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激光扫描探测器

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  • 激光扫描共聚焦显微镜在古气候纹层学的应用

    激光扫描共聚焦显微镜还能这么用！　　众所周知，激光共聚焦显微镜主要的应用方向在观察活细胞结构及特定分子、离子的生物学变化，而在石笋这样的样品观察上使用激光扫描共聚焦显微镜，可以说脑洞大开了！让我们来看看原文，从Nikon A1激光扫描共聚焦显微镜使用者的角度看看，怎么把这个工具用活了！　　激光扫描共聚焦显微镜在古气候纹层学的应用　　第一作者：赵景耀　通讯作者：程　海　　1984年第一台商业化的激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称 LSCM）出现，随之共聚焦显微镜技术成为了一个热点，并广泛应用在国内外生物和工业检测领域。现今，我们将LSCM首次应用于国内古气候纹层学研究。纹层学一直是古气候研究重要内容，特别是荧光微层在很多古气候载体中是重要的年代标尺和气候指标。2000年，Ribes等首次将LSCM应用于石笋荧光微层研究，发现LSCM分辨率可达１μｍ，因此，可适用于各种不同厚度的石笋年纹层；2008年，Orland等将LSCM与离子探针采样结合，首次发现了石笋δ18O的季节性信号，并表示以色列Soreq Cave单层δ18O季节波动可达2.15‰；2010年，Dasgupta等通过LSCM识别石笋纹层中的碎屑和粘土层，据此重建了美国明尼苏达州过去3000年极端暴雨事件，发现20世纪全球升温以来，其暴雨频率明显增加；2015年，Wendt利用LSCM，在巴西TBV Cave石笋纹层中发现了罕见的“双纹层”，且均出现在高生长速率的Heinrich事件期间，认为这与Heinrich期间，Intertropical Convergence Zone（ITCZ）南支南移所导致一年内存在2个雨季有关；2015年，Orland等再次将LSCM与离子探针技术应用于中国苦栗树洞石笋研究，发现全新世和B?lling-Aller?d暖期的夏季降水比例明显多于Younger Dryas时期。而目前，国内主要依赖于普通透射光和荧光显微镜，这一定程度上限制了国内古气候学研究。笔者在西安交通大学机械制造系统工程生物制造中心，利用购置的LSCM组件（图1a），观察石笋“年纹层”和砗磲“天纹层”，取得初步认识，以下分别就LSCM及其在古气候荧光微层方面的应用及注意事项作一简介。　　图1　激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）组件（a）及其原理（b）　　1.倒置荧光显微镜（Inverted fluorescence microscope）；2.荧光探测器（Flurescence detector）；3.激光发生器（Laser generator）；4.LSCM总控制器（Main controller）；5.扫描头（Head of laser scanner）；6.明场及电动载物台开关（Switch of bright-field microscopy and electric stage）；7.．荧光光源开关（Switch of fluorescent source）；8.电动载物台（Electric stage）；9.LSCM连接电脑（Computer and Monitor）　　LSCM以激光为点光源，由照明针孔与探测针孔对被探测点的共轭关系（图1b），实现对被探测点所在焦面的逐点激发，逐点扫描，该技术称为共聚焦。与普通荧光显微镜一次性照明整个视野不同，LSCM通过逐点扫描探测，呈现标本荧光层的2维或3维图像（图2），因此其对不同焦点和焦面的辨析能力，是普通荧光显微镜所不能达到的。其中，图2a中3D切片z轴步进间距（即焦面间距）为3μｍ，当前仪器上限25nm（仪器型号：Nikon A1）。在LSCM标本纹层成像过程中，放置于探测器前的探测针孔（Pinhole）（图1b）起着关键作用，有效地阻挡了不同焦点带来的杂散光，只有被探测点所发射的荧光透过Pinhole，到达探测器形成图像，这对图像对比度和分辨率有重要影响（图2）。而且LSCM采用光电倍增技术，可将微弱荧光信号进一步放大。综上，利用LSCM可以真正地实现10μｍ级荧光纹层的清晰辨别，其分辨率和辨识度是普通荧光显微镜所不能实现的，在此基础我们可以观察并辨别10μｍ左右石笋“年纹层”（图2d）和3~5μｍ级别砗磲“天纹层”（图2e）。　　图2　石笋荧光层3D切片拟合（a）、石笋荧光“年纹层”（b、c和d）和砗磲荧光“天纹层”（e）　　所有图像在1024扫描分辨率下，利用波长为488-nm的蓝色激光作为激发光源激发，然后用荧光滤光片滤选发射波长为505~539nm绿色发射光，最终被检测器探测并扫描成像；图片（a）由LSCM连续拍摄31层平行荧光焦面拟合而成，3μm／层；石笋样品（a）和（c）取自湖北省犀牛洞，（b）取自南京葫芦洞，（d）取自吉林省琉璃洞；（e）砗磲取自中国南沙群岛永暑礁　　不同于普通光学显微镜，通过制作极薄的显微镜[url=http://www.gengxu.cn]滤光片[/url]（≤１mm）实现对于杂散光或荧光焦面的控制。LSCM装配倒置荧光显微镜直接对古气候标本切面观察，源于LSCM对不同焦面荧光信号的精准解析和辨别能力，对于石笋和砗磲等古气候标本，无需制作显微镜薄片，只需将样品切面抛光磨平，即可实现对抛光表面荧光微层和透光微层定焦高分辨率扫描。LSCM极大地简化标本处理，不仅能够更好地节约和保护标本，且能和其他分析（如稳定同位素分析）在同一样品上进行，有利于精细对照，对于古气候研究有重要意义。例如，最近Li等在其他方法精确定年困难的情况下，利用LSCM方法精确确定了近百年石花洞的石笋样品年代序列；对著名的南京葫芦洞样品的初步工作显示，将能够重建上个冰期精细到年的时间序列及气候变化的变率（图2b），而又不破坏极其珍贵的样品。　　但是由于LSCM以激光作为光源，在镜下观察过程中发现，根据物镜倍数（10×、20×、40×、60×和100×）不同，导致激光聚光强度不同，会出现不同程度的荧光猝灭，对于常用倍数10×和20×，荧光猝灭微弱，肉眼无法识别，可忽略。但是在60×油镜及以上倍数，荧光猝灭快速，因此在使用过程中，要注意调焦与拍摄时间的平衡。另外，计算机对焦过程是纳米级对焦，在标本前期处理过程中，保证样品观察面平整，是快捷对焦、自动扫描和拼接大图的工作基础。对于目前使用的型号Nikon A1，由于LSCM电动载物台承重和规格限制，以及明场聚光器位置限制（图1a），要求古气候标本观察面≤６cm×６cm，厚度≤５cm，但可根据需要选择不同型号的载物台。最后，由于各种LSCM在许多研究机构和医学院都具备，且使用费用不高，因此进行该研究不必购置新设备。

