学Joseph A. Loo 报告题目《Native Mass Spectrometry and Top-Down MS for the Characterization of Protein Interaction》/span/strong/span/ppspan style="FONT-FAMILY: times new roman"　　采用ESI在非变形溶液条件下用质谱分析生物分子被称为“native”MS。Joseph认为自上而下质谱是分析蛋白序列的好方法。“我们用FT-ICR MS分析配体结合位点，得到大量数据信息用以分析大蛋白复杂化合物。我们团队通过ECD/FT-ICR MS研究在神经组织退化疾病如阿耳茨海默症、帕金森症中化合物分子的反应机理。除此之外，红外多光子解离(IRMPD)、紫外光解离(UVPD)、电子离子化解离(EID)等方法能够从不同侧面提供更全面的结构信息。” Native 自上而下MS分析得到了蛋白质的很多复杂信息，虽然膜蛋白的确给Native MS分析带来了不小的挑战，但FT-ICR MS的多种灵活使用方法使得膜蛋白精确分析问题得到了解决。/span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"img title="IMG_0013_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201608/insimg/2ca1f12f-0dd5-4193-8d8a-d872077a85f7.jpg"//span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman COLOR: rgb(0,32,96)"strong美国北伊利诺伊大学Victor Ryzhov 报告题目《Metal ion complexes of amino acid and peptide radicals: Structure and reactivity》/strong/span/ppspan style="FONT-FAMILY: times new roman"　　蛋白质中的半胱氨酸能够从Cα获得氢原子的自由基的能力。由于移动质子的释放，使用金属离子作为电荷来源具有一定优势。Victor团队的研究，包含表征氨基酸和肽段中的金属离子对半胱氨酸自由基的阳离子化过程。复合物的反应过程通过离子分子反应(IMR)经四极杆串联离子阱质谱等仪器设备来监测。通过IMR和IRMPD分析，该团队的研究者发现了Cys自由基与Li+、NA+、K+的复合物。这些物质仍保留了硫基自由基,(N,O,S)可与金属离子配位。/span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"img title="IMG_0042_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201608/insimg/7e41db80-fdce-4fc4-838f-610da3bae1c8.jpg"//span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"　span style="FONT-FAMILY: times new roman COLOR: rgb(0,32,96)"strong香港大学Ivan K. Chu 报告题目《Radical-Mediated Peptide Tyrosine Nitration: Fundamental, Bioanalytical and Neurodegenerative Proteomics》/strong/span/span/ppspan style="FONT-FAMILY: times new roman"　　经Ivan介绍， PTN是一种在活体硝化应激条件下蛋白质自由基介导翻译后修饰。团队对导致邻位酪氨酸硝化位点特异性的详细机理进行了研究探索。该团队通过一套包括离子化学、以MDLC-MS为基础的蛋白组学研究、MRI成像、免疫组学研究等在内的综合方法研究了自由介导酪氨酸硝化理论。/span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"img title="IMG_0096_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201608/insimg/41bd6ac4-f383-4b95-9d46-a77134855e8b.jpg"//span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"　span style="FONT-FAMILY: times new roman COLOR: rgb(0,32,96)"strong北京大学刘虎威教授 报告题目《Lithium-rich composite metal oxide used as SALDI-MS matrix for the determination of small biomolecules/strong/span》/span/ppspan style="FONT-FAMILY: times new roman"　　刘虎威研究团队成功合成了分析生物小分子的富锂金属氧化物SALDI基质，并成功采用SALDI-MS分析了Lisub1./subsub2/sub、Mn sub0.54/sub、Nisub0.18/sub、Cosub0.13/sub、Osub2/sub五种生物小分子。SALDI基质需要同时满足离子化辅助试剂和能量传导体的身份。该团队还通过SALDI和新基质研究了药物、低聚糖、脂类和肽等小分子生物物质，均得到了满意的信号。此方法快速简单，仅需将待测物与分析溶液混合，滴在MALDI靶板上测定即可。/span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"img title="IMG_0103_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201608/insimg/acf5c7dc-e183-4035-b20c-e336079261b5.jpg"//span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"strongspan style="FONT-FAMILY: times new roman COLOR: rgb(0,32,96)"东华理工大学Konstantin Chingin 报告题目《On the Preservation of Noncovalent Protein Complexes During Electrospray Ionization》/span/strong/span/ppspan style="FONT-FAMILY: times new roman"　　ESI-MS在蛋白质配合物的定量分析仍存在一定争议，使用ESI-MS和使用其他方法得到结果不同。同样蛋白配合物在实验室间得到的结果也常常不一致。Konstantin通过分析几种液滴离子化技术讨论了非共价键蛋白配合物的离子化过程。/span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"img title="IMG_0114_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201608/insimg/4199ed3a-3fb0-44aa-8e6a-08a53f89c7fe.jpg"//span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"strongspan style="FONT-FAMILY: times new roman COLOR: rgb(0,32,96)"南开大学孔祥蕾教授 报告题目《IRPD Spectroscopy of Metal Cationized Ions Generated by MALDI Source》/span/strong/span/ppspan style="FONT-FAMILY: times new roman"　　孔祥蕾教授介绍了一种MALDI与IRPD技术结合得到阳离子化金属离子IRPD信息的新方法。石墨烯是此方法中的MALDI基质。该方法与H/D交换结合，通过观察IR峰识别发色基团。研究发现，相比ESI方法产生的[Arg+Rb]+，该方法中产生的[Arg+Rb]+含更高的内能。/span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"img title="IMG_0118_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201608/insimg/88b28ef6-1a10-49d8-b90a-0a55cee71432.jpg"//span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"strongspan style="FONT-FAMILY: times new roman COLOR: rgb(0,32,96)"韩国延世大学Myeong Hee Moon 报告题目《Field-flow fraction with MS for Proteomic Analysis: Glycoproteins, Subcellular Organelles,& Exosomes》/span/strong/span/ppspan style="FONT-FAMILY: times new roman"　　FFF是一种可以分离以大小分类的物质的方法，包括蛋白质、DNA、细胞等在内的巨型生物分子的分离。FIFFF是FFF的一种变化形式。Myeong介绍了以颗粒大小分离糖蛋白的FIFFF法的应用，反应利用中空纤维酶反应器与nLC-ESI-MS/MS实现在线消化和定量。报告中还探讨了将该方法用于前列腺癌尿样的胞外体、细胞外分泌物分析。/span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"img title="IMG_0126_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201608/insimg/caa327cf-5945-4890-94aa-e9b79bf19b38.jpg"//span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman COLOR: rgb(0,32,96)"strong南京大学刘震教授 报告题目《Molecularly Imprinted Materials-based Extraction: Ideal Partner of Mass Spectrometry for Efficient Identification of Targeted Proteins in Complex Biological Samples》/strong/span/ppspan style="FONT-FAMILY: times new roman"　　用质谱做蛋白质定量时，表面蛋白种类多，从而会大大影响目标蛋白的离子化效率，故采用质谱分析蛋白质时样品前处理过程非常重要。分子印迹方法在亲和分离、疾病诊断、化学传感等应用中非常受欢迎。刘震教授介绍了团队在含糖化合物印迹方面研究的几种新方法。这些方法能够通过分子印迹鉴别一类而非一种特定蛋白质。分子印迹材料可在特定蛋白样品处理时有效地吸附。/span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"img title="IMG_0133_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201608/insimg/b0101ddd-b807-483f-b4cb-d7a3d9e9625a.jpg"//span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="COLOR: rgb(0,32,96)"strongspan style="FONT-FAMILY: times new roman"北京大学副教授白玉 报告题目《Metabolomic Analysis of Mouse Embryonic Fibroblast Cell in Response to Acute Starvation with and without Atg7》/span/strong/span/ppspan style="FONT-FAMILY: times new roman"　　Atg7(自噬相关蛋白质)在自噬过程中起着重要作用。Atg7在反应中的信号通路已经有研究阐明，而Atg7对细胞饥饿条件下代谢组学反应的影响尚不清楚。白玉副教授介绍了通过分析MEFs(鼠胚胎纤维源细胞)探索依靠Atg7的自噬代谢机理，并发现了30多种与细胞饥饿相关的代谢产物。该研究还表明，自噬的缺乏会引起TCA循环的钝化，这导致细胞会在突然饥饿情况下迅速衰亡。/span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"img title="IMG_0140_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201608/insimg/555c3154-06a7-409c-bb46-9948f25c19cd.jpg"//span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="COLOR: rgb(0,32,96)"strongspan style="FONT-FAMILY: times new roman COLOR: rgb(0,32,96)"中国科学院大连化学物理研究所许国旺教授 报告题目《LC-MS based Metabolomics Method for Large Scale Sample Analysis and Metabolite Identification》/span/strong/span/ppspan style="FONT-FAMILY: times new roman"　　UPLC-MS是当今最为普遍的代谢组学分析途径，但其常规分析的效率和重现性并不能满足分析需求。筛查中仅有1.8%的物质质谱信息能得到准确鉴定。面对这情况，许国旺团队开发了面对大规模代谢组学样品时，通过UPLC-MS的代谢组学综合分析方法，这其中包括前处理中去除蛋白质的方法。快速UPLC-MS分析方法每天能分析96个样品并得到大量的组学数据。分析得到的代谢组学数据库包括2000种常见代谢物的保留时间、MS和MS/MS信息，可用于代谢产物鉴定分析。/span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"img title="IMG_0151_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201608/insimg/afe72a17-191b-45b8-8b5d-a5fea2a7bbc5.jpg"//span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"strongspan style="FONT-FAMILY: times new roman COLOR: rgb(0,32,96)"中国科学院大连化学物理研究所张丽华教授 报告题目《Improved Accuracy, Coverage and Throughput for Proteome Quantification》/span/strong/span/ppspan style="FONT-FAMILY: times new roman"　　张丽华教授在报告中介绍了几种蛋白质组学研究中的定量新方法。免标记法蛋白组学定量中该团队在样品处理中采用辅助离子液过滤，并用C12Im-Cl代替SDS提取蛋白质，随后做变性、过滤烷化、消化和脱盐过程。由于 C12Im-Cl的提取效果、增溶效果和消化效果都优于SDS得到的蛋白质量和定量精确度都得到了明显提高，而前处理也更加省时。另外，在化学标记蛋白组学定量中，团队还分析了pLDL方法以及其在区分Csub12/sub/Csub13/sub、sub1/subH/sub2/subH的微小区别时的定量情况。/span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"img title="IMG_0216_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201608/insimg/9d6b867a-a69b-4590-8162-912cb9c4eb2f.jpg"//span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"strongspan style="FONT-FAMILY: times new roman COLOR: rgb(0,32,96)"加拿大温莎大学K.W.Michael Siu 报告题目《Loss of Water from protonated Polyglycines》/span/strong/span/ppspan style="FONT-FAMILY: times new roman"　　Siu团队从多甘氨酸探索多肽质子化失水机理。试验将O18标记聚甘氨酸的特殊肽键替换为王(Wang)树脂。研究发现80%质子化的四甘氨酸从第一肽键失水。肽链增长会增加从第二肽键失水的可能。研究发现，从第二肽键失水的多肽失水产物是质子化唑，或将重排成唑结构。/span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"img title="IMG_0224_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201608/insimg/080b4693-205a-456c-9883-3175cd713000.jpg"//span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"span style="FONT-FAMILY: times new roman COLOR: rgb(0,32,96)"strong美国华盛顿大学Frantisek Turecek 报告题目《Gas-Phase Footprinting of Peptide Ions in Non-Covalent》/strong/span/span/ppspan style="FONT-FAMILY: times new roman"　　软电离使多原子离子能够从压缩相过渡到气态相，很多研究开始了通过MS、NMR等技术探索复合离子的3D结构。Franti?ek团队采用气体相印迹法分析由ESI得到的非共价肽-肽离子复合物。对光不稳定的Diazirine ring在355nm分解形成高活性碳烯中间物 ，作用于非共价复合物中的肽配合物形成共价键。/span/pp style="TEXT-ALIGN: center"img title="IMG_0231_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201608/insimg/0c9d2485-e6c2-4c59-a05c-8b042d87c26d.jpg"//pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"strongspan style="FONT-FAMILY: times new roman COLOR: rgb(0,32,96)"中国科学院武汉植物园郭明全研究员 报告题目《Biomarker Discovery: from proteins to Endogenous Lipids》/span/strong/span/pp　　span style="FONT-FAMILY: times new roman"郭明全团队通过2-D 凝胶电泳和LC-MS/MS等技术研究了HMSCs在电离辐射(IR)下的蛋白组/磷脂蛋白组变化。研究显示，IR对磷脂蛋白组带来了显著变化，研究还发现了一些潜在的蛋白标记物。另外，该团队还发展了基于MDME 结合UPLC-MS的新方法用于分析研究血浆中的内源性大麻素(eCBs)。/span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"/spanimg title="IMG_0246_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201608/insimg/1aa78873-e868-486c-9628-4234fc6fbe18.jpg"//pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"strongspan style="FONT-FAMILY: times new roman COLOR: rgb(0,32,96)"美国加利福尼亚大学Rachel R. Ogorzalek Loo 报告题目《Are High Charge States Destabilized by Like-Charge Repulsion or are Low Charge States Stabilized by Opposite-Charge Attraction (Salt Bridges)?》/span/strong/span/ppspan style="FONT-FAMILY: times new roman"　　碰撞活化非共价多聚体常会产生不对称解离，逐出单个亚单元，也因此承受电荷过剩。库伦排斥令亚单元带走更多的电荷。Rachel在报告中探讨了盐桥反应的衍生物以及用盐桥理论解释活化作用、解离作用和碰撞截面测量。/span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"img title="IMG_0255_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201608/insimg/1d7b0ca8-d235-4603-9157-bc0a0f2a89a3.jpg"//span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"　　/spanspan style="FONT-FAMILY: times new roman COLOR: rgb(0,32,96)"span style="LINE-HEIGHT: 0px DISPLAY: none" id="_baidu_bookmark_end_13"?/spanstrong吉林/strongspan style="FONT-FAMILY: times new roman"strong大/strong/span/spanspan style="FONT-FAMILY: times new roman COLOR: rgb(0,32,96)"strong学国新华教授 报告题目《Characteristic Peptide Fragment Ions Formed by Charge-Remote Fragmentation Pathways upon Low-energy CID》/strong/span/ppspan style="FONT-FAMILY: times new roman"　　国新华教授在报告中介绍了采用MS/MS分析bsubn/sub-44、cn、bsub2/sub+H2O等一系列特征离子。该团队对特征离子的形成机理做了深入研究，包括N端固定电荷、电荷态、氨基酸组成、碱金属离子等对反应的影响。该研究尝试了对含Thr/Ser肽中bsubn/sub+H2O的构想重组。N→O的酰基转化得到了脂质中间物，酯的产物进一步裂解促使bsubn/sub+H2O离子的形成。/span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"img title="IMG_0171_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201608/insimg/418217b8-3384-4595-8fe3-f4fd6cae9037.jpg"//span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"span style="FONT-FAMILY: times new roman COLOR: rgb(0,32,96)"strong赛默飞世尔科技工程师吴泽明 报告题目《Novel informatics tools for small molecule research with orbitrap Technology》/strong/span/span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"span style="FONT-FAMILY: times new roman COLOR: rgb(0,32,96)"strongimg title="IMG_0258_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201608/insimg/39938951-24b0-41f5-bd0c-ce9d18b0fa83.jpg"//strong/span/span/pp style="TEXT-ALIGN: center"span style="FONT-FAMILY: times new roman"span style="FONT-FAMILY: times new roman COLOR: rgb(0,32,96)"strong长春中医药大学刘淑莹教授总结致辞/strong/span/span/ppspan style="FONT-FAMILY: times new roman"　　经过两天的活跃讨论，此次研讨会的报告研讨阶段结束。刘淑莹教授在总结致辞中，介绍了目前中国中医药大学对人参生物活性物质的探索，也邀请到场嘉宾共同加入到人参成分质谱分析中来。刘淑莹教授代表本届研讨会组织委员会表示，此系列的研讨会将继续下去，也许在两年之后将举办下次活动。目前国内外使用质谱的人越来越多，而质谱操作者中大多数对质谱理论和研究机理并不了解。刘淑莹教授表示应鼓励质谱基础知识的传播，质谱机理的交流学习对提高质谱操作者的理论能力非常有帮助。至此，2016长春国际质谱研讨会圆满落幕。/span/pp style="TEXT-ALIGN: right"span style="FONT-FAMILY: times new roman"编辑：郭浩楠/spanbr//p

