荧光微孔板检测

实施荧光检测是提高检测质量和灵敏度的一个快捷有效的途径。实现荧光检测最优化要求光学系统同时具有灵敏度和灵活性。以使用发射光束能横跨整个波长光谱的荧光染料为前提，高性能的光电倍增管 (PMT) 可以帮助您进行多重分析检测，给您清晰分离的信号和绝对的检测灵敏度。 细胞荧光检测增加了其他复杂因素：分析微孔底面分布不均匀的贴壁细胞极具挑战性，以及如何最大限度地减少培养基的自体荧光。Tecan Spark微孔板多功能酶标仪，采用荧光Fusion Optics™ 技术，能够应对这些挑战并提供您在设计及运行高等生物化学检测及基于细胞的荧光检测所需要的所有技术支持。 Tecan Spark多功能酶标仪，准确、灵敏地测定细胞荧光。使用灵活的Fusion Optics技术，发展高灵敏度的荧光检测方案 Spark独特的Fusion Optics功能为您的检测方案的提供了灵活且灵敏的开发平台。利用Fusion Optics技术, 您可以在同一检测试验中按需组合使用滤光片和光栅。这是相对于全功能酶标仪性能上的重大飞跃。 滤光片选择的灵活性既能够使激发端的光束输入最大化，也能使发射端信号检测效果最大化，而光栅能通过扫描以确定最优化设置的波长。用户选用的深阻二向色镜能提高波长谱末端常见染料的灵敏度。大功率氙闪灯减少了得到可靠灵敏的结果所需的闪光次数，因此您不必在灵敏度和速度间犹豫不决。结合应用了SparkControl软件后，系统可以通过自动调节扩大动态范围，避免荧光检测进入饱和状态。 使用光栅/光栅系统（浅绿）和光栅/滤光片系统（深绿）来扫描激发和发射波长的最大值。第二种组合系统能识别出更鲜明且灵敏的最大值。细胞检测时聚焦于微孔底面进行酶标可以使背景的自发荧光最小化 在细胞荧光分析中，使用传统的微孔底面酶标技术会降低检测的灵敏度，因为光束在到达样品之前必须要先穿过塑料或者玻璃板。这就降低了可以激活荧光的光束的量。Tecan Spark酶标仪能为您提供高性能的微孔底面酶标模块，以解决上述问题。Tecan Spark酶标仪拥有基于透镜的底面酶标系统，结合能将光束引导到样本焦点的Z-focus程序, 能提供极高的灵敏度。优化的酶标功能通过多次测量排列在微孔中的分离的样本点，可以使细胞分布不均导致的差异最小化。 基于细胞的检测所得的安全可靠的结果 为了可以得到可以在不同实验，不同微孔间比较的细胞检测结果，您需要特别注意细胞数量、细胞分布和细胞的健康状况。Tecan Spark酶标仪运用明视场及免标记技术、激光自动对焦技术，使您能够检查这些自动检测参数。细胞图像和细胞汇合度可以进行自动测量。使用SparkControl的实况查看器, 您可以使用Snapshot功能，记录开始实验之前的最后一个图像。 Tecan Spark酶标仪的细胞孵化功能如温度控制、气体控制和湿度控制允许细胞在酶标仪中孵育几天的时间。Tecan Spark酶标仪的自动开盖和进样器功能，以及可以进行有条件动力学编程，使检测的完成实现了智能自动化。例如，正常生长控制条件下细胞可以在酶标仪中生长；达到预定的细胞汇合度之后，酶标仪可在微孔中加入某种物质，激发GFP的产生。这是额外的荧光动力学监测功能, 在运行的同时监测图像以控制细胞的生长。总结Tecan Spark多功能酶标仪，以它独特的Fusion Optics技术，能在荧光检测领域带给而我们绝佳的性能体验。在同一检测中，滤光片和光栅的组合带给我们前所未有的灵活度，却丝毫没有影响其准确性。 环境控制特征、 成像能力及其动力学条件，使您的细胞检测实验得以自动化和标准化，且具有极高的重复性。结合了特殊的酶标功能，如基于透镜的底面酶标系统、自动化的z-focus以及优化的酶标功能，Tecan Spark是研究细胞和荧光时最理想的多功能酶标仪。

