颜色光度计

任何的测量仪器的使用过程都需要定期进行[url=http://www.xrite.cn/categories/calibration-profiling/][color=#000000]颜色校正[/color][/url]，目的是维持仪器的读数准确性与稳定性。但是一般的第三方校准只是针对单台仪器与某个标准值的差异进行评估，不达标则返厂维修与校准。而从使用者层面来讲则需要确保自己手里的多台便携式分光光度计的台间差最小，避免不同仪器影响对颜色测量的正确评估。目前已有相关的网络实用程序，可用来验证、优化和认证该仪器的性能，实现一致的色彩测量值。

最近看到九级彩卡需要核查，我们的分光光度计是600型，DATACOLOR的设备，但是测试颜色后找不到LAB值不知道如何操作？有用这个设备的朋友们可以帮忙指点以下吗？

分光光度计是利用物质对光的选择性吸收的特性，以较纯的单色光作为入射光，测定物质对光的吸收，从而对物质进行定性或定量分析的仪器。在使用过程中常常会出现测量误差，这些误差又是如何产生的呢？一、仪器本身性能带来的误差1、复色光对比耳定律的偏离比耳定律成立的前提条件是入射光是单色光，但是精度再高的仪器，即使是双单色器的分光光度计，也只能获得近乎单色的光，无法获得纯单色光，它仍然含有狭窄光通带，具有复色光的性质。而复色光会导致比耳定律的正或负偏离。固定狭缝的紫外分光光度计光谱带宽一般为1nm或2nm，可调狭缝的可以做到0.1nm；可见分光光度计带宽6nm、snm，甚至十几纳米。光谱带宽应该是越小越好，但是随着光谱分辨率的提高，仪器的灵敏度降低，所以选择仪器时要综合考虑各种条件的影响。当溶液浓度较小且单色光较纯时，可近似认为符合比耳定律。2、杂散光的影响杂散光是指进入检测器的处于待测波长光谱带宽范围外的其他波长组分，它是光谱测量中误差的主要来源。产生原因有：分光光度计的色散元件、反射镜、透镜及单色器内壁灰尘等。在分光光度计工作波段边缘波长处，由于单色器透光率、光源辐射强度、检测器灵敏度都较低，杂散光的影响更为显著。杂散光限制仪器的分析上限可引起严重的测量误差，实际工作中，在定量分析时，一般在吸收峰或其附近处测量样品吸光度，如果在分析波长处含有杂散光，这时样品的透光率较小，而杂散光大部分透过，使测量吸光度低于真实吸光度。3、仪器噪声对测t的影响仪器噪声也是仪器的一个重要指标，它表征仪器做稀溶液的能力。是叠加在待测量的分析信号中的不需要的信号，扫描100%T和0%T线，可观察到分光光度计的绝对噪声水平，如果仪器噪声较大，会掩盖较小的测量信号，一般用噪音的二倍来表示仪器的灵敏度。4、波长和吸光度准确度样品的每一个值都是在一定的波长下测得的，如果波长误差很大，测出的值肯定不准。吸光度准确度也是用户对仪器的直接要求，更应引起足够的重视。国家计量检定规程规定双光束紫外可见分光光度计透射比准确度为A级士0.6%， B级土1.0%。二、测量条件的选择1 参比溶液和溶剂的选择分光光度计的测量实际上是以通过参比池的光强度作为入射光强度来测定试样的吸光度，先调节仪器使透过参比池溶液的吸光度为零，然后让同一束光通过样品，使得吸光度比较真实地反映待测物质的浓度，所以参比溶液的选择非常重要。如果仅有待测物质与显色剂的反应产物有吸收，可用纯溶剂或蒸馏水作参比溶液。如果显色剂有颜色，并在测定波长下有吸收，则用显色剂溶液作参比溶液，所加人显色剂及其它试剂的量，与试样中的加入量应一致。如果样品中其它组分本身的颜色对测定有干扰，而所用显色剂没颜色，则用不加显色剂的样品溶液作参比液。正确选择合适的溶剂，对提高分析的准确度起重要作用。为减小溶剂中杂质的影响，应选择高纯度的溶剂；溶剂应不与待测物质发生化学反应；待测物在溶剂中要有一定的溶解度；在测定的波长范围内，溶剂本身没有吸收，注意常用溶剂的最短可用波长；当用挥发性大的溶剂时，测量过程中吸收池应加盖。2 测试波长的选择当用分光光度计对溶液进行测定时，首先需要选择合适的测量波长。选择的依据是该被测溶液的吸收曲线。在一般情况下，我们总是选择最大吸收波长作为测量波长，这样可以提高灵敏度。而在有些情况下最大吸收峰很尖锐、吸收过大或附近有干扰存在，就不能选最大吸收波长，而必须在保证有一定灵敏度的情况下，选择吸收曲线中的其它波长进行测定(曲线较平坦处对应的波长)，以消除干扰。绘制吸收曲线是正确选择波长的有效手段和方法。

请教一个关于紫外分光光度计测定的问题：据文献介绍，芳香烃和萘类分别在285nm和270nm处有吸收，可以用紫外分光光度法测定汽油等产品中的芳香烃和萘类含量，我也查到了相关的行业标准，我的问题是我想用它来测油墨中芳香烃和萘类的总含量，但油墨本身的颜色很深，不像汽油那样透明，不知道油墨的颜色对这一测定有没有影响？还望高手指点！