近年来,蛋白质组学技术在肽和蛋白质类新型治疗药物的蓬勃发展以及临床新型大分子生物标志物的深入发掘中被日益广泛应用。应用方式的迭代对生物大分子的分析技术提出了更高的要求。基于蛋白质特征肽段检测的自下而上的蛋白质组学技术(bottom up proteomics)是现有研究中具有较高灵敏度与分辨率的蛋白质定性定量方法。开发多肽的生物分析方法是极具挑战的,除了所需的低检出限外,多肽的非特异性吸附性质,使其极易在接触到的材料表面发生吸附,进而导致分析全流程中待测物的丢失或干扰,给定性和定量分析引入巨大风险。例如在蛋白组学研究的质谱数据库搜索中,即使系统中微量肽段的损失或残留亦可能导致假阳性或假阴性结果。而在高灵敏度的多肽定量方法的开发中,肽段的非特异吸附对定量分析的线性、准确度和精密度均有负面影响。低浓度肽段溶液的吸附性质会更加明显,表现形式为标准曲线的非线性,最终导致定量限的不必要升高以及方法的重复性差。已有一些研究在分子水平上解释这种吸附行为,然而目前对其潜在的机制和相互作用仍然知之甚少。Eeltink等基于分子动力学模拟,提出了一种三相分子机制解释肽段从溶液吸附到强相互作用不带电固定相上的原理。Kristensen等研究了样品容器对阳离子多肽吸附的影响,当1 μmoL/L肽溶液在硼硅酸盐或聚丙烯瓶中存储1 h后,肽段的回收率仅有10%~20%。也有研究通过在溶剂中添加有机试剂、酸/碱性溶液、表面活性剂、吸附竞争剂或调整流动相组成等方法减少这类吸附。这些研究论文大多对一组特定的多肽和/或表面材料进行研究,但均未给出可用来预测多肽吸附特性的规律,也未给出通用的解决吸附的方法。本研究选择牛血清白蛋白(BSA)作为模型蛋白质,以其酶解后的肽段作为包含亲水性和疏水性多肽的“典型”多肽组样本。首先通过超高效液相色谱-高分辨质谱(UPLC-HRMS)的测定,分析常见多肽理化参数与上述多肽组的非特异吸附程度的关联性。然后基于超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC-QQQ-MS/MS)建立对强吸附肽段吸附程度的评估方法,从样品制备至分析测定建立全过程试验设计,考察不同材质的制备、储存耗材对肽段吸附的影响,以及考察不同色谱条件对肽段残留的影响,最终提出多肽全流程分析中减少非特异性吸附的通用型策略。01样品制备方法取10 mg BSA溶于10 mL水中,制得1 mg/mL蛋白储备液,进一步以水稀释为100 μg/mL的工作液。取200 μL上述工作液于蛋白质低吸附离心管中 加入65 μL 500 mmol/L碳酸氢铵和60 μL 50 mmol/L二硫苏糖醇,于60 ℃水浴加热60 min对蛋白质进行还原 放冷至室温后加入120 μL 50 mmol/L碘代乙酰胺,于暗处反应30 min进行烷基化 加入100 μg/mL的胰蛋白酶5 μL,于37 ℃水浴中酶解8 h,加入甲酸20 μL终止反应,12000 g离心15 min后,取200 μL上清置于蛋白质低吸附的进样瓶中作为混合肽段溶液待测。02超高效液相色谱-高分辨质谱方法参数色谱条件:色谱柱采用Waters Acquity Premier Peptide CSH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm) 柱温为40 ℃ 流速为0.25 mL/min 流动相A、B两相分别为0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液。洗脱梯度为0~1 min, 1%B 1~13 min, 1%B~40%B 13~13.1 min, 40%B~90%B 13.1~16 min, 90%B 16~16.1 min, 90%B~1%B 16.1~20 min, 1%B。进样器温度10 ℃ 进样量5 μL。质谱条件:毛细管电压3 kV,锥孔电压30 V,离子源温度120 ℃,脱溶剂气温度450 ℃,锥孔气流速25 L/h,脱溶剂气流速800 L/h。电喷雾电离(ESI)源、正离子模式下测定,MSE模式采集,扫描范围m/z 50~2000 数据采集时使用亮氨酸脑啡肽校正液进行实时质量校正,以保证采集质量数的准确性与重复性。采集后的数据使用Unifi软件处理。03相对残留量的测定和肽段分级策略将上述混合肽段溶液经上述条件采集、Unifi软件分析后,可得BSA酶解后肽段组的实际肽段组成和每个肽段的响应值Area(供试品溶液)。在进样上述供试品溶液后连续进样3针空白溶剂,以3针空白溶剂中检测到的对应肽段响应之和Area(Blank 1+Blank 2+Blank 3)计为该肽段的残留总量,该肽段的相对残留量为肽段的残留总量与肽段响应值的比值。基于肽段的响应与相对残留量,可将BSA酶解后的肽段组分为如下四类:Class Ⅰ,响应高且无残留的肽段 Class Ⅱ,响应高但有残留的肽段 Class Ⅲ、Class Ⅳ分别为响应低,无吸附和有吸附的肽段。响应的高低以是否大于中位数计,有无残留以Area(Blank 1+Blank 2+Blank 3)是否有检出判断。04超高效液相色谱-三重四极杆质谱方法参数色谱条件:色谱柱采用Waters ACQUITY UPLC BEH C8(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm) 柱温30 ℃ 流速0.4 mL/min 流动相A、B两相分别为0.2%甲酸水溶液和0.2%甲酸乙腈溶液。洗脱梯度为0~2 min, 2%B 2~5 min, 2%B~60%B 5~5.1 min, 60%B~90%B 5.1~8 min, 90%B 8~8.1 min, 90%B~2%B 8.1~11 min, 2%B。进样器温度10 ℃ 进样量5 μL。洗针液为90%乙腈水溶液(含0.2%甲酸)。质谱条件:离子化电压5500 V 气帘气压力0.14 MPa 离子源温度500 ℃ 喷雾气、辅助加热气压力0.38 MPa。ESI源正离子模式下测定,多反应监测(MRM)模式采集,12条Class Ⅱ类肽段的离子对、碰撞能量(CE)、去簇电压(DP)值经Skyline软件协助优化后结果如原文表1所示。文章信息色谱, 2022, 40(7): 616-624 DOI: 10.3724/SP.J.1123.2021.12012张莹1,2, 杨静1,2, 马跃新1,2, 曹玲2*, 黄青2*1.南京中医药大学药学院, 江苏 南京 2100232.江苏省食品药品监督检验研究院, 国家药品监督管理局化学药杂质谱研究重点实验室, 江苏 南京 210019

抗体是免疫系统中一类重要的蛋白质，它们通过特异性方式来结合抗原。这一特性使之在诊断、治疗、基础研究等方面具有巨大的价值。抗体由四条多肽链构成，两条重链和两条轻链，通过二硫键连接而成。它们通常被糖基化，其中羧基端区域高度保守，而氨基端区域在氨基酸序列上可变，从而产生抗体的特异性和多样性。 在一系列的酶切和化学处理下，抗体分子被裂解为各种片段，通过HPLC分离，结合电泳和质谱等手段，抗体的结构可被了解和鉴定。近日，赛分科技的科学家通过体积排阻色谱、离子交换色谱和反相色谱等多种技术实现抗体异构体、各种抗体碎片的高效分离，可对抗体结构进行可靠的鉴定和验证。此外，为抗体药物的质量控制也提供了有效的监控手段。一、结构研究体积排阻色谱法（Zenix&trade SEC） 抗体片段重链和轻链的分离抗体片段Fc和Fab的分离离子交换色谱法（Antibodix&trade WCX） 抗体片段Fc和Fab的离子交换色谱法分离反相色谱法（Bio-C8） Column: Bio-C8 4.6 x 100 (3 &mu m, 300 Å , 4.6 x 100 mm) Mobile Phase A: 0.11% TFA in water Mobile Phase B: 0.09% TFA in ACN Flow: 0.5 mL/min Temperature: 75 oC Detection: UV 280 nm抗体片段重链和轻链的反相色谱法分离二、抗体异构体分析 Column: Antibodix&trade WCX NP5 4.6 x 250 mm Mobile phases: A: 20 mM sodium acetate, pH 5.15, B: A + 1 M LiCl Flow rate: 0.8 mL/min Detection: UV 280 nm.单克隆抗体的稳定性分析 更多信息请参考：http://www.sepax-tech.com.cn/training/Antibody Solution Kit.pdf关于赛分科技 赛分科技有限公司（Sepax Technologies, Inc）总部位于美国特拉华州高新技术开发区，致力于开发和生产药物与生物大分子分离和纯化领域的技术和产品。赛分科技是集研发、生产和全球销售为一体的实业型企业。公司主要产品为液相色谱柱及耗材、固相萃取柱（SPE）及耗材、液相色谱填料以及分离纯化仪器设备。在液相色谱领域里，赛分科技已开发出了100多种不同型号的液相色谱材料，涵盖了反相、正相、超临界（SFC）、手性（Chiral）、离子交换、体积排阻、亲和、HILIC等各种类别，为世界范围内液相色谱产品最为完善的企业之一。 赛分科技的创新技术使之生产出具有最高分辨率及最高效的生物分离产品，包括体积排阻、离子交换、抗体分离、和糖类化合物分离色谱填料和色谱柱，可广泛地应用于单克隆抗体、各种蛋白、DNA、RNA、多肽、多糖和疫苗等生物样品的分析、分离和纯化。赛分科技先进的技术和完善的产品线已使赛分成为全球生物分离的领航者。 公司网站：www.sepax-tech.com.cn www.sepax-tech.com

近日，Advion公司在佛罗里达ABRF 2016年会上发布了一款蛋白质和多肽分析系统，“TIDES EXPRESS”，该系统结合了Advion公司小型台式质谱Expression CMS （L型）。新的工作平台提升了化学家在多肽合成过程中的每一步反应及最终成品的质量分析工作流程。它是固相多肽合成监测反应的理想工具。此外，碎片分析和电荷去卷积工具也为其在蛋白表征方面增强了性能。 固相多肽合成（SPPS）可以快速、平行的合成各种长度的氨基酸肽链，甚至有些氨基酸肽链是超出30到40的长度。尽管固相合成（SPPS）具有高度的自动化，但是一些肽链的合成仍具有挑战性，而且在一个大规模蛋白合成过程中若出现任何小瑕疵，都将会花费巨大的成本来修补，若是用快速分析就能防止这些错误出现。质谱通过分析氨基酸主链上特殊得或者选择性的分子碎片就可以提供分子质量和氨基酸序列信息。“TIDES EXPRESS”包含简单易用的HPLC梯度系统和手动进样器，Expression CMS （L型），碎片分析和电荷去卷积软件工具。 “蛋白质和多肽分析的复杂性要求一个有效的，低成本的分析工具来快速做出监测”市场部副总裁Simon Prosser说到。“它的简单易用和小型紧凑使得“TIDES EXPRESS”成为固相合成（SPPS）监测的理想工具，而现在很多分析都只被限制在紫外或者是红外来进行监测分析。”