2020年注定是不平凡的一年，而在每个平凡工作岗位上的我们，总希望能在这个特殊的时期做点什么，哪怕微小的贡献，汇集在一起，一定会成为改变的推动力。所以，小编梳理了一下在抗病毒药物、疫苗研发生产等相关领域的工作中，我们的微孔板检测及成像设备能够开展的实验和项目，希望能够对在攻坚岗位上奋斗的老师们有所帮助。病毒，可以是恶魔，也可以是工具我们都知道，病毒（virus)由一种核酸分子（dna或rna）与蛋白质（protein）构成或仅由蛋白质构成（如朊病毒）的有机形态，它介于生命与非生命之间，超然在五界之外（传统的五界分类法）。这样一种看起来无比“简单而低级”的东西，却在人类历史上留下持续至今挥之不去的阴影，比如ebola，比如hiv，比如，现在全国上下一心对抗的新冠病毒。但是，拥有高级智慧的人类，怎会轻易被这些简单而低级的玩意儿打败？所以，我们有了疫苗，有了抗病毒药物，聪明的人类还利用病毒感染宿主细胞进行自我复制的机制，把恶魔变成工具，应用到人类的生产生活中，比如通过病毒进行花卉育种，利用病毒作为载体进行生物研究、基因治疗等等。所以今天，我们首先分享一些围绕抗病毒药物研发、疫苗生产等相关领域，微孔板检测和成像设备的应用方向，后续我们会为大家继续分享微孔板相关设备在如何“利用”病毒开展生物研究工作。病毒的数量与感染性测定病毒感染哺乳动物细胞后，除了通过rt-pcr的方法，可以通过细胞病变效应、红细胞吸附和免疫标记检查法等评价病毒在细胞中的增殖情况。细胞病变效应（cytopathic effect, cpe），是指病毒在敏感细胞内增殖引起的光镜下可见的细胞病理改变。大多数动物病毒感染敏感细胞培养都能引起其显微表现改变，例如细胞聚集成团肿大圆缩脱落及细胞融合成为多核细胞，细胞内出现包涵体（inclusion body），乃至细胞裂解等，正是因为cpe的表现，我们可以在体外细胞水平评价病毒感染宿主细胞的情况。病毒毒价测定是病毒学相关研究中最基本的技术手段，无论疫苗研发、抗病毒药物评估或者是病毒重组载体构建，均需要在不同环节评定病毒毒价，而目前主要方法包括蚀斑实验、tcid50测定和免疫染色法等。病毒蚀斑实验病毒蚀斑是一种检查和准确滴定病毒感染性的方法。方法：将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中。病毒吸附后，再覆盖一层融化的半固体营养琼脂，使病毒在单层细胞培养中有限扩散。结果是每一个有感染性的病毒在单层细胞中可产生一个局限性的感染灶。用活性染料 (如中性红) 染色，则活细胞着色，受病毒感染而破坏的细胞不着色，形成肉眼可见的蚀斑(plaque)。每个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒形成的，称作蚀斑形成单位 (plaque forming unit,pfu)。通常以每毫升病毒液的空斑形成单位既 pfu/ml表示。上图来自武汉大学基础医学院，病毒感染6孔板细胞后形成空斑病灶，使用中性红染色后，通过cytation的4x物镜明场模式对全孔进行拼接成像，软件分析识别孔中的空斑病灶个数。tcid50法tcid50法是测定病毒能使50%的组织培养细胞发生感染的最小量。方法：一般是将病毒悬液作10倍的系列稀释，分别接种细胞，经一定时间后观察cpe、血细胞吸附等指标，以最高稀释度能感染50%细胞的量为终点。最后用统计方法（reed muench法）计算出50%组织细胞感染量（ 50%tissue culture infectious dose,tcid50)。