一：吸光光度法基于物质对不同波长的光波具有选择性吸收的能力而建立起来的分析方法。（一） 光线：光线的波长： 200nm-400nm 紫外线*400-750nm可见光*750nm 红外线光具有波粒二相性，波长不同，其能量不同。（二） 物质的吸收光谱及颜色：1． 物质的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Wp][color=#3333ff]原子吸收光谱[/color][/url]和原子发射光谱：原子的最外层电子可以选择性吸收特征波长的电磁波成为激发态而产生的光谱称为[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Wp][color=#3333ff]原子吸收光谱[/color][/url]。激发态原子恢复到基态，则释放出特征波长的光子，形成原子发射光谱。不同的溶液其光谱不同，即不同溶液对不同波长的光其吸收能力不同，对某一特定波长的光存在吸收峰。2． 可见光由赤橙黄绿青兰紫等能量不同的光线组成，当可见光穿过某一溶液时，由于特定波长的光被吸收而使溶液呈现相应的颜色。（如CuSO4由于吸收了可见光中的黄光(600nm)而成蓝色）不同颜色的溶液对不同波长的光其吸收能力不同。（三） 光吸收的基本定律（Lambert-Beer 定律）：一束平行单色光（Io）通过有色的透明溶液时，一部分的光可以透过溶液（It），另一部分被溶液吸收（Ia）,还有一部分被器皿表面反射（Ir）,则：Io=It+Ia+Ir 。那么，该溶液透光率为: T = It / Io 。1． Lambert 定律：设有一束平行单色光,通过液层厚度为b 的均匀透明溶液,则溶液对光的吸收能力:A=Ig(Io/It)=Ig(1/T)=k2bk2 为吸光系数，为常数。与入射光波长、溶液性质、浓度和温度有关；A 为吸光度（又称光密度O.D 或消光度E），当入射光波长、吸光溶液的浓度和温度一定时，A 与b 成正比。2． Beer 定律：设有一束平行单色光,通过浓度为c 的均匀透明溶液,则溶液对光的吸收能力:A=Ig(Io/It)=Ig(1/T)=k4ck2 为常数。由Beer 定律可知：当入射光波长、吸光溶液的厚度和温度一定时，A 与c 成正比。3． Lambert-Beer 定律：综合1.2.得： A=Kbc ,即：当入射光波长、吸光溶液的性质和温度一定时，A 与b、c 成正比。（四） 吸光光度法的基本原理：1、 不同物质，由于其分子结构和原子组成不同，故对光的吸收光谱不同（如：CuSO4），在测定不同颜色的物质浓度时要用最大吸收的波长的入射光，这样测量的灵敏度最高。2、 同一种物质，若浓度不同，则对同一波长的入射光的吸收能力（吸光度）也不同，且成正比关系。3、 应此，利用特定波长的单色光（通常用最大吸收波长的入射光）照射不同浓度的某一溶液时，所得的吸光度大小应与溶液浓度呈线性关系，故可利用该线性关系通过计算或查标准曲线来求得未知溶液的浓度。（五） 吸光光度法特点：1． 灵敏度高：mg%级、甚至ug%级。2． 准确度高：误差2-5%3． 操作简便、快速，仪器设备不复杂，价格低廉，故应用广泛。二 ：分光光度计的使用：（一） 分光光度计的基本原理：利用吸光光度法的原理，采用棱镜或光栅等分光器获得纯度较高的单色光来测量未知溶液的浓度的方法。（二） 常用分光光度计：可见光、紫外、红外分光光度计，荧光分光光度计，火焰分光光度计等。（三） 722 型分光光度计的结构（略）（四） 722 型分光光度计的使用及注意事项1、 插上插头，接通电源，打开暗箱盖，预热20min。* 注意：分光光度计在接通电源而不用时，必须打开暗箱盖，以免光电管老化。2、 将准备好的试剂倒入比色杯中，用吸水纸擦去比色杯外侧水珠，并依次放入比色杯架中。* 注意：手拿比色杯毛面，试剂倒入杯中满2/3 即可，不得将比色杯放在仪器上。3、 调节所需波长，灵敏度调至“1”，选择旋钮至“T”。4、 调“0”：打开暗箱盖，用调“0”旋钮调节。5、 调“100%”：盖上暗箱盖，用调“100%”旋钮调节，让光线通过“空白管”。6、 重复调“0”和调“100%”数次。* 注意：若调不到“0”和“100%”，可将灵敏度调至“2”或更高，不得用力强行旋转旋钮，以免损坏。7、 将选择选扭由“T”调至“A”，此时读数应由“100”至“0”，若不为“0”，可用“消光零”旋钮调节。8、 拉动拉杆，分别读取“A 标”和“A 样”。9、 取出比色杯，弃去溶液，洗净晾干，备用。（五） 计算1．利用标准管计算测定物含量：A 样=K 样b 样c 样A 标=K 标b 标c 标因为入射光的波长，溶液性质和温度以及比色杯的厚度都一样，即：K 样=K 标 b 样=b 标所以：A 样/ A 标= c 样/ c 标得：c 样= c 标×A 样/ A 标2． 利用标准曲线进行计算：3． 偏离Lambert-Beer 定律的原因1） 由于非但色光引起的偏离。2） 由于溶液本身原因引起的偏离：① 由于介质不均匀引起的偏离② 由于溶液中化学反应引起的偏离三：实验：CuSO4 浓度的测定C 标= 比色波长=650nm比色结果： A 标= A 样=计算：C 样=C 标*A 样/A 标