近日，暨南大学胡斌副研究员团队在Journal of Analysis and Testing 2021年第4期发表综述论文“Mass Spectrometry‑Based Human Breath Analysis: Towards COVID‑19 Diagnosis and Research”。该文总结了新冠肺炎呼气质谱分析方法的研究进展，并从有机代谢物、蛋白质、微生物和无机元素等多个维度讨论了质谱技术在新冠肺炎诊断与研究中的应用前景和挑战。面向新冠肺炎诊断与研究的人体呼气质谱分析新冠肺炎（COVID-19）是由新型冠状病毒（SARS-Cov-2）引发的传染病，已给全球带来了严重的生命财产与经济损失并且仍在继续发展。研究证实新冠肺炎可通过人体呼气及飞沫传播。人体呼气是一种生物气溶胶，含有大量挥发性物质、水汽以及融合在水汽小液滴中的不挥发性物质如有机代谢物、生物大分子和微生物等等。这些人体呼气成分与人体的生理病理及行为密切相关，并且可通过简单便捷和活体无创的方式采集。因此，人体呼气分析在疾病诊断、生命科学、临床医学、药物研究、环境健康和刑侦法医等涉及人体健康与分子医学领域具有重要的应用。特别地，受新冠肺炎这一与呼吸系统及呼气传播密切相关的疾病挑战，基于人体呼气分析新冠肺炎诊断与研究是新兴的前沿热点和难点。表1 新冠肺炎的诊断技术质谱是同时具备灵敏度高、特异性好、信号响应快的仪器分析方法，是研究新冠肺炎的基因组学、蛋白质组学、代谢组学和微生物组学的强大分析工具，并取得了重要进展。与其他新冠肺炎的诊断技术相比，基于质谱技术的人体呼气分析具有无创、活体、操作简单、分析性能好、适用性强等优点（表1）。质谱技术结合不同的采样方法、分离技术、或电离技术可在不同维度对人体呼气进行分析（图1），为新冠肺炎在快速诊断与分子生物学研究提供新的视角。图1 基于质谱技术新冠肺炎呼气的多维分析直接质谱技术直接质谱（DI-MS）技术包括原位电离质谱（AI-MS），是指无需样品前处理条件下直接分析样品的质谱技术，已成功地发展应用于人体呼气成分的实时在线监测，例如质子转移反应质谱（PTR-MS），选择离子流动管质谱（SIFT-MS），电喷雾萃取电离质谱（EESI-MS），以及二次电喷雾电离质谱（SESI-MS）等。这些直接质谱技术可以连续、无创、实时地直接引入人体呼气，实现呼气的在线质谱监测，为快速获取呼气信息提供新的技术手段。在直接质谱技术监测呼气的同时，结合质谱数据的统计方法和机器学习（图2），为筛查新冠肺炎的生物标志物提供了新手段。直接质谱技术是新冠肺炎快速诊断有力的诊断工具，将有望在呼吸疾病诊断和筛查取得新的突破。图2 新冠肺炎呼气质谱数据处理方法：a. PCA, b. OPLS-DA, c. 使用三种机器学习算法的完整模式, d. 只使用最重要特征的模型气相色谱质谱技术人体呼出气中的挥发性物质主要来源于内源性代谢物（由呼吸道和内脏系统及其微生物产生）和外源性物质（由食物、药物、环境及其代谢物产生），而新冠肺炎病毒可能产生特殊的挥发性代谢标志物。监测人体呼出代谢物产物可以深入理解新冠病毒引起的生理病理变化。气相色谱质谱（GC-MS）技术具有稳定性好、分离能力强、灵敏度高、特异性好等特点，并配备有强大的数据库，是一种呼出代谢物分析的有力手段。此外，耦合新型呼气采集技术，如口罩微萃取技术（图3），气相色谱质谱还有望实现超痕量代谢物的精准分析。特别地，随着便携式气相色谱质谱的发展，可以根据需求将便携式质谱转移到社区、学校、医院等场所进行现场诊断，进一步提高新冠肺炎的诊断能力。图3 新型质谱呼气分析新方法：a. SPME探针, b. 口罩微萃取呼气采样, c. SPME-DART-MS分析, d. 台式SPME-GC-MS分析, e. 便携式SPME-GC-MS分析液相色谱质谱技术人体呼气中还包括多种非挥发性有机物和生物基质，为呼吸系统疾病提供了生物化学信息。液相色谱质谱（LC-MS）通常用于分析呼出气溶胶中的有机代谢物和蛋白质。由于呼气中的有机代谢物和蛋白质含量低，通常需要对呼气进行预处理，例如呼气冷凝浓缩。研究表明，呼气冷凝物的收集是呼气蛋白质组学和代谢组学研究的关键因素之一。因此，呼气冷凝物结合LC-MS分析可能成为研究新冠肺炎呼气中蛋白质组学和代谢组学的有力工具，从而发现呼气中的生物标志物，为新冠肺炎的生物学研究提供新认识。基质辅助激光解吸电离质谱技术由于新冠肺炎可以通过呼出气溶胶和飞沫传播，从呼气样本中直接鉴别新冠肺炎病毒是迫切的需求。基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）具有灵敏度高、准确度高、和质量范围广的特点，可以分析包括细菌、真菌和病毒等微生物。鼻咽拭子样品、血浆或血清中的病毒特异性蛋白/核酸也可通过MALDI-MS分析。MALDI-MS在新冠肺炎临床诊断和冠状病毒研究中已经取得许多重要进展。在MALDI-MS分析过程中，通过将微生物的肽质量指纹图谱、蛋白质、核酸序列等信息与数据库进行匹配鉴定。MALDI-MS可以用于准确筛选已知的冠状病毒，为出现未知的人类冠状病毒提供病理和生理学依据。电感耦合等离子体电离质谱技术电感耦合等离子体电离质谱（ICP-MS）是一种强大的元素分析技术，可以检测人体组织、体液和呼气中的无机元素。研究发现，新冠肺炎患者体内会出现矿物质状态失衡，可能受到一种尚未发现的无机生物学机制的影响。目前新冠肺炎患者呼气中无机元素的变化机制尚不清楚，ICP-MS有望成为筛查新冠肺炎呼气样本中无机元素变化的有力工具，并且发现新型无机生物标志物。ICP-MS有望成为新冠肺炎呼气诊断与研究的新手段，并为更好地理解新冠肺炎的潜在无机生物学过程提供新的视角。小结自从新冠肺炎爆发以来，质谱技术在新冠肺炎的诊断应用与基础研究方面飞速地发展。本文从有机代谢物、蛋白质、微生物、无机元素等多个维度评述了人体呼气质谱分析在新冠肺炎诊断与研究的进展。在诊断方面，呼气质谱技术已经在临床检验方面取得了很大的进展，然而如何实现快速、准确、现场的诊断应用仍然有待进一步的改进和验证。在研究方面，呼气质谱分析为更好地理解新冠肺炎病毒在人体的生理学、生物化学和无机生物学的机制提供了新的视角，如何深入地揭示新冠病毒对人体健康的影响，在样品采集、质谱分析、数据处理方面仍需要深入系统的研究。新冠肺炎的呼气质谱分析在未来仍然充满机遇，包括但不限于分析化学、仪器研制、生物化学、临床医学和人工智能等领域不同学科的交叉融合，将有望更好地诊断和理解新冠肺炎。本文引文信息Yuan, ZC., Hu, B. Mass Spectrometry-Based Human Breath Analysis: Towards COVID-19 Diagnosis and Research. J. Anal. Test. 5, 287–297 (2021). https://doi.org/10.1007/s41664-021-00194-9作者简介胡斌，博士，暨南大学质谱仪器与大气环境研究所副研究员。长期从事质谱分析及相关交叉学科研究工作。研究方向包括：样品采集与制备新方法、离子化技术、生命健康与公共安全质谱分析研究等。相关工作以（共同）第一或通讯作者在Analytical Chemistry, Trends in Analytical Chemistry, Nature Protocols等期刊上发表SCI论文40多篇；论文总引用2500多次，个人H指数25。曾获中国青少年科技创新奖和中国分析测试协会科学技术奖（CAIA奖）一等奖等奖项。担任香港研究资助局、广东省科技厅、广东省基础与应用基础研究基金委员会等评审专家，以及Advanced Materials, Analytical Chemistry, Food Chemistry, Environmental Science & Technology等20余国际SCI期刊审稿专家。

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Analysis of AAV-Extracted DNA by Charge Detection Mass Spectrometry Reveals Genome Truncations1，文章的通讯作者是来自印第安纳大学化学系的Jarrold, Martin F.教授。　　腺相关病毒(AAV)是一种小的(26纳米)、无包膜二十面体病毒。由于其低免疫原性和高组织亲和性，AAV已成为一种很有前途的基因治疗载体。AAV衣壳包含三种病毒蛋白质，VP1、VP2和VP3。对于来自HEK细胞的重组AAV (rAAV)，VP1-3的比例约为1:1:10。AAV包裹单链(ss)DNA基因组。野生型基因组的长度约为4.7 kB。基因组两侧有两个倒置末端重复序列(ITRs)，它们在复制和基因组包装中起着重要作用。目前，主要用于rAAV研究的生产平台是人HEK293细胞的瞬时转染，然而其HEK293细胞的制造限制其大规模地用于AAV载体的生产。杆状病毒感染的Sf9细胞系已被发现是一种可行的生产方法，但是研究发现在生产过程中出现的ITR丢失和基因组截断现象，似乎成为了Sf9细胞系必须关注的一个问题。因为包裹着不完整的基因组的载体，会使得治疗的有效性降低。　　在本研究中，作者提出了一种利用电荷检测质谱(CDMS)直接检测从AAV中提取的DNA的方法。CDMS可以使用静电线性离子阱(ELIT)同时检测单个粒子的电荷数和质荷比，从而直接获得粒子的质量。测量是在一个自制的仪器上进行的，简单地说，纳喷雾(Advion Triversa Nanomate)产生的离子通过金属毛细管进入仪器，然后通过几个不同真空区域。第一个区域包含FUNPET(an ion-funnel ion-carpet hybrid)，随后是射频六极杆和分段射频四极杆。FUNPET会破坏气体通过毛细管时形成的气体射流，样品离子随即在六极杆中被热化，最终的离子能量由六极杆上的直流电位决定。离子束在分段四极杆中的径向分布被压缩，经过四极杆的离子通过非对称艾泽尔透镜聚焦到双半球形偏转能量分析器中，并设置传输具有较窄动能分布的离子(以100 eV/z为中心)。传输的离子被聚焦到ELIT中，其中一些离子被捕获并通过位于ELIT端帽之间的检测圆筒来回振荡。振荡离子产生的信号被电荷敏感放大器接收。信号被放大和数字化，然后用快速傅里叶变换(FFTs)进行分析。短时间窗口FFT通过每个捕获事件的信号进行转换，以确定离子是否在整个事件中被捕获。没有在整个事件中存活的离子信号将被丢弃。振荡频率与m/z有关，振幅与电荷成正比。用这种方法测量了数千个离子，并将其分成直方图以给出质量分布。　　　　图1. 来自Sf9细胞的AAV8-CMV-GFP的CDMS测量。(a,b)未孵育样品的质量分布和电荷与质量散点图。电荷与质量散点图中的橙色线是球形离子瑞利电荷极限的预测。(c,d)在45°c孵育15分钟后测量的质量分布和散点图。(d)中的插图显示了基因组从衣壳挤出的示意图。(e,f) 80°C孵育15 min后的结果。绿色虚线表示释放的ssDNA GOI的序列质量，紫色虚线表示互补DNA链碱基对进入溶液后的序列质量。图1第一排的图片显示了用CDMS测量的Sf9细胞制备的AAV8-CMV-GFP的质量分布。在4.5MDa处的主峰是由于rAAV对GOI进行了包装，在5.2MDa处的峰值是由于异质DNA的包装达到了包装容量，在3.7处MDa的肩峰是由于空颗粒。对应的电荷-质量散点图如图1第二排所示。其中空颗粒和包装了DNA的颗粒在电荷上的数值比较接近是因为DNA被包裹到了衣壳的内部。图1c显示了AAV8-CMV-GFP在45°C孵育15min后测量的质量分布。rAAV已经开始分解，存在大量质量低于3 MDa的离子。在3.7 MDa处的空颗粒的数量也大幅增加，这表明基因组正在被释放。而在80℃孵育15min后可见AAV已经完全分解，对应峰也消失了，而剩下的峰与推测的互补DNA链的分子量相当。图2显示了培养后为提取GOI而测量的rAAV载体的CDMS质量分布和电荷-质量散射图。值得注意的是，AAV8-CMV-CRE和AAV8-CAG-GFP(来自Sf9细胞)的平均电荷约为400 e, AAV8-CMV-GFP(来自HEK细胞)的平均电荷约为900 e。平均电荷的差异可能反映了dsDNA的整体几何结构，电荷越高的GOIs具有更广泛的结构。　　　　图2. 在80°C孵育15分钟后记录的代表性质量分布和电荷与质量散点图。结果显示AAV8-CMV-CRE、AAV8-CAG-GFP和AAV8-EF1a-GFP来源于Sf9细胞，AAV8-CMV-GFP来源于HEK细胞。紫色虚线显示dsDNA GOI的序列质量。插图显示了dsDNA GOI的峰值的扩展视图。图3a显示了测量到的dsDNA GOI与AAV样本序列质量的偏差的柱状图，对于大多数AAV样本，测量的dsDNA GOI大于序列质量。这种偏差可以用反离子来解释。DNA在中性溶液中带负电荷，因为它的一些主链磷酸被电离，dsDNA GOI有2219−3443个碱基对，因此它们可能有多达4438−6886个反离子。最可能的反离子是NH4+因为样品是用醋酸铵溶液电喷涂的。如果所有的dsDNA GOI主链磷酸都被电离并且有NH4+反离子，则附加质量(超出完全电离序列质量)为80 ~ 124 kDa。而有些dsDNA的分子量低于预测的序列质量，这是因为序列发生了截断导致的，图3d显示了为该样品测量的DNA峰值的扩展视图。峰宽可以提供截断分布的信息。如果所有的DNA链都损失了425 nt，峰值就会很窄。另一方面，如果截短长度分布较宽，则会产生较宽的峰值。图3d中的峰值相对较窄，说明分布较窄。有一个高质量拖尾，这可能表明一些基因组被截断了小于425 nt。　　　　图3. 来自Sf9和HEK细胞的一系列GOIs的AAV8、AAV9和AAVDJ血清型的dsDNA质量测量总结。(a)测量质量与序列质量偏差的柱状图。(b)考虑反离子的测量质量与预期质量的偏差的柱状图。(c) AAV基因组结构示意图。(d)来自HEK细胞的AAV8-CMV-CRE的dsDNA GOI峰的扩展视图。最后，将CDMS测量的基因组截断与来自第三代测序方法的信息进行比较将具有指导意义。尽管CDMS测量可以判断基因组是否被截断以及缺失的数量，但它不能确定截断发生在哪里。关于截断发生位置的信息可以从第三代测序中获得，这些信息反过来可以深入了解其机制。因此，CDMS测量全基因组MW和第三代测序是互补的。CDMS测量可用于筛选截断的基因组，以便通过第三代测序进行后续深入分析。　　撰稿：李孟效　　编辑：李惠琳　　文章引用：Analysis of AAV-Extracted DNA by Charge Detection Mass Spectrometry Reveals Genome Truncations　　李惠琳课题组网址www.x-mol.com/groups/li_huilin　　参考文献　　1. Barnes, L. F. Draper, B. E. Kurian, J. Chen, Y. T. Shapkina, T. Powers, T. W. Jarrold, M. F., Analysis of AAV-Extracted DNA by Charge Detection Mass Spectrometry Reveals Genome Truncations. Analytical Chemistry, 4310-4316.

