红外膜法

11月8日，西安交通大学第一附属医院宣布：由该院联合四川大学国家生物医学材料工程技术研究中心与西安交大机械学院等共同研发的国内首款体外膜肺氧合设备（以下简称ECMO），于11月6日在西安成功救治了两名危重心血管病患者。　　ECMO被誉为“人工心肺”“救命神器”，是常规治疗无效时挽救严重心肺功能障碍的必要措施。西安交通大学第一附属医院袁祖贻、闫炀教授团队是国内从事ECMO临床应用与研究骨干科研力量。2017年，该研究团队联合四川大学国家生物医学材料工程技术研究中心张兴栋院士、王云兵主任团队、西安交通大学机械学院庄健教授团队及西安京工医疗科技公司针对ECMO设备全血液接触面长效抗凝涂层、磁悬浮离心泵、超声流量探头、程控监测系统及ECMO膜肺展开深入设计和研发，基本完成ECMO离心泵设备及全系列耗材的样品试制，幷进行了针对抗凝涂层的大动物实验。新冠疫情暴发后，研发团队充分分析比较国外同类产品的优缺点及临床使用存在的问题，设计出针对国内临床需求的国产化ECMO。研发中采用多目标优化和数值仿真方法获得离心泵流道最优设计方案，采用芯片化控制模式保证ECMO控制的精准性和长时间工作的安全性，采用仿生涂层新技术获得了比国外同类产品更优异的长效循环抗凝血效果。

线粒体是真核细胞能量代谢的主要场所，与动植物的生长发育密切相关，99%的线粒体蛋白由细胞核基因编码，在细胞质中合成。线粒体外膜TOM转位酶复合体负责绝大部分前体蛋白运输进入线粒体，再通过其他转位酶复合体分选至线粒体的各个部位。TOM复合体是由7个亚基组成的膜蛋白复合体，其组装过程是多步骤且高度动态的，需要线粒体外膜SAM复合物的协助。但是，SAM复合物如何协助TOM组装的分子机制尚不清楚。　　为了探索TOM转位酶复合体的组装机制，作物遗传改良国家重点实验室殷平教授研究团队独辟蹊径，利用哺乳动物细胞重组表达系统重构了该组装过程，并实现精准控制，可人为地为组装按下“暂停键”。该方法使得研究者捕获了TOM组装过程中的多个中间态并获得其蛋白样品，攻克了该领域多年来无法获得稳定的TOM复合体中间态的难题。研究团队利用单颗粒冷冻电镜技术首次解析了两个重要中间态的高分辨三维结构，并结合功能分析阐明了SAM复合物协助组装以及释放TOM的分子机制。　　该研究成果有助于理解TOM转位酶复合体的组装过程，更好地探究线粒体蛋白的生物发生，为线粒体疾病治疗和作物遗传改良提供理论基础。相关研究成果于近期发表在Science杂志上。

大家好，本周为大家介绍一篇发表在Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A上的文章，HDX-MS performed on BtuB in E. coli outer membranes delineates the luminal domain’s allostery and unfolding upon B12 and TonB binding1，文章作者是华盛顿大学的Tobin R. Sosnick。　　TonB-依赖的转运体(TBDTs)广泛存在与革兰氏阴性菌的外膜上，通过其摄取营养。但TBDTs转运时的机制尚不明确，尤其是可供底物通过的跨膜β-桶孔径打开时的结构变化机理。BtuB是一种典型的大肠杆菌TBDT，其功能和生物物理环境都得到了广泛的研究。目前推测BtuB在行使转运功能时，其通道孔径形成需要BtuB与底物维生素B12结合，其N-端7个残基(称为“Ton box”)产生较大的构象转变，从β-桶中甩出进入胞质并与下游蛋白TonB发生相互作用。但孔径形成的过程具体机理存在两个具有争议的猜想：力依赖模型认为，TonB通过将BtuB从β-桶拽出到胞质，并从膜内侧将能量传递给BtuB，这些力可能重塑塞区并导致孔径形成 而非力依赖模型则认为孔径的形成跟BtuB自身保守的Ionic Lock(IL，即R14和D316间的盐桥)相互作用有关，当B12存在时只需要IL解锁TonB就能与BtuB结合产生成孔运动。晶体学研究捕捉到了Apo BtuB、BtuB:B12和BtuB:B12:TonBCTD的结构(图1)，但晶体学研究一来存在晶体堆积导致其结构与溶液态蛋白结构产生一定差异的问题，二来静态的结构“截图”无法提供动态变化过程信息。因此，本文选择氢氘交换质谱法(HDX-MS)解析BtuB和配体结合时产生结构动态变化过程，以深入推测该过程的具体机制。　　图1. BtuB腔体结构域与两个配体结合事件的构象响应模型。　　该实验共设有4组，包括：Apo BtuB、BtuB + B12、BtuB + TonB和BtuB + B12 + TonB。作者对BtuB + B12的HDX速率及保护因子(PF)进行了分析(图2)：其中，N-端2-29残基(包括Ton box在内及IL中的R14)、pre-SB3区域属于快速氘代区域，SB1、SB2、SB3属于中速氘代区，其他区域属于慢速氘代区。　　图2. HDX速率分区并映射至结构。　　随后作者分析了Apo BtuB、BtuB + B12的HDX-MS实验数据(图3)。其中IL区域及其相连的Fisrt Strand区域的HDX变化情况最为显著(氘代上升)，从氘代动力学图中我们可以看到添加B12后该区域的氘代速率从较慢的水平转变为较快的水平，这说明B12的结合足以使得IL区域发生较大的构象变化，该现象呼应了TonB从较为紧凑的结构转变为较为动态/溶剂可及性高的结构。除此之外，N-端前5个残基区域经历了轻微的氘代上升 底物结合区SB1、SB2和SB3经历了一定程度的氘代下降，而SB3的前端经历了一定的氘代上升。　　图3. BtuB + B12和Apo BtuB的HDX比较。　　接着作者也考察了BtuB + TonB和BtuB + B12 + TonB的HDX-MS结果(图4)。结果发现，只加TonB时BtuB的IL区域并未发生较大的HDX变化，而同时添加B12和TonB的BtuB IL区产生了明显的氘代变化，这些现象进一步证实了BtuB的Ton box发生结构改变是B12结合后IL解锁产生的效应。这些实验结果支持非力依赖型假说机制，即B12结合后通过別构效应使得IL处的盐桥打破，使得Ton box区被释放至胞质中，进一步跟下游蛋白结合从而打开通道孔径。　　图4. 不同组别的IL区域的HDX氘代动力学图。　　本文通过HDX-MS实验解决了大肠杆菌离子通道家族中一蛋白BtuB配体相关的动态调控机制，通过实验的方法验证了非力依赖机制假说。本文选取的体系及蛋白样品较为巧妙，实验设计合理，实验证据充分，行文逻辑严密，为离子通道的动态调控机制提供了见解，是HDX-MS方法优势的典型体现。　　撰稿：罗宇翔　　编辑：李惠琳　　原文：HDX-MS performed on BtuB in E. coli outer membranes delineates the luminal domain’s allostery and unfolding upon B12 and TonB binding　　李惠琳课题组网址：https://www.x-mol.com/groups/li_huilin　　参考文献　　1. Zmyslowski, A. M. Baxa, M. C. Gagnon, I. A. Sosnick, T. R., HDX-MS performed on BtuB in E. coli outer membranes delineates the luminal domain's allostery and unfolding upon B12 and TonB binding. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2022, 119 (20).