出在一个不是分光光度计的机器上的问题～～但感觉发这里专家老师最多～～ 以前一直认为可见光范围内的波长可以直接用判断颜色的方法进行大致的判断。。。。但实验室进了一台哈希的DR850比色计后，却发现异常情况～～ 我们用这台机器用于水中余氯比色，余氯是DPD显色法，颜色为紫红色，按最大吸收应该用绿色光进行测量，但偏偏该比色计的光源颜色为蓝色。。。。 更诡异的是测量的结果却明明绿光才能达到的效果，并且该仪器在此光源下对与橙色（对蓝色光有最大吸收）的液体毫无反应（无明显吸收，测量值近乎0），那位老师知道这是什么原因造成的这个问题吗？？？

全自动定氮仪难点在于终点的判断，现在一般采用电位法,颜色法和比色法由于电极法对电极要求较高和使用上的不便，此类仪器较少。在此不做讨论。颜色法与伪颜色法（比色法）的区别： 由于有些企业由于能力和成本原因，把比色法说成颜色法，这对用户选择带来了困惑，为此作者在此讨论二者的区别。使采购者避免找到“李鬼”。1 由于滴定时，到达终点样品颜色发生变化，此时就认为滴定到终点。但是要注意的是：变化的是颜色（不仅仅是某波长的光通量的变化量，而要判断不同单色光相互关系）而不是单色光。如果用单色光(滤光片）比色而来判断，那毫无疑问数据是不可靠的。2 单色光比色就像光度计一样需要避光，所以伪颜色法（比色法）的定氮仪他的光路是密闭的，使用者看不到光路、比色杯和反应样品。而颜色法本身是复合光，判断的依据是不同颜色的关系，所以对自然光的变化对判断影响是非常小的。所以你可以看到样品杯和光线，甚至可以看到光源。这对颜色法和伪颜色法提供了直观的选择依据。3 蒸馏和滴定的关系：颜色法都是蒸馏和滴定同时进行，直到蒸馏结束来最终判断终点。而伪颜色法（比色法）由于判断方式的原因只能蒸馏后再滴定。　　你如果依据以上三点来比较，不符合颜色法的原理的，那就坚决淘汰，而不去管其他参数如何精美，否则有可能陷入陷阱（用比色法来冒充颜色法本身就是能力和品质有问题，其他精美的参数都必须打个问号，在此不做讨论）。　　注意：比色法是早已淘汰的检测方法，更无检测标准的依据，

[color=#b22222]分光光度计[/color]是利用物质对光的选择性吸收的特性，以较纯的单色光作为入射光，测定物质对光的吸收，从而对物质进行定性或定量分析的仪器。在使用过程中常常会出现测量误差，这些误差又是如何产生的呢?[align=center][img]http://shop.superyears.com/static/uploads/editor/img/1513044388.jpg[/img][/align][color=#daa520][b]1仪器本身性能带来的误差[/b][/color][b]1.1复色光对比耳定律的偏离[/b]比耳定律成立的前提条件是人射光是单色光，但是精度再高的仪器，即使是双单色器的分光光度计，也只能获得近乎单色的光，无法获得纯单色光，它仍然含有狭窄光通带，具有复色光的性质。而复色光会导致比耳定律的正或负偏离。固定狭缝的紫外分光光度计光谱带宽一般为1nm或2nm，可调狭缝的可以做到0.Inm [color=#b22222]可见分光光度计[/color]带宽6nm、snm，甚至十几纳米。光谱带宽应该是越小越好，但是随着光谱分辨率的提高，仪器的灵敏度降低，所以选择仪器时要综合考虑各种条件的影响。当溶液浓度较小且单色光较纯时，可近似认为符合比耳定律。[b]1.2杂散光的影响[/b]杂散光是指进人检测器的处于待测波长光谱带宽范围外的其他波长组分，它是光谱测量中误差的主要来源。产生原因有:分光光度计的色散元件、反射镜、透镜及单色器内壁灰尘等。在[color=#b22222]分光光度计[/color]工作波段边缘波长处，由于单色器透光率、光源辐射强度、检测器灵敏度都较低，杂散光的影响更为显著。杂散光限制仪器的分析上限可引起严重的测量误差，实际工作中，在定量分析时，一般在吸收峰或其附近处测量样品吸光度，如果在分析波长处含有杂散光，这时样品的透光率较小，而杂散光大部分透过，使测量吸光度低于真实吸光度。[b]1.3仪器噪声对测t的影响[/b]仪器噪声也是仪器的一个重要指标，它表征仪器做稀溶液的能力。是叠加在待测量的分析信号中的不需要的信号，扫描100%T和0%T线，可观察到[color=#b22222]分光光度计[/color]的绝对噪声水平，如果仪器噪声较大，会掩盖较小的测量信号，一般用噪音的二倍来表示仪器的灵敏度。[b]1.4波长和吸光度准确度[/b]样品的每一个值都是在一定的波长下测得的，如果波长误差很大，测出的值肯定不准。吸光度准确度也是用户对仪器的直接要求，更应引起足够的重视。国家计量检定规程规定双光束[color=#b22222]紫外可见分光光度计[/color]透射比准确度为A级士0.6%， B级土1.0%。[color=#daa520][b]2测量条件的选择[/b][/color][b]2.1参比溶液和溶荆的选择[/b][color=#b22222]分光光度计[/color]的测量实际上是以通过参比池的光强度作为人射光强度来测定试样的吸光度，先调节仪器使透过参比池溶液的吸光度为零，然后让同一束光通过样品，使得吸光度比较真实地反映待测物质的浓度，所以参比溶液的选择非常重要。如果仅有待测物质与显色剂的反应产物有吸收，可用纯溶剂或蒸馏水作参比溶液。如果显色剂有颜色，并在测定波长下有吸收，则用显色剂溶液作参比溶液，所加人显色剂及其它试剂的量，与试样中的加入量应一致。如果样品中其它组分本身的颜色对测定有干扰，而所用显色剂没颜色，则用不加显色剂的样品溶液作参比液。正确选择合适的溶剂，对提高分析的准确度起重要作用。为减小溶剂中杂质的影响，应选择高纯度的溶剂 溶剂应不与待测物质发生化学反应 待测物在溶剂中要有一定的溶解度 在测定的波长范围内，溶剂本身没有吸收，注意常用溶剂的最短可用波长 当用挥发性大的溶剂时，测量过程中吸收池应加盖。[b]2.2测试波长的选择[/b]当用[color=#b22222]分光光度计[/color]对溶液进行测定时，首先需要选择合适的测量波长。选择的依据是该被测溶液的吸收曲线。在一般情况下，我们总是选择最大吸收波长作为测量波长，这样可以提高灵敏度。而在有些情况下最大吸收峰很尖锐、吸收过大或附近有干扰存在，就不能选最大吸收波长，而必须在保证有一定灵敏度的情况下，选择吸收曲线中的其它波长进行测定(曲线较平坦处对应的波长)，以消除干扰。绘制吸收曲线是正确选择波长的有效手段和方法。[color=#daa520][b]3、分光光度计的检验小妙招[/b][/color][b]波长准确度的检验[/b][color=#b22222]分光光度计[/color]在使用过程中，由于机械振动、温度变化、灯丝变形、灯座松动或更换灯泡等原因，经常会出现刻度盘上的读数与实际通过溶液的波长不符合的现象，因而导致仪器灵明度降低，影响测定结果的精度，需要进行检验。检验波长准确度最简单的方法是用干涉滤光片或镨钕滤光片测量仪器的吸收峰值, 如果测出的值与滤光片标准值之差超出规程规定, 则需要进行波长调节。[b]透射比正确度的检验[/b]用透射比标准值分别为10 %、20 %、30 %左右的光谱中性滤光片，可见光区分别在440、546、635nm波长处，以空气为参比，分别测量各滤光片的透射比，紫外光区用重铬酸钾溶液分别在235、257、313、350nm波长处，以高氯酸溶液为参比，测量其透射比。[b]稳定度的检验[/b]在零点不受光的条件下，用零点调节器将仪器调至零点，观察3分钟读取透射比的变化，即为零点稳定性。在仪器测量范围两端向中间靠10nm处，调节零点后，盖上样品室盖(打开光门)，使光电管受光，调节透射比为95%(数显仪器调至100%)察3分钟读取透射比的变化，为光电流稳定性。[b]光的检验[/b][color=#b22222]可见分光计[/color]棱镜式仪器在420nm处，光栅式仪器在360nm处，紫外分光计在220nm处分别用符合规定的截止滤光片，以空气为参比，测量其透射比值，即为仪器在相应波长下的杂散辐射率。