随着改变生命的治疗方法的出现，生物制药的未来前景广阔，2018 年的诺贝尔奖更是授予了免疫检查点疗法，基于这一疗法的 PD-1 正在拯救更多癌症病人的生命，推动这些新型生物治疗药物安全地应用于临床需要可靠的生产和质量控制过程。生物治疗药物复杂的异质性需要借助准确而稳定的分析检测方法进行分析，并需要可靠的色谱分离。鉴定关键质量属性(CQA) 是实施质量源于设计 (QbD) 原则以开发和生产生物药物的过程中最困难的一步。定义各种产品属性极具挑战性，因此，产品质量的一致性变得更加重要。滴度测定、糖链分析、电荷异构体分析、氨基酸和培养基分析、肽谱分析、聚集体分析、完整蛋白和亚基分析都是关键质量属性重要的技术，然而想要成功地获取最佳的实验结果，需要操作者能切中要害，找到关键之处，让我们也一起来“划重点”说一下这些技术的难点以及关键所在。滴度测定技术应用滴度测定是对于单克隆抗体，最有效的滴度测定方法之一是亲和色谱法。选择 Protein A 或Protein G 色谱柱时，首先要考虑的是待纯化或分析的目标蛋白质，再选择合适的流动相和样品方法。实验痛点您可能并没有注意到洗脱液对基线噪音以及色谱柱寿命的影响，也并不清楚如何最大程度延长这些“有生命”的色谱柱寿命，然而这正是容易被您忽视的关键所在。快速有效的糖链分析技术应用翻译后修饰( PTM )可能形成许多不同类型的异构体。糖基化尤其高度可变，而糖基化对于许多蛋白质的功效具有重大影响。FDA 认为这是一项重大挑战，并就如何确定糖指纹谱提供了指导。实验痛点如何获取难分离糖链结构的最佳分离度？为此具体的方法条件都包含什么？例如，A 柱和 B 柱的选择？仪器的选用？柱温、流动相、 FLD、进样量等应如何选择和设置？不仅如此，如何能够快速的获取有效的实验结果是整个方法优化的痛点所在。电荷异构体分析技术应用离子交换色谱可以分离一些电荷异构体，特别是那些位于蛋白质表面（而不是隐藏在结构内）的电荷异构体。由于大多数蛋白质所含的碱性氨基酸多于酸性氨基酸，因此大多数电荷异构体分离需要采用阳离子交换。实验痛点从离子交换 ( IEX ) 色谱的使用、色谱柱选择，流动相的重要注意事项、到IEX 的一般使用经验规则都是电荷异构体分析能否成功的关键，不仅如此，在操作中还有若干仪器注意事项，所以此项分析需要注意的关键点会非常多，需要操作者根据电荷异构体的不同情况，具体问题具体分析。氨基酸和培养基分析技术应用氨基酸和培养基分析主要用于确定蛋白质的氨基酸组成与其他技术一起使用以确认正确的结构。氨基酸也是用于制备重组蛋白质的细胞培养基中的关键成分。氨基酸本身属于两性离子，并具有各种侧链，它们还缺少合适的UV 发色团，使得分离和检测氨基酸非常具有挑战性。实验痛点如何实现所有常见氨基酸的基线分离并确保符合欧洲药典的系统适用性，这是非常挑战实验员操作水平的。肽谱分析技术应用肽谱分析是一项强大的技术，可用于全面鉴定蛋白质的一级结构，还能够区分蛋白质内异构基团的精确位置。使用这种方法，蛋白质将被分解成单独的片段，然后将这些物质分离成经典的“指纹”色谱图。将分离与质谱检测相结合，能够将肽谱分析色谱图中观察到的实际的峰与分析软件预测的预期片段相关联。实验痛点要成功生成肽谱，需仔细检查完整的表征策略。其中样品前处理对于成功的肽谱分析至关重要，这可能是一个耗时的过程，可能需要针对待酶解的各种蛋白质优化多个步骤。然而打好基础熟练掌握肽谱分析流程的基本技术才是成功的第一步，此外，进行肽谱分离优化时需要注意诸如覆盖率等事项，才能尽可能获得最佳结果。聚集体分析技术应用体积排阻色谱是特别适合从高阶聚集体中分离单体峰的技术之一。随着技术发展，人们将目光投向了除单克隆抗体以外的蛋白质药物。抗体药物偶联物等更为复杂分子的聚集体表征可能更具挑战性，因为疏水性细胞毒性药物的存在可能导致许多体积排阻色谱柱无法发挥理想性能。使用可显著降低次级相互作用风险的新型固定相，将非常适合聚合物的快速分离和定量。实验痛点聚集体分析中，如何确保稳定可靠运行SEC分析，使用何种条件才能确保分析过程中蛋白质稳定，以及怎样维护这一易耗品，是该分析获取有效实验结果的关键。完整蛋白和亚基分析技术应用完整蛋白和亚基分析可以用来比较生物仿制药与原研药。在反相条件下，分子很可能发生变性。样品保留在色谱柱上得到浓缩，且适用于质谱分析。因此，该技术适用于测定完整蛋白和亚基分析的精确质量数。实验痛点如何考虑选择完整蛋白和亚基分析色谱柱的多个相互关联因素：样品分子量和最适合的填料孔径，色谱柱固定相，流动相条件，以及速度或通量要求等。这些都是完整蛋白和亚基分析的关键。如果您希望提高上述所有分析的分析效率、方法稳定性和分析结果的可靠性，安捷伦已经为您准备了最新最全版本的《安捷伦生物色谱住关键质量属性应用文集》，内容包括从样品前处理到获取最佳实验结果的全部操作流程和技术干货指导以及相关的仪器及耗材选择攻略。扫描下方二维码，关注“安捷伦视界”公众号，获取更多资讯。

使用超高效合相色谱(UPC2)分析短杆菌肽Sean M. McCarthy, Andrew J. Aubin, 和 Michael D. Jones沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德)应用效益■ 快速分离短杆菌肽■ 载量线性响应■ 准确、高精度分析短杆菌肽的方法■ 有可能用于其它疏水性肽和蛋白质沃特世解决方案ACQUITY UPC2系统ACQUITY SQDACQUITY UPC2 CSH氟苯基色谱柱Empower&trade 3软件关键词超高效合相色谱、UPC2、疏水性肽、短杆菌肽简介用反相液相色谱(RPLC)分析疏水性肽和蛋白质难度很大，因为溶液中经常需要使用洗涤剂保持疏水性物质的稳定性，而这些洗涤剂容易发生聚集和/或沉淀，严重影响它们的回收，这些因素以及其它原因使得难以用RPLC分离疏水性肽和蛋白质。在本应用纪要中，我们为您介绍一种在ACQUITY UPC2TM系统上使用沃特世(Waters)超高效合相色谱技术分离典型跨膜肽-短杆菌肽的方法。短杆菌肽是由芽孢杆菌产生的一种常见和已被良好表征的跨膜肽物质，它被用作对抗革兰氏阳性和某些革兰氏阴性细菌的局部用抗生素，短杆菌肽包括通用组成为甲酰-L-缬氨酸-甘氨酸-L-丙氨酸-D-亮氨酸-L-丙氨酸-D-缬氨酸-L-缬氨酸-D-缬氨酸-L-色氨酸-D-亮氨酸-L-X-D-亮氨酸-L-色氨酸-D-亮氨酸-L-色氨酸-氨基乙醇的一族化合物，其中X取决于短杆菌肽分子，即分别占总短杆菌肽量约87.5%、7.1%和5.1%的革兰氏A(X=色氨酸)、革兰氏B(X=苯丙氨酸)和革兰氏C(X=酪氨酸)，1需要交替的D和L氨基酸单元构成_-螺旋状。我们研究了色谱柱化学品、流动相改性剂和梯度斜率对分离短杆菌肽的影响。采用优化方法分离市场上销售的非处方药物(OTC)，将测定的短杆菌肽浓度与标示量进行对比。采用质谱仪测定短杆菌肽的浓度，采用选择离子谱表征每种物质。在ACQUITY UPC2系统上使用我们的方法，可得到线性和可重复的结果&mdash &mdash 测定的OTC制剂浓度为标示量的98.4%。试验测试条件除非另有说明，以下是用于所有色谱最终方法的最佳条件。UPC2测试条件UPC2系统: ACQUITY UPC2检测器： PDA、ACQUITY SQD PDA @ 280nm,分辨率为6 nm(补偿400至500 nm)色谱柱： ACQUITY UPC2 CSH 氟苯基,3.0 x 100 mm, 1.7 &mu m柱温： 50 ° C样品温度： 15 ° CUPC2 ABPR: 1885 psi进样量： 1 &mu L流速： 2.0 mL/min流动相A： CO2流动相B： 含0.1%TFA的甲醇(除非另有标示)梯度： 20%至30% B，1.5minSQD条件离子源： ES+锥孔电压： 20 V毛细管电压： 3.7kV源温度： 150 ° C脱溶剂气温度： 500 ° C脱溶剂气体流速： 400 L/hr锥孔气体流速： 25 L/hrSIR: 922.6,930.3,941.9数据管理Empower 3软件样品描述用解硫胺素芽孢杆菌(短芽孢杆菌)制备的短杆菌肽从Sigma Aldrich公司购买，将样品溶解在甲醇中制成0.5mg/mL浓度的溶液，如需要，可用甲醇稀释。含有短杆菌肽的非处方软膏是从当地药店购买的。将0.2g软膏溶解在10mL正己烷中，然后用5mL甲醇萃取短杆菌肽，去除甲醇层，用0.2-&mu m的烧结玻璃盘过滤，然后直接进样ACQUITY UPC2系统。结果与讨论我们系统性地筛选了四种色谱柱，测定哪种分离效果最佳，结果如图1所示，色谱柱筛选过程可在1小时内非常快速地完成。在我们设定的筛选条件下，BEH 2-EP和BEH色谱柱未检测到谱峰，由于其它色谱柱表现出合适的色谱性能，因而未对这两者的非洗脱原因深入研究，其中ACQUITY UPC2 CSH氟苯基色谱柱检测的色谱峰形最佳，因此采用该色谱柱继续研究。图1.通过短杆菌肽标准物的色谱峰形和保留时间筛选各种化学特性色谱柱。所有色谱柱规格为3.0x100mm，填装亚-2-微米填料；所有分离条件都采用流动相 A：CO2、流动相 B、含0.1% FA的MeOH、2 mL/min, 3%B至25% B，5min。为了分离短杆菌肽物质，对酸性改性剂的影响进行了研究，结果表明：使用三氟乙酸(TFA)可得到稍好的峰形，提高了短杆菌肽A和短杆菌肽C之间的分离度，结果如图2所示。已知TFA会抑制质谱电离，但每种物质的信号都足以定量检测治疗制剂，后续将对此进行讨论。对于要求更高灵敏度的应用，可能需要降低TFA浓度或使用甲酸，以达到希望的检测限值。图2.酸性改性剂对分离短杆菌肽的影响。当设置好合适色谱条件后，通过减少梯度时间优化分离过程，结果如图3所示，我们能够在1.5分钟时间内使每种短杆菌肽组分的分离度达到1.4或更高，在相同流速下通过减少运行时间增加梯度斜率，不但实现有效分离，同时还将短杆菌肽A的信噪比从336提高至605。图3.UV 280-nm痕量检测优化分离短杆菌肽A、B和C。我们测试了最佳分离条件，能够使用单四极杆质谱(SQD)检测每种物质，图4显示：每种物质都被质谱良好分离和检测到，另外每种短杆菌肽物质都显示含有绝大多数的M+2H离子，后续的研究将使用这些参数进行选择离子监测。图4：每种短杆菌肽物质的总离子图谱-A和加合离子图谱-B-D。选择强度最高的离子评估市场上销售的抗菌制剂中的短杆菌肽含量，对于多肽序列，红色残基是L型同分异构体，黑色残基是D型同分异构体。为了评估我们的方法是否适用于定量分析市场上销售的非处方药中的短杆菌肽，我们在ACQUITY SQD上使用选择离子监测，结果如图5A所示。我们绘制浓度-峰面积曲线，得到每种物质的校正曲线。结果发现：如图5B-D所示，每种成分在测试范围内都呈线性响应。另外还使用校正曲线测定了非处方药物中的每种短杆菌肽物质浓度。图5，图A-25.0、12.5、1.25和0.625mg/mL浓度的标准溶液中含有短杆菌肽物质的叠加选择离子谱。图B、C和D-每种短杆菌肽A、B和C各自的MS峰面积线性拟合图。使用开发的方法评估非处方药物中的短杆菌肽物质的浓度和相对丰度。如图6所示，重复分析结果表明：每种短杆菌肽%RSD值小，计算浓度与标签上的标称值相吻合；我们还发现短杆菌肽物质的相对丰度与文献报道的丰度非常吻合1。图6. 从抗菌软膏中萃取的短杆菌肽A、B和C的叠加选择离子谱重复进样分析的计算RSD值(N=3)在可接受限值以内，计算丰度与文献报道数值非常吻合1。结论正如本应用纪要所展示的，ACQUITY UPC2系统与ACQUITYUPC2色谱柱化学结合使用，可为短杆菌肽提供简单、准确和可重现的分析方法。该工作表明ACQUITY UPC2系统可用于分析疏水性肽，还可能用于分析疏水性蛋白质，例如膜蛋白。参考文献1. The Merck Index and Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals.13th ed. Whitehouse Station, NJ : Merck Research Laboratories 2001.关于沃特世公司 (www.waters.com)50多年来，沃特世公司(NYSE:WAT)通过提供实用和可持续的创新，使医疗服务、环境管理、食品安全和全球水质监测领域有了显著进步，从而为实验室相关机构创造了业务优势。作为一系列分离科学、实验室信息管理、质谱分析和热分析技术的开创者，沃特世技术的重大突破和实验室解决方案为客户的成功创造了持久的平台。2010年沃特世拥有16.4亿美元的收入和5,400名员工，它将继续带领全世界的客户探索科学并取得卓越成就。联系人：叶晓晨沃特世科技（上海）有限公司 市场服务部xiao_chen_ye@waters.com周瑞琳(GraceChow)泰信策略(PMC)020-8356928813602845427grace.chow@pmc.com.cn

中国药典和欧盟药典在蛋白质药物成品检验中规定肽图需要与标准品一致，因为属于鉴别项目，不需要定量比较，所以很多人觉得可以“依葫芦画瓢”尽力就好。事实上，生物类似药的肽谱是需要与原研药完全一致的，另外很多实验员在做肽谱分析时重现性很差，需要实验操作者综合考虑蛋白质本身、实验目的以及预期结果，需要实验员具备优质的样品前处理技术、强大的技术分离能力和信息，才能够获取最佳的蛋白水解消化物分离，并进行肽段的可靠表征分析。所以，别怪我没告诉你，肽谱分析真的“肽”重要了，也是难度很高的一个检测项目。干货太多，今天先从蛋白质酶解的独立开发方案说起。关于蛋白质酶解的独立开发方案，把浓缩过的“精华”给你图为蛋白质酶解的 5 大步骤样品前处理要“量体裁衣”根据蛋白质的大小或结构，样品的前处理方法不尽相同。 在特定的条件下，可能需要进行样品富集，或从所添加的物质和稳定剂（用于产品剂型中）中分离蛋白质，尤其是在这些添加剂会干扰肽谱分析过程时。针对这些流程，现已开发出许多方法，每种蛋白质均具有一套对应的纯化措施或处理方法。但是，酶解前通常会使用一些更常用的方法进行样品纯化，包括去除/富集、透析和凝胶过滤脱盐。去除和富集策略去除和富集策略分别被开发用于去除样品中的高丰度蛋白质或分离目标蛋白质。更多的时候，去除用于蛋白质组学应用，用以降低生物样品（例如，血清）的复杂性，此类样品中含有高浓度的白蛋白和免疫球蛋白。去除策略可以利用免疫亲和技术（例如，免疫沉淀、免疫共沉淀及免疫亲和色谱法）。另一方面，富集技术会根据独特的生化活性、翻译后修饰 (PTM) 或胞内的空间定位分离细胞蛋白的亚类。翻译后修饰（例如磷酸化和糖基化）可使用亲和配体（例如，金属离子亲和色谱 (IMAC) 或固定化凝集素）分别进行富集。为引入独特的蛋白质化学，其他技术需使用代谢或酶促结合修饰后的氨基酸或 PTM。利用透析和脱盐优化样品处理不论是简单的样品还是复杂的样品，常需要通过透析或脱盐对样品进行优化处理，以确保它们酶解过程的兼容性。例如，由于质谱法 (MS) 将测定带电离子，因此必须在 ms 前进行除盐（特别是钠盐和磷酸盐），最大程度减少它们对检测的干扰。透析和脱盐产物可进行缓冲液交换、脱盐或小分子去除处理，以防止对后续过程的干扰。透析是降低样品盐浓度的常规流程。具体步骤是先将样品装入透析袋（袋膜具有特定的孔隙）中，袋口打结，然后将其置入水浴或缓冲液中，通过扩散使盐浓度达到平衡。大分子无法扩散出透析袋，会留在袋内。如果使用水浴，袋内小分子的浓度会缓慢降低直到透析袋内外浓度相同。达到平衡后，即可撕破透析袋，将其中的溶液倒入收集容器中。虽然透析体积可达几升，但对于大量样品却并不实际，因为会需要几天时间才能将盐完全去除。凝胶过滤 (GF) 是最实用的实验室流程凝胶过滤 (GF) 是最实用的实验室流程，可在酶解前对样品进行脱盐。该方法是一种非吸附的色谱技术，可根据分子大小进行分子分离。脱盐可被用于完全去除或降低样品中的盐浓度或其他小分子量成分，而缓冲液的更换则会使用一种新的缓冲液替换样品中的缓冲液。凝胶过滤法是最简单的色谱操作法之一，因为样品均在度洗脱条件下处理。在其分析形式中，凝胶过滤法（也称为体积排阻色谱）可分离分子量差异大于两倍的分子（例如，蛋白质）。在这些应用中，目标分离物质的体积差异非常大（即蛋白质与盐相比）。通过选择凝胶过滤填料，可完全排除较大的分子，同时允许较小的分子自由扩散至 所有的孔隙中。色谱柱使用缓冲液进行平衡，它与样品的缓冲液可能相同，也可能不同。将样品加载至色谱柱后，再添加更多的色谱柱缓冲液（洗脱缓冲液），携带样品分子自上而下地流过色谱柱。较大的分子（不能进入填料的孔隙中）首先从色谱柱中洗脱出来，然后是扩散入孔隙的较小分子，相对于较大的分子，小分子的洗脱时间更长。如果洗脱缓冲液与样品使用的缓冲液不同，则较大的分子会从原始盐中替换出来，并被这种新的缓冲液洗脱，从而从最初的样品缓冲液中完全分离出来。一张图告诉你，化学裂解和酶解怎么选？裂解肽键的方法有两种 ― 化学裂解和酶解，但是到底怎么选，这取决于需要分析的蛋白质和您所期待的结果。一张图告诉你，如何选择酶解试剂。为使蛋白水解酶有效地裂解肽链，需要利用各种试剂对样品进行变性、还原和烷基化。而在酶解的部分还需要对酶解的 PH、酶解时间及温度、还有裂解酶的浓度等因素充分考虑。访问安捷伦《安捷伦生物色谱住关键质量属性应用文集》，了解更多信息。扫描下方二维码，关注“安捷伦视界”公众号，获取更多资讯。