免疫染色法空斑实验法或常规tcid50测定滴度依赖于病毒在感染细胞中的复制以及感染周边细胞形成局灶型病变；而免疫染色法只需要病毒感染靶细胞并表达病毒所编码的蛋白。因此，免疫染色法（infectious units per ml, or ifu/ml）测定病毒滴度需要的时间比空斑法（pfu/ml）更短。其中，免疫染色法包括hrp组化或免疫荧光染色等。同样类型方法也适用于表达荧光报告基因的重组病毒的毒价测定。例如，以针对杆状病毒囊膜蛋白gp64的单克隆抗体标记被病毒感染的细胞，然后以hrp-标记的二抗与感染细胞进行染色。通过底物显色，在光学显微镜下计数感染斑点的数量，经过稀释倍数的换算，即可得出病毒的滴度（ifu/ml）。输问题：无论是plaque assays还是tcid50，均涉及较多微孔的细胞计数或阴/阳性孔判断，常规的显微镜观测法，操作不便且对研究者伤害较大。因此biotek为大家提供了更加自动化的解决方法：通过cytation/lionheartfx自动化成像设备进行cpe或者plaque的成像及计数。上图：cytation5自动化成像系统支持明场、彩色明场、荧光场等模式自动化成像检测，并且可选择大视野成像模式，4倍镜一个视野可覆盖384孔板整孔，提高全孔、整板成像的检测速度。上图：两种病毒感染细胞后，通过红色/绿色荧光探针标记的抗体进行免疫荧光染色，采用cytation双荧光通道自动成像，并对病毒感染的细胞病灶进行识别成像。上图：对24孔板进行自动成像，并且定量分析每孔内的病灶个数。无论是cytation系列还是lionheart系列，均能对6-384孔板进行多通道整孔成像，极大减少了人工识别cpe及plaque的工作。疫苗研发生产中的应用疫苗效力评价最有效的方法是中和抗体水平检测及中和抗体活力评价。普通病毒疫苗效果的评价，可以通过收集减毒或灭活病毒疫苗免疫后人或动物血清，与自然源性病毒进行中和抑制试验，以检测中和抗体效价及中和抗体活力。中和抗体的原理是抗体与相应的病毒粒子特异性结合，使病毒丧失感染细胞的能力，一般采用的是固定病毒—稀释血清法。固定病毒—稀释血清法将不同稀释度的血清与固定量的病毒（200tcid50、eid50或ld50）混合，一般37°条件下感作一定时间以后（通常为1h），再将血清-病毒混合物接种于敏感细胞、鸡胚或实验动物，每一稀释度接种3～6只（个、管）试验动物(或鸡胚、细胞)，记录每组样品的动物死亡数、累积死亡数和累积存活数，按此前提到的reed-muench法或karber法计算其半数保护量（pd50），即该血清的50%中和效价(pd50)。可见，对于抗病毒疫苗中和抗体的测定方法中，最终的检测指标也可以用cpe计数、或荧光标记的病毒灶来评估，而完整的中和抗体检测需要测定大量的细胞样本，通常要对整板96孔板的整孔进行观测。这样的应用中，biotek能够建立标准化的实验方案流程，样品的拍摄、病灶的分析计数到结果的输出可以自动完成：上图：cytation对96孔板内的荧光标记的病毒灶进行全孔、整板成像。上图：通过图像分析评价不同浓度的免疫血清抑制病毒感染细胞的能力，pos表示该孔内有病毒病灶形成，neo表示改孔无病灶。根据此结果，后续可计算pd50。抗病毒药物筛选相关应用针对不同种类的病毒，科学家们的前期工作已经积累了较多的筛选策略，比如，对于目前来势汹汹的冠状病毒，在抗击sars及mers的经验中对于此类cov新药的主要靶点可以围绕cov表面结构的棘突糖蛋白、靶向宿主受体的单克隆抗体、进入途径有关的宿主蛋白酶抑制剂、以cov复制结构基因为靶点的sirnas等（zumla a, nature reviews drug discovery, 2016, 15(5): 327.。