1复色光对比耳定律的偏离比耳定律成立的前提条件是人射光是单色光，但是精度再高的仪器，即使是双单色器的分光光度计，也只能获得近乎单色的光，无法获得纯单色光，它仍然含有狭窄光通带，具有复色光的性质。而复色光会导致比耳定律的正或负偏离。固定狭缝的紫外分光光度计光谱带宽一般为1nm或2nm，可调狭缝的可以做到0.Inm；可见分光光度计带宽6nm、snm，甚至十几纳米。光谱带宽应该是越小越好，但是随着光谱分辨率的提高，仪器的灵敏度降低，所以选择仪器时要综合考虑各种条件的影响。当溶液浓度较小且单色光较纯时，可近似认为符合比耳定律。2杂散光的影响杂散光是指进人检测器的处于待测波长光谱带宽范围外的其他波长组分，它是光谱测量中误差的主要来源。产生原因有:分光光度计的色散元件、反射镜、透镜及单色器内壁灰尘等。在分光光度计工作波段边缘波长处，由于单色器透光率、光源辐射强度、检测器灵敏度都较低，杂散光的影响更为显著。杂散光限制仪器的分析上限可引起严重的测量误差，实际工作中，在定量分析时，一般在吸收峰或其附近处测量样品吸光度，如果在分析波长处含有杂散光，这时样品的透光率较小，而杂散光大部分透过，使测量吸光度低于真实吸光度。3仪器噪声对测t的影响仪器噪声也是仪器的一个重要指标，它表征仪器做稀溶液的能力。是叠加在待测量的分析信号中的不需要的信号，扫描100%T和0%T线，可观察到分光光度计的绝对噪声水平，如果仪器噪声较大，会掩盖较小的测量信号，一般用噪音的二倍来表示仪器的灵敏度。4波长和吸光度准确度样品的每一个值都是在一定的波长下测得的，如果波长误差很大，测出的值肯定不准。吸光度准确度也是用户对仪器的直接要求，更应引起足够的重视。国家计量检定规程规定双光束紫外可见分光光度计透射比准确度为A级士0.6%， B级土1.0%。