近期，清华大学化学系瑕瑜教授课题组与清华大学药学院尹航教授课题组以及北京清华长庚医院王韫芳研究员团队合作在Angew. Chem. Int. Ed杂志上发表了题为 “sn-1 Specificity of Lysophosphatidylcholine Acyltransferase-1 Revealed by a Mass Spectrometry-based Assay” 的文章。第一作者为清华大学化学系博士生赵雪与梁家琦，通讯作者为瑕瑜教授。该工作首次揭示磷脂酰胆碱酰基转移酶1(LPCAT1)在合成胆碱甘油磷脂 (PC)时对甘油骨架的sn-1位置具有选择性 该选择性与LPACT1在人肝细胞癌组织中的高表达直接导致了sn位置异构体PC 18:1/16: 0的显著升高。以上研究对于发展基于脂质异构体分析的新型疾病诊断与靶点发现具有启示意义。　　LPCAT1是细胞内PC的合成通路中脂质重塑过程关键的酶。已有相关研究表明，LPCAT1在多种癌症组织中表达上调并且对饱和或单不饱和的酰基辅酶具有选择性。然而LPCAT1对甘油骨架sn位置的选择性还尚不明确，这主要是由于sn位置异构体难以区分与定量。2019年瑕瑜教授课题组利用PC碳酸氢根加合物([PC+HCO3]-)在串级质谱中碎裂产生的“sn-1 frag.”实现了sn位置异构体的定性与定量(Zhao X, Xia Y, et al. Chemical Science, 2019, 10:10740)。基于此，本工作建立了测定LPCAT的sn位置选择性的LC-MS流程。作者以sn-1 LPC和sn-2 LPC的混合物为底物，LPCAT1过表达的HEK 293T细胞膜碎片作为酶源，加入酰基辅酶，37℃下进行孵育。酶反应产物通过反相液相色谱(RPLC)中分离及质谱检测 其与内标的色谱峰面积比对总的合成产物(sn位置异构体之和)进行定量。继而对酶反应产物的碳酸氢根加合物进行串级质谱分析，通过“sn-1 fragment”的百分比对sn位置异构体进行定量(分析流程如图1)。继而通过建立sn-1 LPC和sn-2 LPC的酶反应动力学曲线，比较动力学常数来确定sn位置选择性。　　图1. LC-MS/MS流程用于定量分析LPCAT催化所产生的PC sn位置异构体　　鉴于不同分子量的PC分子可以在RPLC中分离，该流程可以同时测定LPCAT1对多种酰基辅酶(如，17:0-CoA, 18:1-CoA和20:4-CoA)的选择性。结果显示LPCAT1对三种酰基辅酶均表现出活性，20:4-CoA的活性最低。当LPCAT1将三种酰基辅酶连接到甘油骨架上时，均选择性的加在了sn-1位置，即只合成了PC 17:0/16:0，PC 18:1/16:0和PC 20:4/16:0。因此，基于图1的LC-MS/MS分析流程，该研究首次明确了LPCAT1对甘油骨架的sn-1位置具有选择性。　　已有研究表明LPCAT1在肝细胞癌组织中表达上调。为了探究肝细胞癌中PCsn位置异构体的组成是否会受到LPCAT1对sn-1位置选择性的影响，该工作对人肝细胞癌组织和正常肝组织中PC的sn位置异构体进行LC-MS/MS分析。结果显示PC 18:1/16:0在肝细胞癌组织中显著上升。该工作进一步对常用的肝癌细胞系HepG2中的LPCAT1进行敲降，敲降后PC 18:1/16:0的含量显著下降。这表明肝细胞癌组织中PC 18:1/16:0的含量与LPCAT1对sn-1位置的选择性以及LPCAT1的表达上调直接相关。更重要的是，解吸电喷雾电离质谱(DESI)对PC 18:1/16:0的分布成像与人肝细胞癌组织连续切片的LPCAT1的免疫荧光成像以及H&E染色高度吻合(图2)。因此PC 18:1/16:0可能作为新型生物标志物，用于划分癌变区域和癌旁区域。　　图2. 人肝细胞癌组织连续切片H&E染色(a)组织中LPCAT1的免疫荧光成像(b)以及DESI MS2 对PC 16:0_18:1的sn位置异构体分布的成像(c, d)　　总的来说，该工作建立了用于测定LPCAT的sn位置选择性的快速、灵敏、高通量的LC-MS/MS分析流程。它深度剖析了组织中sn位置异构体的组成、分布与酶的功能、分布的关系 阐明了脂质异构体作为新型生物标志物用于疾病的诊断与治疗的巨大潜力。不过其他几种LPCAT在连接酰基辅酶时对sn位置选择性还有待进一步研究。

糖是组成生命体的四大类重要分子之一，糖蛋白质是由糖链与肽链中的特定氨基酸残基以糖苷键共价连接而成的蛋白质。糖蛋白质普遍存在于生物体内，在很多生命过程中起着重要作用，如蛋白质的折叠、细胞之间的相互识别、炎症反应等。同时，糖基化修饰在疾病中，特别是肿瘤的发生、发展和转移过程中也起到重要作用，许多疾病诊断标志物及治疗的靶标都是糖蛋白质。糖蛋白质组学和糖组学的研究具有重要的科学意义。以基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)和电喷雾质谱(ESI-MS)为代表的生物质谱技术，因具有快速、灵敏、可提供结构信息等优点，已成为糖蛋白质组和糖组分析的重要工具。　　由复旦大学杨芃原教授团队撰写的综述文章“质谱技术在糖蛋白质组学与糖组学方面的研究进展”发表于2016年第3期的《国家科学评论》。这篇综述论文系统介绍了近年来以质谱为核心的糖蛋白质组和糖组的研究策略和方法，以及该领域重要的生物和临床发现。重点讨论了国内糖蛋白质组学和糖组学研究团队在糖蛋白质和糖链的分离富集、糖链的衍生，糖链和糖蛋白质的质谱碎裂技术，糖链及糖蛋白质序列组成分析的软件技术等方面的进展，并分析了基于质谱技术的糖蛋白质组和糖组研究的关键问题，展望了该领域未来的发展趋势。　　杨芃原教授团队在基于质谱的糖蛋白质组学和糖组学方面展开了系统的研究。他们发展了一系列糖蛋白质/糖链富集和质谱定性的新方法，建立了基于复合纳米材料的富集新方法，基于新的共价反应的富集新策略，以及基于协同富集思路的富集新流程 建立了一系列糖蛋白质/糖链的质谱定量新方法，提出了酶促去糖链过程中的标记定量新方法和糖蛋白质组在蛋白质水平、糖基化程度水平及糖链水平的同时定量新方法等 开发了高通量糖蛋白质质谱检索的新算法等。这些工作提升了中国糖蛋白质组学和糖组学的研究水平，为糖蛋白质组学和糖组学研究提供了新的研究方法。

普渡大学和Tymora Analytical Operations的科学家团队通过对尿液胞外囊泡（EVs）蛋白质和磷酸化蛋白质进行质谱分析识别了一组可用于诊断帕金森病的蛋白质标志物。该项工作于本月发表在Communication Medicine，其中详细介绍了研究工作。该研究的部分资助来源于迈克尔J福克斯帕金森研究基金会，该组织的一部分工作就是探究EVs分析是否能识别新型的帕金森病标志物。EVs是由细胞分泌到各种体液中，被认为能反映来源细胞的分子组成。鉴于检测源自癌细胞的外泌体中的蛋白质或核酸比检测患者血液或尿液中自由循环的癌细胞相关核酸或蛋白质可能更容易的想法，胞外囊泡已成为液体活检研究的一个热门领域。同样的思路也适用于神经退行性疾病，尤其是从血液或尿液样本中寻找这些疾病的标志物，血液或尿液相比于脑脊液易于获取，但含有的相关标志物浓度通常较低。总部位于印第安纳州威斯特拉法叶市的Tymora是普渡大学化学生物学和分析化学教授安迪陶（Andy Tao）实验室的衍生企业。Tymora的首席执行官是Communication Medicine论文的通讯作者之一Anton Iliuk。Tymora专注于EVs的蛋白质组学和磷酸化蛋白组学分析，将其作为研究服务出售给外部合作伙伴以及用于其内部生物标志物和诊断方法的开发工作。2018年，该公司及其合作者在Journal of Proteome Research杂志上发表了一项研究，在该研究中，他们在尿液中收集的EVs中鉴定出约860种磷酸化蛋白质和超过2,000种未修饰的蛋白质。迈克尔J福克斯帕金森研究基金会的研究项目副总裁Shalini Padmanabhan是该论文的作者之一，她表示，基金会的研究人员在阅读该研究时“对结果很有兴趣”，因为鉴定到的蛋白中包括几种与帕金森病有关的蛋白质。Padmanabhan指出，当时基金会已经收集了大量来自帕金森病患者的尿液样本，并由Tymora技术看到一个检验新方法（识别帕金森病患者EVs蛋白质特征相对于健康对照组的变化）的机会。研究人员使用Tymora的EVtrap技术从哥伦比亚大学欧文医学中心收集的82个尿液样本中分离出EVs（21个健康对照组，13个携带与帕金森病相关的LRRK2突变但健康的人，28名没有LRRK2突变的帕金森病患者和20名携带LRRK2突变的帕金森病患者）。EVtrap方法使用包被疏水和亲水基团的磁珠来结合EVs的脂质双层膜。该方法可灵敏且可重复地捕获EVs，同时限制高浓度循环蛋白的捕获，这是相对于其他一些EV富集方法的优势。在分离出外泌体后，研究人员在赛默飞Q-Exactive HF-X仪器上进行LC-MS分析其蛋白质。他们识别4,476个独特的蛋白质和2,680个独特的磷酸化蛋白质，从中筛选出48个潜在的标记物，并最终确定了6个最佳标志物。他们发现，这六个标志物组合可以在曲线下面积为0.94的情况下区分健康人群和帕金森病患者。随后，研究人员用两个实验验证了这些表现最佳的蛋白质和与帕金森有关的其它蛋白质。其中一个实验利用靶向质谱技术测定13名健康对照组和23名帕金森病患者的蛋白质，另一个实验使用免疫方法测定10名健康对照组和10名帕金森病患者的蛋白质。Tao 表示，他的实验室继续与哥伦比亚大学的研究小组合作获取更多的样本，并且正在与普渡大学的同事Jean-Christophe Rochet合作研究蛋白质聚集在帕金森病、阿尔茨海默病和Lewy小体痴呆等神经退行性疾病中的作用。Tao 和 Rochet 正在探讨的一个问题是外泌体是否可能成为突触核蛋白α-synuclein(α-syn)的有用来源。在帕金森病患者中，错误折叠的α-syn聚集形成路易氏小体在大脑中积累，被认为会引起神经元损伤，也被认为是潜在的药物靶标和生物标志物。对于帕金森病的诊断，α突触核蛋白种子扩增检测方法前景光明。该方法通过将来自患者的αSyn与正常αSyn孵育并观察其是否产生帕金森病的特征性聚集物。通常，αSyn突触核蛋白样品从患者脑脊液中收集，需要进行脊髓穿刺。这促使研究人员探索通过血液或尿液样品等微创性的方式收集这种蛋白质，其中外泌体是一种潜在的采样途径。Padmanabhan指出，“虽然α-synuclein的分布范围及与帕金森病生物学相关性的全面了解仍不充分，但已有人提出外泌体可能富集有α-synuclein，包括病理性形式。”她补充说，到目前为止，福克斯基金会将外泌体用作αSyn的样本来源的主要工作侧重于在血液中的外泌体，“血液中α Syn的存在已经有研究支持”。然而，她表示该组织“继续探索所有可能的CSF替代方案，以改进临床使用的检测，作为我们持续开展的突触核蛋白生物学研究项目的一部分”。CEO Iliuk表示Tymora不打算继续开发Communication Medicine论文中确定的标记物，但他指出，神经退行性疾病，特别是阿尔茨海默病，已成为Tymora内部生物标志物开发工作和为外部客户工作的重点。Iliuk指出，虽然血浆被广泛认为是临床诊断阿尔茨海默病生物标志物的最切实可行的替代样本，但帕金森病的研究显示了尿液EVs作为神经退行性疾病生物标志物来源的潜力。他说：“我们在血浆方面做了相当多的工作，我认为那是主要关注的地方。但是我们最近一直在研究尿液。现在还处于非常初期的阶段，人们对其作为一种可行的样本还存在很多犹豫，因为它距离大脑太远了，所以并不是一个合情合理的选择。但我认为帕金森病的研究表明神经退行性疾病的标志物可以传播到尿液中并被检测到。”福克斯基金会支持了许多其他在尿液中寻找帕金森病蛋白标记物的努力，包括2021年由马克斯普朗克生物化学研究所蛋白质组学和信号转导部门主任Matthias Mann实验室发表的蛋白质组学研究，该研究确定了几种潜在的帕金森病蛋白标志物。文章链接：https://www.nature.com/articles/s43856-023-00294-w