对于hiv等逆转录病毒，研发策略可倾向于受体拮抗剂、整合酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂这些方向；对于hcv病毒可采用rna复制酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等（nature reviews drug discovery 6, 1001-1018）。基于微孔板的高通量及高内涵筛选平台为以上策略提供了灵活的解决方案，比如下面这篇文章，可以为大家提供一些基于微孔板筛选抗病毒药物的思路，文中选择的靶点是ns3解旋酶，hcv解旋酶是一种蛋白酶，位于病毒多功能非结构蛋白3 (ns3)的c端三分之二。因此，抑制解旋酶可作为抗生素或抗病毒药物。构建hcv ns3h（ns3 lacking the protease domain），使用dna寡核苷酸序列代替rna序列，通过fp、htrf和alphascreen筛选能够抑制ns3-dna复合体形成的化合物。这是一种比较新颖的思路，采用抑制dna复合物的方法来筛选hcv解旋酶抑制剂。所用的化合物库来自sigma’s library of pharmacologically active compounds (lopac)。上图展示了基于荧光偏振的筛选思路以及得到的4个候选化合物剂量效应曲线。文章展示了使用多功能微孔板检测设备在筛选hcv抗病毒药物的有效性，并且表明其采用的这三种方法均是较为成熟的商品化方案，篇幅所限，感兴趣的老师可以在原文中阅读其他方法的筛选结果和思路。biotek为大家提供的synergyneo2是顶尖的微孔板药物筛选平台，能够快速高效的实现以上的荧光分子互作的筛选技术平台。上图：synergyneo2高通量微孔板检测仪能够提供高速、高效的trf、fp、htrf、alphascreen技术检测平台。除了采用分子互作技术针对性的开展基于靶点的筛选，也可以采用基于表型的方法，例如cpe病灶改变、细胞活力等进行快速化合物筛选，这里就不一一赘述了。病毒的临床诊断病毒临床诊断方面的应用主要集中在免疫学检测，通过测定患者血液样本中的病毒抗体或表面抗原的含量判断是否存在病毒感染。比如hbv表面抗原（hbsag）是病毒外膜的主要组成蛋白，一直是hbv感染最重要的血清学检测指标，也是最直接的病原学证据之一。目前针对hbv, hcv, hiv等多种病毒均有临床可用的商品化解决方案，除了常见的吸收光elisa测定，也有诸多试剂开发团队研发了灵敏度更高，检测更为便捷的时间分辨荧光免疫检测法，即trfia技术。输值得一提的是，当下新冠状病毒2019-ncov的临床诊断虽然主要依赖核酸检测，但是由于核酸检测的取样位置、患者的免疫状态等原因，单纯依靠荧光定量pcr的核酸检测有一定的局限性。目前，已经有试剂公司开发出针对新冠状病毒的igm和igg抗体检测elisa试剂盒，能够为临床提供血清学诊断辅助证据，可联合核酸检测方法进行使用。biotek的synergyh1多功能微孔板检测仪拥有中华人民共和国医疗器械注册证，能够为一线临床诊断岗位的医疗工作者提供精准的基于吸收光、荧光、发光、时间分辨荧光及荧光偏振的免疫检测结果。上图：synergyh1多功能微孔板检测仪，能够支持elisa、trfia、lia等多种模式的免疫检测。在这场人类和病毒旷日持久的战“疫”中，相信会有越来越多的检测手段迅速发现病毒，也会有更新的，更具针对性的药物和治疗方案也会相继出现，我们能做的，就是坚守好自己的岗位，持续为大家提供坚实的硬件和技术保障。心系武汉湖北加油!