光度计是每个化学分析实验室必备的常用仪器设备之一，在各种定量和定性分析中得到了广泛的应用。 　 　分光光度计就是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器。 而分光光度法则是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析。 常用的波长范围为：(1)200～400nm的紫外光区,(2)400～760nm的可见光区,(3)2.5～25μm（按波数计为4000cm～400cm）的红外光区。所用仪器为紫外分光光度计、可见光分光光度计（或比色计）、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。为保证测量的精密度和准确度，所有仪器应按照国家计量检定规程或本附录规定，定期进行校正检定。 单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比，其关系如下式： 　　A=-log(I/I。)=-lgT=kLc 　　式中 :A 为吸收度； 　　I。为入射的单色光强度； 　　I 为透射的单色光强度； 　　T 为物质的透射比； 　　k 为吸收系数； 　　L 为被分析物质的光程 　　c 为物质的浓度 　　 物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后,可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸收度,即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收,但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定,故又称比色分析。由于显色时影响呈色深浅的因素较多，且常使用单色光纯度较差的仪器，故测定时应用标准品或对照品同时操作。 　　 分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。仪器主要由光源、单色器、样品室、检测器、信号处理器和显示与存储系统组成。

1）区别：　　光谱分析仪：用于测量发光体的辐射光谱，即发光体本身的指标参数。 　　分布光度计：用于产生单色光，并对某物质对该单色光的吸收进行分析。即 使用某种发光体通过单色仪产生某一波长的单色光，并将该单色光照射于被测量物质上，再通过光电传感器接收照射在物质后的光信号，根据此光信号分析该物质。2）应用：　　光谱分析仪：照明灯具厂家（节能灯\LED\白炽灯\荧光粉\紫外光源\红外光源等等的发光参数）。　　分布光度计：医药环境等的物质检定（纯度检验\推测化合物的分子结构\氢键强度的测定\络合物组成及稳定常数的测定等等）。3）精度：　　与仪器的配置有关，无法做简单比较，包括单色仪的分光精度\光电传感器的灵敏度等\电路放大等等。

一直以为在可见光范围内进行比色分析，比色所用光的颜色是与样本显色为互补色，因为这样才有最大吸收～～前几天到了一台哈希DR850便携比色计，用于测量余氯二氧化氯 DPD法 ，显色为紫红色，偶然发现其光源为蓝色。。。。不解。。。询问哈希售后。。。 他们确认光源为蓝色。。 再次又询问其他水司的同事，他们所用DR850光源也为蓝色。。。。后将DPD测试余氯显色后，于分光光度计上作光谱扫描。。。 在蓝色光范围内并未出吸收峰～～ 实在是不明白了哈希这方法到底是如何进行比色的呢？？？

1.1复色光对比耳定律的偏离比耳定律成立的前提条件是人射光是单色光，但是精度再高的仪器，即使是双单色器的分光光度计，也只能获得近乎单色的光，无法获得纯单色光，它仍然含有狭窄光通带，具有复色光的性质。而复色光会导致比耳定律的正或负偏离。固定狭缝的紫外分光光度计光谱带宽一般为1nm或2nm，可调狭缝的可以做到0.Inm；可见分光光度计带宽6nm、snm，甚至十几纳米。光谱带宽应该是越小越好，但是随着光谱分辨率的提高，仪器的灵敏度降低，所以选择仪器时要综合考虑各种条件的影响。当溶液浓度较小且单色光较纯时，可近似认为符合比耳定律。

756CRT型紫外可见分光光度计可以测出各种物体颜色里所包含的三原色的波长吗

[color=#00008B]分光光度计简单原理：由光源产生复合光，通过色散系统，分解为波长连续的单色光，单色光通过生化样品时，生化样品会吸收单色光，通过检测出射光的强度S和入射光的强度R，透射率T=S/R,如果连续调整波长（即扫描），就可以得到在生化样品关于波长分布的透射率，其透射率关于波长的分布和样品的成分和浓度相关。从而判断样品的成分，浓度。可见分光光度计是以全新的设计理念,博采众家之长,充满现代气息的外型设计,卓越的数据处理和控制功能为该仪器鲜明的特点[/color]

分光光度定义　　分光光度法则是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析。常用的波长范围为：(1)200～400nm的紫外光区,(2)400～760nm的可见光区,(3)2.5～25μm（按波数计为4000cm～400cm）的红外光区。所用仪器为紫外分光光度计、可见光分光光度计（或比色计）、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。为保证测量的精密度和准确度，所有仪器应按照国家计量检定规程或本附录规定，定期进行校正检定。关系式　　单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比，其关系如下式： 　　A=-log(I/I。)=-lgT=kLc 　　式中 :A 为吸收度； 　　I。为入射的单色光强度； 　　I 为透射的单色光强度； 　　T 为物质的透射比； 　　k 为吸收系数； 　　L 为被分析物质的光程 　　c 为物质的浓度 　　物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后,可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸收度,即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收,但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定,故又称比色分析。由于显色时影响呈色深浅的因素较多，且常使用单色光纯度较差的仪器，故测定时应用标准品或对照品同时操作。 结构　　分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。仪器主要由光源、单色器、样品室、检测器、信号处理器和显示与存储系统组成。