伴随着医学技术的迅猛发展，质谱技术快速走进人们的生活，特别是在医学中的应用越来越广泛，质谱技术在临床中快速鉴定细菌的成果颇为显著。近年来，全国各大检验室大力引进前沿的检测技术，主要针对微生物领域进行精准检测，质谱技术检测具有操作步骤简单、程序自动化和结果准确率高的优点，能够有效对微生物进行鉴定，此外，质谱技术具有高通量、高灵敏度和高特异性，基于此特点，该技术应用在临床微生物检测上，取得了惊人的效果。总而言之，质谱时代已经到来，打破了传统的微生物鉴定局限，为我国的医疗临床事业作出了巨大的贡献。一、质谱技术的应用原理及优势大量实验研究结果显示，质谱技术的工作原理很复杂，主要是对被检测的标本离子质荷比进行详细测定，采用标本与激光辐射基质混合点相结合形成结晶的方式，力争将标本通过基质分子吸附的方式将其电离，形成完全不相同的带电离子。同时，在带电离子的动能加速下，快速形成聚焦，从而进入质谱技术分析仪器科学分析。在微生物的检验中，质谱技术在一定程度上具有明显的优势，其主要优点在于检验时对标本的要求很低，不像传统的检验需要将标本进行分离甚至是提纯，质谱技术可以直接进行点样。与此同时，质谱技术检验微生物的准确性非常高且操作方便快捷。二、质谱技术在鉴定检测中的具体应用（一）细菌鉴定检测质谱技术应用于临床检验时可以对原始的样本进行检测，也可以对已经分离的纯菌落进行检测。实践证明，临床检验标本时采用质谱技术进行检测，其标本可以是原始样本，还可以是通过相关技术已经分离的纯菌落。临床上，质谱技术在对革兰氏阳性、阴性细菌进行检验鉴定时，其检验结果的准备性很高，但是，同样的标本采用原始检验方法进行对比，其结果相差很明显。在用原始方法与质谱检验方法检验革兰氏细菌的结果对比中，质谱技术检验结果明显比原始技术检验结果准确度高，同时采用质谱技术检验获取结果的时间更短，二者检验结果的差值在统计学上具有一定的存在意义。除此之外，质谱技术在细菌鉴定检测中还有一个特殊的优势，即能够将相同或相近的菌株准确区分开，从而快速鉴定出多种细菌的不同类型、各自的属性及种类等，最主要的是其准确率相当高，能够达到90%-95%左右，此外，在细菌鉴定中还有发现新型病原菌的可能。（二）真菌鉴定检测针对于真菌鉴定检验，质谱技术检验结果对比传统技术具有很高的精准率。在二者的真菌鉴定检测结果中，质谱技术检验结果要明显比传统检验方法更准确，且检测时常较短，其检验结果存在较大的差异性，在统计学上具有重要的存在意义。分析结果表明，因为真菌本身很干燥，不轻易挑选菌落，这种情形能够导致靶点涂菌分布不均匀，再加上检验人员如果在涂菌时涂得过薄，最后影响结晶不能完好形成，基于此特点，原始方法鉴定真菌，其鉴定检测结果与真实结果差异是非常大的。（三）药物敏感性检测临床上，质谱技术还可以对药物的敏感性进行检测，其检测结果具有极高的准确率，而且针对于药物敏感性的检测，质谱技术检验结果用时要比传统技术短很多，可以大幅度降低技术人员的劳动成本。质谱技术与传统技术在药物敏感性的检测中，除了在检测时间和检测结果上有很大的差异性外，在检测范围上也有所不同。传统技术检验范围具有一定的局限性，能够检测极少数的细菌，而质谱技术恰恰相反，可检测的范围十分广泛，且具有检测人工成本低和资源节约的作用。三、质谱技术的发展前景临床上，血液感染时一种十分严重且常见的感染性疾病，该疾病经常需要使用抗生素来治疗，但是由于抗生素使用的不规范，加上不间断的侵入性治疗方案陆续实施，导致每年因血液感染的发病机率持续升高，引起了医学界的高度关注。在过去应用传统的方法检验临床数据时，血培养鉴定结果经常需要很长的时间，进而严重影响治疗的最佳时间，因此，质谱技术应用在微生物检验上，解决了以往医疗上的大难题。大量的临床数据研究结果指出，根据目前的医疗科学技术能够把血液中的致病细菌大量提取出来，然后应用质谱技术检验细菌，对比之前的平板培养技术，其结果更加精准且耗时短。专家指出，有相关学者利用常规技术和质谱技术鉴定血培养结果，得出针对于血培养结果的鉴定还是质谱技术更准确、更快速，且具有明显的统计学意义。四、质谱技术存在的缺陷目前，在现代微生物检验技术中，质谱技术有着诸多优势，对比传统的检测技术，最明显的优势就是检验结果精准且用时很短，同时具有操作简单便捷、程序自动化的特点，但是在临床大量的实际检验中，质谱技术还是存在一定的缺陷，值得相关人员去大力研究。临床上，质谱技术是无法精准检验结构较为特殊的微生物菌种，例如罕见的菌种、新出现的菌种、复杂混合的菌种或与图谱极为相似的菌种，在检验结果上存在着一定误差。质谱技术检验细菌出现这种结果的原因是目前已有的数据库并不完善，现有数据库中已有的标准菌株图谱是有限的，质谱技术的数据库还需要持续不断的完善，因此在微生物鉴定的结果中会产生一定的差异，更无法对新型菌种和特殊菌种进行准确鉴定。除此之外，由于质谱技术刚刚在国内兴起，是一项新型高新技术，在微生物鉴定过程中要求技术人员的操作能力比较强，因技术员的相关知识匮乏、器械不充足或检验手法不熟练等因素都有可能对检验结果形成一定的差异，导致结果不准确。同时，质谱技术检验微生物是一种新型的技术方法，检验时需要采购相应的仪器，价格高昂的检验仪器导致市场推广难以进行。近年来，科学技术的高速发展有效推动了我国社会的进步，其中，作为重要的鉴定技术之一，微生物鉴定技术可以帮助医疗人员进一步实现对于病原微生物的合理理解与充分认识，基于此，医疗工作者在临床过程中可以进一步结合相关结果对于患者的健康情况进行全面分析，对于后续治疗方案的合理制定具有良好的促进意义。近年来，在科学技术的引导下，质谱技术在我国临床微生物鉴定工作中展现出了良好的应用价值，从而受到了广大医疗行业从业者的高度关注。总的来看，与传统微生物鉴定技术相比，质谱技术具有良好的应用优势，可以进一步提升微生物鉴定工作的效率与准确性，然而，该技术仍存在一定的发展空间，因此，为了更好地应用该技术为医疗行业服务，相关研究人员仍需结合大量临床实践合理做好对于质谱技术的探索与改良。

仪器信息网讯 2013年10月23日，第十五届BCEIA开幕，会议期间布鲁克· 道尔顿向与会观众展示了其最新推出的solariX-XR FTMS(傅里叶变换离子回旋共振质谱仪)及Impact HD&trade Q-TOF质谱仪。仪器信息网编辑特别采访了布鲁克· 道尔顿中国区生命科学部业务拓展经理卢嘉，请他介绍了新产品的特点、应用及市场情况。无可匹敌的超高分辨率solariX-XR FTMS　　2010年布鲁克推出了solariX-FTMS。在2011年ASMS期间，仪器信息网编辑曾采访了布鲁克&bull 道尔顿公司执行副总裁IanSanders博士，他说：&ldquo 在高端质谱仪领域，布鲁克一直是行业的佼佼者。特别是我们的solariX，将FTMS质谱仪的非凡性能体现到了极致，可以应对最具挑战性的样品分析。如果说FTMS的市场在缩水那是3年前的事，我们可以向你保证，FTMS的市场将来会有很大增长，而且没有公司能够在该领域与布鲁克进行竞争。&rdquo 在2013年ASMS上，布鲁克新一代FTMS solariX-XR首次亮相。　　Instrument：请您简单介绍一下solariX-XR FTMS的主要创新之处?　　卢嘉：solariX-XR FTMS主要的技术革新集中在检测器核心部件，我们突破传统设计打造了全新的&ldquo 和谐阱&rdquo ，实现了将质谱分辨率提高到千万级别，远远领先其他任何质谱类型。这种超越极限的究极分辨率，使得我们可以看见之前从未看到过的景象，拿到之前无法想象的数据信息。除了常规的质量数信息，还可以得到化合物的同位素精细结构信息。可以首次从究极的高分辨率质谱图中准确无误的&ldquo 读出&rdquo 化合物的分子式，这对于未知物的分析有着特别重大的作用。此外，随着分辨率的跃升，质量精度和灵敏度也随之提升。　　Instrument：solariX-XR FTMS可以解决研究人员工作当中的哪些问题?　　卢嘉：solariX-XR FTMS的超高分辨率没有任何同类仪器能够匹敌，而其超高的性能使得它几乎能胜任所有应用范围，但是考虑到其较高的价格，目前其主要应用集中在其他类型质谱无法解决的高端质谱应用，包括生物大分子精细分析、小分子组织分子成像、代谢组学分析、石油组学分析、环境复杂样品分析、未知物定性定量分析等。此外，对于液相、气相无法有效分离的样品，也可以通过solarix-XR直接分析，准确高效快速的得到定性定量结果。　　针对这些应用我们也配备了完善的软件或解决方案。例如针对小分子MALDI组织成像，有专用的组织切片靶版、基质喷雾仪、专业的控制采集处理软件、统计分析软件、报告生成软件，整个分析过程都可以高度自动化完成。再比如蛋白质糖基化修饰分析，除了配套的液质联用平台，还将蛋白质多肽分析与糖链分析集成在一起，只要一键就可以同时完成蛋白质和糖链的分析并整合在一起。此外，对于石油组学这类其他质谱无法胜任的相对专业的应用，我们也有成熟的样品处理流程、数据自动采集平台，以及专门的Composer数据分析软件。solariX XR FTMS&ldquo 和谐阱&rdquo 模型专为组学分析量身定制的Impact HD Q-TOF质谱仪　　2008年ASMS上，布鲁克率先推出了业界第一台超高分辨Q-TOF，近年来Q-TOF质谱仪器发展非常快，Q-TOF供应商的数量已超过五家，并且各项指标都有质的提高，动态范围更宽，可以同时进行定性和定量分析，而且速度更快，灵敏度也非常高。&ldquo 我们非常乐见同业伙伴陆续推出不同类型的类似产品，随着全新一代Impact HD的登场，我们相信会得到不同应用领域的用户认可欢迎。&rdquo 卢嘉说道。　　Instrument：请您介绍一下Impact HD Q-TOF质谱仪的创新之处?　　卢嘉：Impact HD Q-TOF质谱仪的创新表现在仪器平台的整体提升。从离子源到四极杆碰撞池，再到检测器，最后到控制软件都做了改进。离子源部分换用高灵敏度的nanoBooster纳升离子源，从而提高了组学分析的灵敏度 四极杆碰撞池的变化进一步提高了谱图，特别是二级谱图的灵敏度 检测器换用更快更灵敏的10位ADC检测器，采集频率可达50GHz，提高了采集速度、灵敏度和动态范围 控制软件采用更智能化的IDAS技术，专门针对复杂样品自动优化质谱参数，极大提高数据质量和重复性，也降低了仪器操作人员的门槛，让更多人在刚刚涉足质谱领域时就可以获得专业的数据结果。　　Instrument：Impact HD Q-TOF质谱仪可以为用户的分析工作带来哪些改变?　　卢嘉：Impact HD Q-TOF质谱仪的设计就是专门为组学分析量身定制的，尤其是复杂的组学分析领域，比如现在热门的蛋白质组学和代谢组学。对于蛋白质组学复杂样品，在同样的液相条件下，Impact HD不仅可以得到更多的蛋白质鉴定结果，而且最大限度的提高了谱图识别率，数据可靠性和重复性更高。此外，因为IDAS技术的应用，用户无需考虑样品浓度或液相条件，同一个质谱方法即适用所有样品和色谱条件，极大地提高了数据重复性、简化了用户操作并排除了人为干扰。布鲁克专业的Proteinscape软件平台整合了蛋白质定性、定量、修饰分析、定位和功能分析等相关功能，为用户提供了便捷的数据处理、存储、检索和报告平台。虽然现在各个类型的质谱都集中应用在组学领域，但Impact HD Q-TOF质谱仪在保证质量精度、分辨率和灵敏度的前提下，更快速、更稳定、更方便，因此更具竞争力。布鲁克· 道尔顿中国区生命科学部业务拓展经理卢嘉　　Instrument：布鲁克将有哪些推广计划，让用户对布鲁克质谱新产品有更多的了解?　　卢嘉：布鲁克的整合无疑会加大对市场推广的投入，在BCEIA后续几天，我们将在北京及大连化物所有多场关于组学的技术交流会。在前些天武汉举办的全国医疗设备展上，布鲁克也高调亮相推荐了快速微生物鉴定系统，后续我们将针对市场的热点不断将布鲁克具有技术优势的产品介绍给用户，相信用户会越来越多听到看到布鲁克的质谱产品。　　Instrument：请谈谈您对中国质谱仪器市场发展前景的看法?　　卢嘉：中国市场对于各仪器厂家来说无疑都是最具活力和潜力的，质谱尤其是高分辨质谱在国内还是有很广阔的前景，各厂家的竞争也日趋激烈。良性的竞争对于各厂家来说都是不断进步完善的动力，可以提供给用户性价比更好的产品，为用户提供更完善的服务，但是我们也注意到随着国家对于科研经费加大投入的同时，对一些大型仪器的审批论证趋于严格，有可能会影响到一些单台仪器金额较高的分析仪器。编辑：秦丽娟

质谱是一种被用于鉴别样品中各种化学成分的分析技术，同时也被用于样品中特定化学组分的定量。目前，质谱已成为分析实验室中研究化合物生物和化学性质的一种很常用技术，其中在生命科学领域，质谱主要用于蛋白质的测序和表征，如鉴定疾病中的关键蛋白并定量、改变表型及识别诊断标志物以便于治疗。　　得益于临床诊断的广泛应用，MALDI-TOF发展最快　　根据技术划分，目前的质谱技术包括气相色谱-质谱(GC-MS)、液相色谱-质谱(LC-MS)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)、三重四极杆液相色谱-质谱，四极杆飞行时间液相色谱-质谱、电感耦合等离子体质谱等。其中，MALDI-TOF是全球质谱市场中发展速度最快的细分市场，这主要得益于该技术在临床诊断领域中日益广泛的应用。　　使用频繁&成本降低，制药成为质谱最大应用领域　　按照应用划分，质谱的应用领域包括制药、环境监测、食品和饮料检测、生物技术、工业化学等。其中，制药行业是全球质谱市场中最大的应用市场，这是因为质谱在药物安全方面使用日益频繁，同时还降低了药物发现相关过程中的成本。　　北美市场规模最大，亚洲市场增速最快　　从地理区域角度来看，北美地区占据了全球质谱市场的主导地位，这是因为该地区的生物技术和生物医学领域的政府投资不断增加，而且蛋白质组学领域研发力度加大也推动了该地区质谱技术的发展，美国是该地区最大的质谱技术市场，加拿大其次。法国、德国、意大利、西班牙和英国占据了欧洲地区的主要市场份额。然而，亚洲市场在未来五年预计将成为全球质谱市场中增速最高的地区，因为很多企业在该地区设立生产工厂和研究中心，并且质谱制造商为促进质谱技术参与发起的展会日渐增多，这也为亚洲质谱市场的快速发展做出了贡献；日本、中国和印度预计将成为亚洲地区增长最快的质谱市场。　　剖析：全球质谱市场中驱动力、制约因素　　近来，全球质谱市场的主要驱动力包括生命科学研究领域的政府投入加大、医药行业的研发投入提升，同时人们对食品和饮料安全问题的日益关注也推动了全球质谱市场的增长。此外，质谱技术不断进步也刺激了终端用户的采用。　　然而，仪器的高成本成为了全球质谱市场增长的关键制约因素，同时质谱操作技术人员的缺失也妨碍了全球质谱市场的增速。　　主流制造商兼并整合成全球质谱市场发展趋势　　全球质谱市场中的主要参与者包括丹纳赫、安捷伦、沃特世、赛默飞、布鲁克、珀金埃尔默、岛津、日本电子、日本理学、Bio-Rad等，这些主流质谱制造商之间的兼并整合日渐频繁，这将成为全球质谱市场的主要发展趋势。编译：刘玉兰