——高度直观的软件结合内置安全性和智能性，实现卓越性能2015年3月19日，上海——Thermo Scientific Varioskan LUX 多功能微孔板读数仪配备全新 Thermo Scientific SkanIt 软件，旨在简化数据采集和分析流程并提高检测结果的一致性和可靠性。 赛默飞样品制备与分析业务总监 Hanna Grano-Fabritius 谈道，“这款Varioskan LUX 安装有 SkanIt 软件，是我们在微孔板分析仪技术领域长久以来实行开拓性技术创新而得到的又一新产品。依靠集成化智能控制技术和自动化动态范围选择等先进技术，Varioskan LUX 的设计目的便是简化设置，同时保持最佳性能，实现卓越的可用性和数据可靠性。” 在华盛顿特区的华盛顿会议中心举办的 SLAS 2015 第 4 届实验室自动化与筛选协会大会暨展览会上，配备 SkanIt 软件的 Thermo Scientific Varioskan LUX 正式首次亮相。 Varioskan LUX 配备有智能安全控件，可以帮助确保研究稳步前进。这些技术包括自动化微孔板检查、内置振荡器速度控制、内置式分液器的自动化预洗检查及位置传感器，其设计目的在于识别可能会影响研究的潜在错误并通知用户。Varioskan LUX 的 SkanIt 软件可在运行中全程监测并采集测量数据，降低浪费昂贵试剂、珍稀样品和宝贵时间的风险。Varioskan LUX 还能实现创新性的动态范围自动选择，用户无需每次设定检测手动调整灵敏度，从而使检测设置变得更为简单。该仪器可以根据每个孔内的信号强度，自动选择最佳动态范围，并使用相关设置获得最大灵敏度。因此即使某次检测出现极高和极低信号，也可确保批间及日间检测结果的可比性。其他产品功能包括：? 包含多达五项测量技术在内的模块化设计：吸光度、荧光强度、化学发光、时间分辨荧光分析和 AlphaScreen? ；? 内置式气体模块：基于细胞检测的最佳选择，在检测运行日志中记录实时气体浓度，提供可追溯性；? 完备的仪器自检和自动校准功能：在每次启动阶段检查各项功能以确保性能一致性，而自动校准则可确保每天获取结果的一致及可比性。有关 Varioskan LUX 和 SkanIt 软件的更多信息，请访问：www.thermoscientific.com/varioskanlux----------------------------------------关于赛默飞世尔科技赛默飞世尔科技（纽约证交所代码：TMO）是科学服务领域的世界领导者。公司年销售额170亿美元，在50个国家拥有约50,000名员工。我们的使命是帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。我们的产品和服务帮助客户加速生命科学领域的研究、解决在分析领域所遇到的复杂问题与挑战，促进医疗诊断发展、提高实验室生产力。借助于首要品牌Thermo Scientific、Applied Biosystems、Invitrogen、Fisher Scientific和Unity Lab Services，我们将创新技术、便捷采购方案和实验室运营管理的整体解决方案相结合，为客户、股东和员工创造价值。欲了解更多信息，请浏览公司网站：www.thermofisher.com。 赛默飞世尔科技中国赛默飞世尔科技进入中国发展已有30多年，在中国的总部设于上海，并在北京、广州、香港、台湾、成都、沈阳、西安、南京、武汉等地设立了分公司，员工人数超过3800名。我们的产品主要包括分析仪器、实验室设备、试剂、耗材和软件等，提供实验室综合解决方案，为各行各业的客户服务。为了满足中国市场的需求，现有8家工厂分别在上海、北京和苏州运营。我们在全国共设立了6个应用开发中心，将世界级的前沿技术和产品带给国内客户，并提供应用开发与培训等多项服务；位于上海的中国创新中心结合国内市场的需求和国外先进技术，研发适合中国的技术和产品；我们拥有遍布全国的维修服务网点和特别成立的中国技术培训团队，在全国有超过2000名专业人员直接为客户提供服务。我们致力于帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。欲了解更多信息，请登录网站 www.thermofisher.cn。