756CRT型紫外可见分光光度计可以测出各种物体颜色里所包含的三原色的含量吗

752型分光光度计为紫外光栅分光光度计，测定波长200nm～800nm。 1.结构原理 752型分光光度计由光源室、单色器、样品室、光电管暗盒、电子系统及数字显示器等 部件组成，仪器的工作原理如图1所示。 仪器内部光路系统如图2所示。 从钨灯或氢灯发出的连续辐射经滤色片选择聚光镜聚光后投向单色器进狭缝，此狭缝正好位 于聚光镜及单色器内准直镜的焦平面上，因此进入单色器的复合光通过平面反射镜反射及准 直镜变成平行光射向色散光栅。光栅将入射的复合光通过衍射作用形成按照一定顺序均匀排 列的连续单色光谱，此时单色光谱重新返回到准直镜，然后通过聚光原理成像在出射狭缝上 。出射狭缝选出指定带宽的单色光通过聚光镜落在试样室被测样品中心，样品吸收后透射的 光经光门射向光电管阴极面。根据光电效应原理，会产生一股微弱的光电流。此光电流经电 流放大器放大，送到数字显示器，测出透光率或吸光度，或通过对数放大器实现对数转换， 显示出被测样品的浓度C值。[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=91635]752型分光光度计结构原理及使用方法.doc[/url]

分光光度计的基本工作原理是基于物质对光（对光的波长）的吸收具有选择性，不同的物质都有各自的吸收光带，所以，当光色散后的光谱通过某一溶液时，其中某些波长的光线就会被溶液吸收。在一定的波长下，溶液中物质的浓度与光能量减弱的程度有一定的比例关系，即符合比尔定律。 T = I/Io lg（Io/I）=εcb式中，T为透过率，Io为入射光强度，I为透射光强度，A为消光值（吸光度），ε为吸收系数，b为溶液的光径长度，c为溶液的浓度。从以上公式可以看出，当入射光、吸收系数和溶液厚度一定时，透光率是根据溶液的浓度而变化的。721型分光光度计的构造721型分光光度计允许的测定波长范围在360～800nm，其构造比较简单，测定的灵敏度和精密度较高。因此，应用比较广泛。721型分光光度计的仪器构造见图5-5。从光源灯发出的连续辐射光线，射到聚光透镜上，会聚后，再经过平面镜转角90°，反射至入射狭缝。由此入射到单色器内，狭缝正好位于球面准直物镜的焦面上，当入射光线经过准直物镜反射后，就以一束平行光射向棱镜。光线进入棱镜后，进行色散。色散后回来的光线，再经过准直镜反射，就会聚在出光狭缝上，再通过聚光镜后进入比色皿，光线一部分被吸收，透过的光进入光电管，产生相应的光电流，经放大后在微安表上读出。721型分光光度计的使用方法①首先接通电源，打开电源开关1，指示灯亮，打开比色皿暗箱盖8，预热20分钟。②波长选择旋钮6，选择所需的单色光波长，用灵敏度旋钮2选择所需的灵敏档。③放入比色皿，旋转零位旋钮5调零，将比色皿暗箱盖合上，推进比色皿拉杆3，使参比比色皿处于空白校正位置，使光电管见光，旋转透光率调节旋钮4，使微安表9指针准确处于100%。按上述方法连续几次调整零位和100%位，即可进行测定工作。721型分光光度计使用和维护中应注意事项：①连续使用仪器的时间不应超过2小时，最好是间歇0.5小时后，再继续使用。②比色皿每次使用完毕后，要用去离子水洗净并倒置晾干后，存放在比色皿盒内。在日常使用中应注意保护比色皿的透光面，使其不受损坏或产生划痕，以免影响透光率。③仪器不能受潮。在日常使用中，应经常注意单色器上的防潮硅胶（在仪器的底部）是否变色，如硅胶的颜色已变红，应立即取出烘干或更换。④在托运或移动仪器时，应注意小心轻放。

721型分光光度计构造、使用与维修 分光光度计的基本工作原理是基于物质对光(对光的波长)的吸收具有选择性，不同的物质都有各自的吸收光带，所以，当光色散后的光谱通过某一溶液时，其中某些波长的光线就会被溶液吸收。在一定的波长下，溶液中物质的浓度与光能量减弱的程度有一定的比例关系，即符合比尔定律。 T = I/Io lg(Io/I)=εcb 式中，T为透过率，Io为入射光强度，I为透射光强度，A为消光值(吸光度)，ε为吸收系数，b为溶液的光径长度，c为溶液的浓度。从以上公式可以看出，当入射光、吸收系数和溶液厚度一定时，透光率是根据溶液的浓度而变化的。 721型分光光度计的构造 721型分光光度计允许的测定波长范围在360～800nm，其构造比较简单，测定的灵敏度和精密度较高。因此，应用比较广泛。 721型分光光度计的仪器构造见图5-5。从光源灯发出的连续辐射光线，射到聚光透镜上，会聚后，再经过平面镜转角90°，反射至入射狭缝。由此入射到单色器内，狭缝正好位于球面准直物镜的焦面上，当入射光线经过准直物镜反射后，就以一束平行光射向棱镜。光线进入棱镜后，进行色散。色散后回来的光线，再经过准直镜反射，就会聚在出光狭缝上，再通过聚光镜后进入比色皿，光线一部分被吸收，透过的光进入光电管，产生相应的光电流，经放大后在微安表上读出。721型分光光度计的使用方法 ①首先接通电源，打开电源开关1，指示灯亮，打开比色皿暗箱盖8，预热20分钟。 ②波长选择旋钮6，选择所需的单色光波长，用灵敏度旋钮2选择所需的灵敏档。 ③放入比色皿，旋转零位旋钮5调零，将比色皿暗箱盖合上，推进比色皿拉杆3，使参比比色皿处于空白校正位置，使光电管见光，旋转透光率调节旋钮4，使微安表9指针准确处于100%。按上述方法连续几次调整零位和100%位，即可进行测定工作(仪器面板见 图5-6)。 721型分光光度计使用和维护中应注意事项： ①连续使用仪器的时间不应超过2小时，最好是间歇0.5小时后，再继续使用。 ②比色皿每次使用完毕后，要用去离子水洗净并倒置晾干后，存放在比色皿盒内。在日常使用中应注意保护比色皿的透光面，使其不受损坏或产生划痕，以免影响透光率。 ③仪器不能受潮。在日常使用中，应经常注意单色器上的防潮硅胶(在仪器的底部)是否变色，如硅胶的颜色已变红，应立即取出烘干或更换。 ④在托运或移动仪器时，应注意小心轻放