使用一种基于质谱分析的技术探测肿瘤的代谢物，科研人员报告称，实时诊断可能有助于外科医生在手术室跟踪人类大脑肿瘤的范围。外科切除肿瘤常常需要诊断信息，目前是通过病理学家辛苦而耗费时间的活检显微检查获得的。　　Nathalie Agar及其同事使用一种称为电喷雾解吸电离质谱(DESI-MS)的技术，用最少的样本处理在手术室迅速执行，从而检测2-HG，这是一种见于IDH-1 和IDH-2基因突变的人类大脑肿瘤的代谢物，这两种基因为参与细胞生长和分化的酶编码。　　研究人员使用电喷雾解吸电离质谱(DESI-MS)在数分钟时间里区分了有IDH突变的人类大脑肿瘤样本和没有IDH突变的样本，而这种代谢物清晰地勾画出了肿瘤的范围，并且探测到了渗透的肿瘤细胞&mdash &mdash 这类能力被认为对于优化肿瘤切除和手术的结果具有关键意义。使用安装在美国波士顿的Brigham和女性医院的一间手术室的一台质谱仪，研究人员在手术期间测量了来自两名患星形细胞瘤的脑瘤病人的活检样本中的2-HG，他们提出这种方法可能用于实时诊断，并且有可能清除用其他方法可能会遗漏的肿瘤细胞。　　研究人员说，电喷雾解吸电离质谱(DESI-MS)仪器可能有助于描述肿瘤，比组织病理学检查更有效，它们可以安装在手术室中，成本只有用于间接神经外科导航的外科手术MRI机器的一小部分。　　原文检索：　　Sandro Santagata, Livia S. Eberlin, Isaiah Norton, David Calligaris, Daniel R. Feldman, Jennifer L. Ide,Xiaohui Liu, Joshua S. Wiley, Matthew L. Vestal, Shakti H. Ramkissoon, Daniel A. Orringer,Kristen K. Gill, Ian F. Dunn, Dora Dias-Santagata, Keith L. Ligon, Ferenc A. Jolesz,Alexandra J. Golby, R. Graham Cooks, and Nathalie Y. R. Agar. Intraoperative mass spectrometry mapping of an onco-metabolite to guide brain tumorsurgery. PNAS, June 30, 2014 doi:10.1073/pnas.1404724111

距离上一年度罗氏的半年报中公布了比较多的临床质谱方案细节后，又过去了半年时间，按其规划，2024年底将会在欧洲率先上市。　　随着上市时间的临近，按着新品上市的一般推进流程，罗氏公司也不断对外公布了一些最新细节，使得其质谱方案的神秘面纱也一层一层的逐渐揭开。　　在临床质谱火热之际，我们之所以如此关注罗氏公司的质谱项目，还是基于业界对罗氏公司全自动质谱方案的高度期望，尤其在科学仪器巨头赛默飞世尔(Thermo Fisher)公司全自动质谱一体机Cascadion项目以失败告终之后，我们更期待IVD巨头的解决方案。　　看从IVD企业的方向是否可以走通，彻底解决临床质谱自动化，推进临床质谱进入临床检测科室，完成临床质谱普及的最后一公里路。　　本文仅为分享临床质谱相关知识、探讨质谱自动化方案，以期质谱技术在临床端的进一步发展。质谱技术的普及，需要各级别企业的共同努力，有大象起舞，也有蚂蚁雄兵。文中内容仅为技术探讨，是对公开信息的进一步学习、推测和探讨，如有理解偏差、不准确的地方，请仅以罗氏公司未来官方资料及解释为准。我们敬重头部企业罗氏这么有创新的技术尝试且需保护相应的专属设计，也期待各家质谱相关公司凭借独立的创新精神取得各自的突破。　　上市计划进展　　简言之，如期推进!　　落地时间与之前公布的信息没有变化，侧面证明在欧美地区的注册工作顺利、项目的研发按期望进展。　　2024年1月9日，在第42届摩根大通医疗健康大会(JPM 2024)上，罗氏公司CFO Alan Hippe 以Entering the next growth cycle(进入下一个增长周期) 为题汇报了罗氏公司的一些主要进展，其中有两页提到了诊断部的质谱项目，确定其对未来增长的重要性，并再次提到其上市计划，2024年底CE欧盟区域落地，2025年预计美国FDA获批。　　2024年2月初发布的2023年财报中，在诊断部CEO Matt Sause的报告部分，也看到他把i601全自动质谱系统在2024年CE落地作为他的首条关键任务。　　　　我们还注意到，2023年5月，在意大利罗马举行的第25届国际临床化学与检验医学大会(IFCC WORLDLAB)暨第25届欧洲临床化学与检验医学大会(EUROMEDLAB)上，罗氏也将其质谱系统进行了揭幕，为欧洲市场的上市预热。　　关于中国的上市时间，按业内推测及罗氏新产品在中国上市的规划传统，预计在2026年争取拿到国内上市资质。　　值得提及的一件事情，在2023年12月国家卫健委临检中心第二届临床质谱的培训班上，很高兴的看到罗氏公司RA注册部相关人员也来学习质谱相关内容。　　质谱技术对于罗氏公司也是一项新技术、新方法，为了做好相关注册工作、确保注册进度，相关人员主动学习相关知识，值得认可肯定!　　设备整体结构　　从左到右依次为进出样单元(含STAT急诊端口)、加样及磁珠前处理部分、色谱质谱部分。总体的尺寸并没有相关资料公布，但参照图片里其他模块的尺寸(e801及进样模块尺寸)，按比例可大致估算，整体的设备长度约3.8米(含进样单元)。　　其中色谱质谱部分从图中可以看出比e801(含MSB样本缓冲区)尺寸略短一些，我们姑且按1.4米算。　　关于重量，我们也做个大概估算：考虑到色谱质谱部分有泵单元、分子涡轮泵、质量分析器等重量较大组件，整体重量应大于等于e801的730公斤，所以三者相加(190+730+730)整体重量应在1.7吨上下。　　设备的整体结构，可以理解为进样单元，加上e801系统(含MSB样本缓冲区、无ECL电化学发光的检测系统)，后面再加一个液相色谱及质谱分析仪部分。　　此系统的e801部分，负责样品的进出样，传输，样品的加入，试剂的加入，基于磁珠的前处理等的流程，最后转移至液相色谱部分，进行液质分析相关步骤。　　质谱试剂产线　　在公布了质谱系统的型号i601之后，质谱的试剂盒也有了它的名称：Ionify(已注册商标)，并形成Ionify® reagent line。很显然，这个词来自于离子的词根，这也正是质谱的工作原理，使物质离子化，测量待检物的质荷比M/Z。　　至此，我们又可以大胆的猜测i601质谱系统这个cobas i系列的命名起源，那就是也是源于Ion离子这个词，与其免疫系统的e来自Electro ChemiLuminescence (ECL) elecsys电化学发光系统、临床生化的c来自Clinical Chemistry形成家族化命名逻辑，共同组成cobas中心实验室的主力机型系列。　　试剂盒形式沿用cobas生化、免疫系统的cassettes式设计，即试剂多联包形式，从截图可看出也为3组分、尺寸与免疫e green package一致，这也使得其能兼容使用免疫系统e801的试剂处理单元，享用在线装卸载试剂功能。　　若如猜测与e pack green试剂盒大小一致且试剂仓一致，则单模块也可以放置48个试剂。　　我们可以对比下罗氏的质谱试剂与赛默飞世尔的Cascadion质谱系统的试剂，从临床使用角度，罗氏的即开即用、成分整合、可高度自动化的试剂更符合临床工作人员的喜好。　　样本前处理工作流程　　质谱检测与生化免疫等其他间接检测(检测器隔检测杯读值、非直接接触待检物)不同，其待检物质是被吞进检测单元的，是直接读取待检物M/Z质荷比的一种技术，无需标记物。　　但血清中的成分非常复杂，有大量的磷脂、蛋白等基质杂质成分，待检成分只是非常少的一些物质，所以质谱检测是需要进行样本纯化后才能进样的，尽可能纯的待检物质可降低基质干扰，提升检测的灵敏度和准确性。样本前处理工作由于步骤复杂，目前是临床质谱分析的一个难点和重点，也是各家临床质谱自动化方案主要需解决的关键步骤。在众多的前处理方法中，磁珠法(或称萃取磁珠法)是最有希望实现高通量、自动化、标准化的，国内也有很多公司在这个方向下取得了卓有成效的进展。　　这里我们看到罗氏采用的是磁珠法的方案，其过程简要整理如下:　　此部分用到的各类试剂应主要来自Ionify的试剂包部分，从图中可大致判断罗氏的磁珠方案为正向抓取待检物的模式，磁珠依靠binder正向结合、抓取待检物质，最后洗脱下待检物质与内标物，进行后续检测。　　这里稍微补充一句，磁珠法其实也能做除杂的方式，即沉降基质等成分，用上清部分作为为后续待检样品。　　色谱质谱部分　　前处理纯化后的样本转移到色谱部分，经过色谱柱，再到质谱检测器进行检测，得到信号。　　为了提高检测通量，罗氏方案中设计了8个色谱柱单元，柱子放在cartridge中，这是一种特殊盛放色谱柱的弹夹式结构的装置，它还具有RFID标签。　　此种设计与Cascadion的Quick Connect Cartridge有相似的设计理念，都是为了使其安装更换更加便捷，易于临床客户上手。　　我们在上一次解读中提及到其设计检测通量可达到100个样品/小时，有过质谱使用经验的都知道，若按传统的单线程标准过色谱柱模式，要实现此速度非常困难。　　罗氏采用了多线程模式，即有8根色谱柱可供样本通过，后面将顺序出锋而陆续进入质谱检测。　　为便于理解整个实验流程，附简易功能模块示意图。　　布局仅为推测，最终布局请以官方公布为准。　　还有个非常重要的细节我们从图中可以看出，8个色谱柱单元长短并不一样，其中5个短柱子，3个长(常规)柱子区域。　　从如此高的检测通量设计来推测，短柱子是做单项目(或小组合)测试的，这类柱子应与常规的色谱柱不同，是为这些快速检测项目而设计的，如激素类单项。　　在结果界面的截图中，我们看到睾酮的色谱图里，单个测试是36秒的检测时间(注：色谱质谱系统里，30秒处为保留时间或出峰时间)，按此检测模式恰好可以达到标称的100标本/小时(3600秒/36秒)的速度。　　而对于长柱子(相对于短柱子的称呼)，应该与传统色谱系统中的常规柱子更接近，预估是做一些联检类的项目，会有较长的检测时间来处理套餐类的项目组合。具体哪些是组合项目和色谱柱具体工作模式，还请大家静待罗氏公司的最终公布吧。　　在设备的下方，则应是流动相溶剂等液体耗材部分及质谱仪部分(右侧)。　　分析软件　　检测流程的最后一部分，将会对数据进行自动处理，软件应用复杂的算法对结果进行验证，然后传输至LIS系统。这相比于传统的质谱分析软件有很大的改善，减少了很多人为参与、调整、确认结果的过程。　　在软件界面我们可以看到峰型整合和结果验证的细节，如这个睾酮结果的界面中，分别显示了内标物与待检物质的响应值与峰型情况，依靠峰面积得出待检物的浓度。　　在这个过程中，将自动完成待检物质与内标物的峰型质量检查、质谱仪与色谱仪的状态确认、整合与定标质量的确认、结果确认。　　项目菜单　　检测菜单也是质谱项目是否能成功的重要因素，罗氏公司一直以规划检测项目见长，这次在项目规划上也进行了大量的前期调研和顾问工作。　　按规划i601将有一个超过60多个项目、全面的试剂套餐组合，分两批上市。　　项目大类为以下5类：类固醇类激素类、维生素D类、TDM药物浓度检测、免疫抑制剂药物检测、滥用药物类检测。　　未来质谱模块的灵活配置　　模块化的设计一直是罗氏诊断产品的特点，从最早的Modular时代开始，到cobas 6000/8000。　　作为cobas Pro的一个模块，罗氏的质谱方案同样拥有灵活的配置形式，在以下图片中我们可以看到i601可以进行双模块的拼接，以便进一步的扩展检测通量和项目数。　　当然，还有几种与cobas Pro里其他模块的联机，与免疫模块e801的连接、与生化模块c503的连接，及与生化、免疫混合模块的连接 同样在今年落地的高速生化分析模块c703作为cobas Pro方案里的一员，未来也应可以参与到质谱模块的灵活配置中。　　但请注意，在官网的标注中，明确的告知：在上市初期，将仅以单模块形式提供，所有其他的包括生化、免疫的配置将会在随后的日期提供。　　一个有意思的探讨: 一套i601质谱系统算几个模块?　　我的猜测是算2个，那么一个线体分支就最多可连接2个i601(4个模块)，为什么?　　视频里的2个i601联机展示图可作为依据吗? 不是仅仅从这里。　　我的考量如下：通量的需求、设备长度、系统的复杂度、人员动线、通讯的限制、标本周转时间等等。　　但需要进一步的官方消息确认，仅作猜测探讨。　　补充知识：罗氏的多模块联机方案中，cobas 8000及Pro系列的模块连接数量，最多可扩展至4个。　　我们再看一下罗氏公司的一个整体规划图，这是一套CCM2.0的流水线系统，颇为壮观，从图中可以看出P系列前处理+后处理、日立的轨道系统与生化、免疫、质谱、分子、尿机、血球、凝血组成的强大多学科布局，i601质谱系统作为一个新学科模块，占据着极为重要的战略意义位置。　　写在最后　　近些年，临床质谱一直是热门赛道，资本方、客户端、企业端，一直期待这一技术在精准医学中大展拳脚，但其发展速度一直不如预期，这里面有很多的因素限制。　　我们非常期待有更多的企业在解决诸多困难中取得实质性突破，带我们进入临床质谱的新维度、新时代。　　如罗氏官网中质谱项目的标题：Are you ready to enter a new dimension in mass spectrometry?　　你准备好进入质谱分析的新维度了吗?　　作为相关从业者中的一员，也意识到，临床质谱的普及除了产品维度外，还需要更多的质谱相关知识的推广，让大家理解这一检测利器，最终懂它、用它，真正发挥其作用。　　希望今天的分享能起到一点点的作用。作者：IVD崔哥

2023年3月11日，2022-2023中国国际临床质谱暨分子诊断高峰论坛于上海星河湾酒店圆满落幕。本次大会由临床质谱网和分子诊断网共同主办，聚焦于质谱和分子诊断等前沿创新检验技术领域，国内外各大医院、高校及企业界的知名专家、教授、学者及行业管理者皆聚于此，围绕相关技术临床应用、行业标准、人才培养、产业融合等议题展开深入探讨和互动交流，共同推动行业健康有序发展。近年来，临床质谱凭借高特异性、高灵敏度、多指标检测等优势，逐渐展露成为精准医疗领域下的黄金赛道之一。仪真分析积极响应，携荷兰Spark UHPLC超高压液相色谱系统出席本次会议。 展会现场，仪真分析专业团队为与会嘉宾展示产品，介绍答疑，提供业务咨询服务。 为助力临床质谱的快速发展，仪真分析还可为质谱前端提供下列自动化方案和OEM服务。