大家好，众所周知，按光路分，紫外可见光分光光度计的类型无外乎三种：单光束分光光度计，单波长双光束分光光度计，双波长双光束分光光度计。单光束分光光度计结构简单，只有检测池，没有参比池，复合光经单色器过滤出想要的特定波长的光进行样品含量的测定。优点：操作简单，光强度大，光信噪比高。 缺点：不能抵消因杂散光、光源波动、电子学的噪声等对测试结果的影响。单波长双光束分光光度计结构稍微复杂，一般分为三种，一种为有两束光，一束光通过比色皿，一束光不通过比色皿，有两只光电转换器。一种为两束单色光，两只比色皿，一只光电转换器，一种为两束单色光，两只比色皿，两只光电转换器。问题出来了，为什么会有光电转换器数量的不同呢？ 两只光电转换器会存在不一致，导致测量误差，那为什么会有存在的必要呢？大家知道，如果是一只光电转换器的光度计，在最后的计算时，两束光的比值做为测定结果显示（一般透射光/反射光）那么两只光电转换器的光度计在计算时也是这样吗？其实会导致结果的误差的。我个人理解是不是跟光的强度有关，双光电转换器可以增加光的强度，提高检测的灵敏度。

分光光度计是用不连续的波长采样反射物体或透射物体的一种测量仪器。由于不同物体分子的结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同，因此，每种物体都具有特定的吸收光谱。能从含有各种波长的混合光中，将每一种单色光分离出来，并测量其强度的仪器叫做分光光度计。分光光度计所使用的波长范围不同，可分为紫外光区，可见光区、红外光区以及全波段分光区。因此，分光光度计可分为可见光分光光度计。紫外／可见光分光光度计、荧光分光光度计、红外分光光度计等。无论是哪一类分光光度计主要都是由光源、单色器、狭缝、吸收器检测器系统5部分组成的。分光光度计通常提供用白光采样的照明光源。以及包括扩散后折射的反射光，而且允许测量在不连续波长时反射的总光量。分光光度计的准确度是由很多因素决定的，但是最重要的因素之一是光谱波段（即在所测量的光谱中每点波长的范围）。使用分光光度计可以绘制吸收光谱曲线，具有尖峰分光光度法曲线的介质要求分光光度计能通过狭窄的波段，典型的波长间隔是5nm，比较便宜的仪器通常能通过1Onm或20nm的波段。

72型分光光度计是可见光分光光度计，波长范围为420nm～700nm，它由三大部分组 成:磁饱和稳压器、光源、单色光器和测光机构、微电计。其光学系统如图5-11所示。72型分光光度计的基本依据是朗伯—比耳定律，它是根据相对测量原理工作的，即先选定某一溶剂作为标准溶液，设定其透光率为100%，被测试样的透光率是相对于标准溶液而言的，即让单色光分别通过被测试样和标准溶液，二者能量的比值就是在一定波长下对于被测试样的透光率。如图所示，白色光源经入射狭缝、反射镜和透光镜后，变成平行光进入棱镜，色散后的单色光经镀铝的反射镜反射后，再经过透镜并聚光于出射狭缝上，狭缝宽度为0.32nm。反射镜和棱镜组装在一可旋转的转盘上并由波长调节器的凸轮所带动，转动波长调节器便可以在出光狭缝后面选择到任一波长的单色光。单色光透过样品吸收池后由一光量调节器调节为适度的光通量，最后被光电电池吸收，转换成电流后由微电计指示，从刻度标尺 上直接读出透光率的值。分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。 分光光度计的简单原理分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。核酸的定量核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长260 nm。 每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。如EppendorfBiophotometer的准确度≤1.0%（1A）。这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动，都是正常的。另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值，离子浓度等：在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，如TE，可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如 A 260 / A 280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是 280 nm。纯净的样品，比值大于 1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于 1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A 230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸 A 260 / A 230 的比值大于 2.0。A 320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A 320 一般是 0。蛋白质的直接定量（UV法）这种方法是在280 nm波长，直接测试蛋白。选择 Warburg公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在一些杂质，一般要消除320 nm的“背景”信息，设定此功能“开”。与测试核酸类似，要求 A 280 的吸光值至少大于 0.1A，最佳的线性范围在1.0-1.5 之间。实验中选择 Warburg 公式显示样品浓度时，发现读数“漂移”。这是一个正常的现象。事实上，只要观察A 280的吸光值的变化范围不超过 1%，表明结果非常稳定。漂移的原因是因为 Warburg公式吸光值换算成浓度，乘以一定的系数，只要吸光值有少许改变，浓度就会被放大，从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA 的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法蛋白质定量蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。比色方法一般有 BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。Lowry 法：以最早期的 Biuret 反应为基础，并有所改进。蛋白质与Cu2+反应，产生蓝色的反应物。但是与 Biuret相比，Lowry 法敏感性更高。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂；反应需要的时间较长；容易受到非蛋白物质的影响；含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物质的蛋白不适合此种方法。BCA（Bicinchoninine acid assay）法：这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2+反应产生 Cu+，后者与 BCA 形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在 562 nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系极强，反应后形成的化合物非常稳定。相对于 Lowry 法，操作简单，敏感度高。但是与 Lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford 法：这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有色化合物吸收峰595 nm。其最大的特点是，敏感度好，是 Lowry 和 BCA 两种测试方法的 2倍；操作更简单，速度更快；只需要一种反应试剂；化合物可以稳定1小时，方便结果；而且与一系列干扰 Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的。最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。某些初次接触比色法测定的研究者可能为各种比色法测出的结果并不一致，感到迷惑，究竟该相信哪种方法？由于各种方法反应的基团以及显色基团不一，所以同时使用几种方法对同一样品得出的样品浓度无可比性。例如：Keller 等测试人奶中的蛋白，结果 Lowry，BCA测出的浓度明显高于Bradford，差异显著。即使是测定同一样品，同一种比色法选择的标准样品不一致，测试后的浓度也不一致。如用Lowry测试细胞匀浆中的蛋白质，以 BSA 作标准品，浓度1.34 mg / ml，以 a 球蛋白作标准品，浓度 2.64 mg /ml。因此，在选择比色法之前，最好是参照要测试的样本的化学构成，寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品。另外，比色法定量蛋白质，经常出现的问题是样品的吸光值太低，导致测出的样品浓度与实际的浓度差距较大。关键问题是，反应后的颜色是有一定的半衰期，所以每种比色法都列出了反应测试时间，所有的样品（包括标准样品），都必须在此时间内测试。时间过长，得到的吸光值变小，换算的浓度值降低。除此，反应温度、溶液PH值等都是影响实验的重要原因。此外，非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材质的比色杯，因为反应后的颜色会让石英或者玻璃着色，导致样品吸光值不准确。细菌细胞密度（OD 600）实验室确定细菌生长密度和生长期，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。以未加菌液的培养液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。为了保证正确操作，必须针对每种微生物和每台仪器用显微镜进行细胞计数，做出校正曲线。实验中偶尔会出现菌液的OD值出现负值，原因是采用了显色的培养基，即细菌培养一段时间后，与培养基反应，发生变色反应。另外，需要注意的是，测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状态。分光光度计的重要配件 —— 比色杯比色杯按照材质大致分为石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根据不同的测量体积，有比色杯和毛细比色杯等。一般测试核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不适合比色法测定。因为反应中的染料（如考马斯亮兰）能让石英和玻璃着色，所以必须采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不适合用于在紫外范围内测试样品。由于另外测试的样品量不同，所以一般分光光度计厂家提供不同容积的比色杯以满足用户不同的需求。目前市场已经存在一种既可用于核酸、紫外蛋白质定量，亦可用于蛋白比色法测定的塑料杯，样品用量仅需50μl，比色杯单个无菌包装，可以回收样品。如Eppendorf UVette?塑料比色杯，是目前比色杯市场上一个革新。随着生命科学以及相

有人做过GB5009用副玫瑰苯胺分光光度计法做亚硫酸盐，我是完全按照国标做的，做了很多次都没成功，空白试剂管颜色太深，线性不好，有那位高手做过。

紫外可见分光光度计的组成和应用紫外-可见分光光度计由5个部件组成：①辐射源。必须具有稳定的、有足够输出功率的、能提供仪器使用波段的连续光谱，如钨灯、卤钨灯（波长范围350～2500纳米），氘灯或氢灯（180～460纳米），或可调谐染料激光光源等。②单色器。它由入射、出射狭缝、透镜系统和色散元件（棱镜或光栅）组成，是用以产生高纯度单色光束的装置，其功能包括将光源产生的复合光分解为单色光和分出所需的单色光束。③试样容器，又称吸收池。供盛放试液进行吸光度测量之用，分为石英池和玻璃池两种，前者适用于紫外到可见区，后者只适用于可见区。容器的光程一般为0.5～10厘米。④检测器，又称光电转换器。常用的有光电管或光电倍增管，后者较前者更灵敏，特别适用于检测较弱的辐射。近年来还使用光导摄像管或光电二极管矩阵作检测器，具有快速扫描的特点。⑤显示装置。这部分装置发展较快。较高级的光度计，常备有微处理机、荧光屏显示和记录仪等，可将图谱、数据和操作条件都显示出来。仪器类型则有：单波长单光束直读式分光光度计，单波长双光束自动记录式分光光度计和双波长双光束分光光度计。应用范围包括：①定量分析，广泛用于各种物料中微量、超微量和常量的无机和有机物质的测定。②定性和结构分析，紫外吸收光谱还可用于推断空间阻碍效应、氢键的强度、互变异构、几何异构现象等。③反应动力学研究，即研究反应物浓度随时间而变化的函数关系，测定反应速度和反应级数，探讨反应机理。④研究溶液平衡，如测定络合物的组成，稳定常数、酸碱离解常数等。

有一台722型分光光度计，使用时对于浓度大一些，颜色深一些的溶液便不能显示吸光度，（比如甲醛标准溶液：对于1.0、1.5、2.0微克的溶液就没有吸光度了，而是与开盖是显示的一样）同不工作状态一样，但是对于低浓度还是有吸光度的。请问这是咋滴回事儿啊？是仪器已坏了吗？

分光光度计的光源为连续光源，包含任意波长的光。1、如果不要单色器，直接让连续光源照射样品，也会产生吸收吗？2、单色器分光以后得到的单色光，在连续光源里面也有啊，不分光行吗？