阐明小分子（包括内源性代谢物和外源性化合物）如何发挥调控作用的关键问题之一是小分子的靶标发现和验证，即蛋白质-小分子相互作用研究。蛋白质与小分子的相互作用模式既有较稳定的共价结合，也有瞬时的弱相互作用。如何灵敏、高效地捕获并解析多种类型的蛋白质-小分子相互作用是分析难点。目前，蛋白质-小分子相互作用的分析策略大致可分为两类：一是靶向相互作用研究，以蛋白质（或小分子）为中心，发现并验证与之相互作用的小分子（或蛋白质）；二是非靶向相互作用研究，全面识别多种蛋白质-小分子的相互作用轮廓。应用的具有分析技术包括：表面等离子体共振技术（surface plasmon resonance，SPR）、氢氘交换质谱分析技术（hydrogen deuterium exchange mass spectrometry，HDX MS）、限制性蛋白水解-质谱分析技术（limited proteolysis-mass spectrometry，LiP-MS）、蛋白质热迁移分析技术（cellular thermal shift assay，CESTA）和药物亲和反应靶标稳定性分析技术（Drug affinity responsive target stability，DARTS）等。本期介绍限制性蛋白水解-质谱分析技术（LiP-MS）的原理、技术流程和其在蛋白质-小分子相互作用研究中的应用。1. 原理LiP-MS技术最初由瑞士苏黎世联邦理工学院的Paola Picotti课题组建立 [1] ：利用小分子结合蛋白后相较于原蛋白产生蛋白质空间构象和位阻的变化，经蛋白酶切后形成差异肽段，液质联用分析识别和鉴定差异肽段，基于差异肽段推测蛋白质与小分子的相互作用位点。2. 技术流程在非变性条件下提取蛋白，以保留蛋白活性和空间结构。先使用低浓度（1:100, w/w）蛋白酶K在较低温度（25℃）下短时间内（5 min）对蛋白-小分子复合物进行有限的蛋白酶切。蛋白与小分子结合后，相互作用位点存在空间位阻，从而避免被蛋白酶K切割，由此产生差异肽段。随后进行蛋白变性和胰酶酶切，蛋白质组分析识别和鉴定差异肽段，基于差异肽段所处位置预测蛋白质与小分子的相互作用位点（图1）。图1 限制性蛋白水解-质谱分析（LiP-MS）技术流程 [2]3. 试验试剂和分析仪器3.1 蛋白抽提：可依据实际目的和细胞类型选择不同的细胞/组织裂解液，如RIPA、N-PER、M-PER等，进行细胞/组织蛋白抽提，获得的细胞/组织全蛋白提取物可直接与目标小分子共孵育。3.2 蛋白酶切：关键的蛋白酶切试剂，例如蛋白酶K、胰酶等均有市售。3.3 分析仪器：目前多种类型的液相色谱-高分辨质谱联用仪均可用于蛋白质组学分析，已应用于LiP-MS的高分辨质谱仪包括，布鲁克、赛默飞、沃特世和SCIEX等品牌的飞行时间质谱、轨道阱质谱和傅里叶变换离子回旋共振质谱等。4. 应用实例研究人员基于LiP-MS技术在大肠杆菌中探索多种内源性代谢物和蛋白的相互作用模式 [1]，先采用凝胶过滤法除去大肠杆菌全蛋白提取物中的内源性代谢物，获得大肠杆菌全蛋白；随后将大肠杆菌蛋白与20个中心碳代谢相关的关键内源性代谢物（三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、6-磷酸葡萄糖、果糖-1,6-二磷酸、丙酮酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸等，见图2A）分别共孵育。基于LiP-MS流程发现，上述20个内源性代谢物可与大肠杆菌中1678个蛋白发生潜在相互作用，其中1447个相互作用是首次发现的（图2B）。作者将所发现的相互作用与在线数据库BRENDA对比（主要涉及酶的功能和代谢通路等信息），证明LiP-MS技术能够准确地识别已报道的蛋白-内源性代谢物相互作用，假阳性率低于6 %。图2 20个与中心碳代谢相关的关键内源性代谢物（图A）及其在大肠杆菌中发生相互作用的蛋白数量（图B）[1]参考文献：[1] Piazza, I., Kochanowski, K., Cappelletti, V., Fuhrer, T., Noor, E., Sauer, U., Picotti, P. A map of protein-metabolite interactions reveals principles of chemical communication. Cell, 2018, 172(1-2), 358-372.[2] Pepelnjak M, Souza N D, Picotti P. Detecting Protein–Small Molecule Interactions Using Limited Proteolysis–Mass Spectrometry (LiP-MS). Trends in Biochemical Sciences, 2020, 45(10), 919-920.

p style="text-align: justify text-indent: 2em "随着改变生命的治疗方法的出现，生物制药的未来前景广阔，2018 年的诺贝尔奖更是授予了免疫检查点疗法，基于这一疗法的 PD-1 正在拯救更多癌症病人的生命，推动这些新型生物治疗药物安全地应用于临床需要可靠的生产和质量控制过程。生物治疗药物复杂的异质性需要借助准确而稳定的分析检测方法进行分析，并需要可靠的色谱分离。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/6d173e0c-2823-4042-81c7-8cb61da8ed57.jpg" title="1.jpg" alt="1.jpg" width="442" height="312" style="width: 442px height: 312px "//pp style="text-align: justify text-indent: 2em "鉴定关键质量属性(CQA) 是实施质量源于设计 (QbD) 原则以开发和生产生物药物的过程中最困难的一步。定义各种产品属性极具挑战性，因此，产品质量的一致性变得更加重要。滴度测定、糖链分析、电荷异构体分析、氨基酸和培养基分析、肽谱分析、聚集体分析、完整蛋白和亚基分析都是关键质量属性重要的技术，然而想要成功地获取最佳的实验结果，需要操作者能切中要害，找到关键之处，让我们也一起来“划重点”说一下这些技术的难点以及关键所在。/pp style="text-align: center text-indent: 0em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong滴度测定/strong/span/pp/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "技术应用/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "滴度测定是对于单克隆抗体，最有效的滴度测定方法之一是亲和色谱法。选择 Protein A 或Protein G 色谱柱时，首先要考虑的是待纯化或分析的目标蛋白质，再选择合适的流动相和样品方法。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "实验痛点/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "您可能并没有注意到洗脱液对基线噪音以及色谱柱寿命的影响，也并不清楚如何最大程度延长这些“有生命”的色谱柱寿命，然而这正是容易被您忽视的关键所在。/pp style="text-align: center text-indent: 0em "strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "快速有效的糖链分析/span/strong/pp/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "技术应用/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "翻译后修饰( PTM )可能形成许多不同类型的异构体。糖基化尤其高度可变，而糖基化对于许多蛋白质的功效具有重大影响。FDA 认为这是一项重大挑战，并就如何确定糖指纹谱提供了指导。br//pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "实验痛点/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "如何获取难分离糖链结构的最佳分离度？为此具体的方法条件都包含什么？例如，A 柱和 B 柱的选择？仪器的选用？柱温、流动相、 FLD、进样量等应如何选择和设置？不仅如此，如何能够快速的获取有效的实验结果是整个方法优化的痛点所在。/pp style="text-align: center text-indent: 0em "strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "电荷异构体分析/span/strong/pp/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "技术应用/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "离子交换色谱可以分离一些电荷异构体，特别是那些位于蛋白质表面（而不是隐藏在结构内）的电荷异构体。由于大多数蛋白质所含的碱性氨基酸多于酸性氨基酸，因此大多数电荷异构体分离需要采用阳离子交换。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "实验痛点/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "从离子交换 ( IEX ) 色谱的使用、色谱柱选择，流动相的重要注意事项、到IEX 的一般使用经验规则都是电荷异构体分析能否成功的关键，不仅如此，在操作中还有若干仪器注意事项，所以此项分析需要注意的关键点会非常多，需要操作者根据电荷异构体的不同情况，具体问题具体分析。/pp style="text-align: center text-indent: 0em "strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "氨基酸和培养基分析/span/strong/pp/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "技术应用/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "氨基酸和培养基分析主要用于确定蛋白质的氨基酸组成与其他技术一起使用以确认正确的结构。氨基酸也是用于制备重组蛋白质的细胞培养基中的关键成分。氨基酸本身属于两性离子，并具有各种侧链，它们还缺少合适的UV 发色团，使得分离和检测氨基酸非常具有挑战性。br//pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "实验痛点/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "如何实现所有常见氨基酸的基线分离并确保符合欧洲药典的系统适用性，这是非常挑战实验员操作水平的。/pp style="text-align: center text-indent: 0em "strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "肽谱分析/span/strong/pp/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "技术应用/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "肽谱分析是一项强大的技术，可用于全面鉴定蛋白质的一级结构，还能够区分蛋白质内异构基团的精确位置。使用这种方法，蛋白质将被分解成单独的片段，然后将这些物质分离成经典的“指纹”色谱图。将分离与质谱检测相结合，能够将肽谱分析色谱图中观察到的实际的峰与分析软件预测的预期片段相关联。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "实验痛点/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "要成功生成肽谱，需仔细检查完整的表征策略。其中样品前处理对于成功的肽谱分析至关重要，这可能是一个耗时的过程，可能需要针对待酶解的各种蛋白质优化多个步骤。然而打好基础熟练掌握肽谱分析流程的基本技术才是成功的第一步，此外，进行肽谱分离优化时需要注意诸如覆盖率等事项，才能尽可能获得最佳结果。/pp style="text-align: center text-indent: 0em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong聚集体分析/strong/span/pp/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "技术应用/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "体积排阻色谱是特别适合从高阶聚集体中分离单体峰的技术之一。随着技术发展，人们将目光投向了除单克隆抗体以外的蛋白质药物。抗体药物偶联物等更为复杂分子的聚集体表征可能更具挑战性，因为疏水性细胞毒性药物的存在可能导致许多体积排阻色谱柱无法发挥理想性能。使用可显著降低次级相互作用风险的新型固定相，将非常适合聚合物的快速分离和定量。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "实验痛点/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "聚集体分析中，如何确保稳定可靠运行SEC分析，使用何种条件才能确保分析过程中蛋白质稳定，以及怎样维护这一易耗品，是该分析获取有效实验结果的关键。/pp style="text-align: center text-indent: 0em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong完整蛋白和亚基分析/strong/span/pp/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "技术应用/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "完整蛋白和亚基分析可以用来比较生物仿制药与原研药。在反相条件下，分子很可能发生变性。样品保留在色谱柱上得到浓缩，且适用于质谱分析。因此，该技术适用于测定完整蛋白和亚基分析的精确质量数。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "实验痛点/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "如何考虑选择完整蛋白和亚基分析色谱柱的多个相互关联因素：样品分子量和最适合的填料孔径，色谱柱固定相，流动相条件，以及速度或通量要求等。这些都是完整蛋白和亚基分析的关键。/p

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Microfluidic Platform for Time-Resolved Characterization of Protein Higher-Order Structures and Dynamics Using Top-Down Mass Spectrometry [1]，文章的通讯作者是北京大学生物医学前沿创新中心的王冠博教授和中国科学院深圳先进技术研究院的门涌帆副研究员。　　蛋白质的高阶结构和动力学特性对理解蛋白质的生物学功能和揭示其潜在机制至关重要。自顶向下质谱法(Top-down MS)在完整蛋白水平和肽段碎片水平都能获得结构信息。非变性Top-down MS可以分析蛋白质复合体的结构以及完成亚基鉴定和修饰分析。自顶向下氢/氘交换质谱(Top-down HDX MS)为构象或结合界面分析提供了高空间分辨率，并实现了构象特异性表征。微流控芯片可以为这些质谱工作流程的前端反应提供优越的平台。然而，目前大多数质谱微芯片装置是为Bottom-up或Top-down蛋白质组学设计的。本文中，作者提出了一种用于蛋白质高阶结构和动态Top-down MS分析的芯片设计策略。它适用于时间分辨的非变性质谱和HDX质谱，该设计旨在有效电离完整的蛋白质复合物，灵活控制多种反应物流动，并在较大的流速范围内精确控制反应时间在亚微升/分钟。本文通过对单克隆抗体、抗体-抗原复合物和共存蛋白构象等体系的分析来验证该装置的性能。　　TDK-MS(Top-down and kinetic MS)芯片的结构如图1A所示，该方法可以有效电离完整的蛋白质，包括单克隆抗体(mAb)和抗体-抗原复合物(图1 B, C)。　　图1. 完整蛋白质和蛋白质复合体在非变性条件下的高效电离　　虽然分析蛋白质组合化学计量学和监测构象变化需要保持蛋白质高阶结构和非共价相互作用的完整性，然而为了推导结构信息或在串联MS中展开蛋白质以提高碎裂效率，往往需要不同程度的变性来产生亚复合体，因此变性剂的浓度和变性的时间对变性程度至关重要。本文中，作者采用交错人字微结构(Herringbone microstructure, HM)(图2A, B)，并对其性能进行了评估(图2C−E)。如此高的混合效率为进一步微型化芯片混合模块提供了可能。在监测Mb的变性时，作者使用TDK-MS芯片和商用混合三通管平行混合holo-Mb溶液(5 μM)与乙腈(ACN)，并比较它们在混合比例变化时的响应(图2F)。TDK-MS芯片在非变性和变性条件之间切换的快速响应通过NIST mAb的变性得到了证明，在向NIST mAb溶液中添加甲酸后，响应时间小于5分钟(图2G)。　　图2. 高效混合和快速响应的流体控制　　微芯片的灵活通道设计允许引入独立控制的溶液。例如，尽管酸和有机溶剂都能诱导变性，但这两种变性剂同时存在时，对变性途径的影响是不同的。Mb和Hb是血红素蛋白，其中血红素基团分别非共价连接在1条多肽链和4条非共价组装链上，因此这是研究共存复合体解离动力学和亚基构象变化的理想模型。将5 μM holo蛋白溶液与ACN和FA按一定的混合比例依次混合，可以通过解离产物的出现和蛋白质离子电荷态分布的变化来表征复杂的解离和蛋白质的展开。在固定ACN浓度下，随着FA浓度从0.01增加到0.3% (v/v)，依次观察到的主要现象是血红素丢失、apo-Mb展开以及折叠的holo-Mb转化为展开的apo-Mb(图3A)。相比之下，在FA浓度恒定的情况下，当ACN从1增加到50%时，Mb主要表现为血红素损失，只有中等程度的apo-Mb展开，这可能是由于展开的部分迅速聚集(图3B)。　　图3. (A)增加FA浓度，固定ACN浓度和(B)增加ACN浓度，固定FA浓度时获得的Mb和Hb的质谱图。　　在HDX MS检测中，TDK-MS芯片提供了快速和有效的氘代及淬灭，精确控制HDX反应时间，并在2H-标记形式下高效电离完整蛋白质(图4)。　　图4. 2H标记完整的(A)Mb、(B)Hb α亚基和(C)Hb β亚基在不同反应时间下的HDX质谱图　　由于过大的流速不利于电离效率，并且有可能会增加堵塞或流动中断的风险，因此流速应保持在最佳范围内，这又限制了混合通道中HDX时间的可调节范围，从而影响了HDX动力学分析的灵活性。为了解决这一问题，作者设计了一个具有多个不同长度反应通道的混合模块，在不更换芯片的情况下，除了改变流速外，还可以通过通道切换在更大范围内调整反应时间。在原型芯片中，5个不同长度的通道可以在对蛋白质电离和流动稳定性都最优的流速下，产生从几秒到几分钟不等有效的HDX时间(图5)。　　图5. Top-Down HDX MS 分析　　本文中作者开发的策略将有利于生物大分子结构的精细分析，并有助于质谱微芯片的方法开发。