  • 激光扫描模组

    条码扫描模组在外国已经使用很久了，现在已经发展到中国内部。这种技术的发明带来了更多的工作改革潮流。促进了自动化的步伐，大大简化人类工作流程，减少更多的脑力负担。扫描模组属于二次开发产品，兼备识别条码并加以扫描和解码的功能，然后还可以植入更多的应用行业的功能程序。外形构造小巧，高度集成材料，可以置入手机、平板电脑，打印机和一些医疗设备等各行各业的机械设备中。一般情况，条码扫描模组分为二大类，第一个就是激光扫描模组，第二个就是红光扫描模组。 现在对激光扫描模组进行分析下，激光扫描模组是通过辐射出一个激光光源点，然后按照激光发射的原理打成激光光线照遭条码上，在经过解码转化成为数字信号，加而给电脑读取信息。但是相对于红光扫描模组来说就比价精确点了。在强烈的阳光下，一般情况都是用激光扫描模组，因为红光不是红外线，就是单单的红色的光。阳光中可以算什么光线都有，会对红光扫描模组发射出来的LED灯光造成很大的影响，导致扫描的结果不准确。 如果在结构上来说呢，红光扫描模组要比激光扫描模组好一点而且价格实惠。激光扫描模组里面的结构是靠点胶固定的机械装置，因此就有很大的结构固定，易碎行，抗硬性就不是很好了。红光扫描模组里面就没有一些所谓的机械装置固定，所以耐用性比价好，但是总体来说，激光扫描模组的用途是比较多的，红光的就有很多局限性。看个人的用处所在. 本文出自 www.yuanjingda.com 转载请注明出处！

  • 差分偏光激光扫描显微镜简介

    [url=http://www.f-lab.cn/microscopes-system/dplsm.html][b]差分偏光激光扫描显微镜[/b][/url]differential polarization laser-scanning microscope (DPLSM)具有[b]扫描光学显微镜[/b]和[b]分光偏振计[/b]的双重优点，可提供逐像素地实施的生物样本的各向异性数据，在记录生物组织图像强度的同时，能够实时地提供高精度的生物样品的各向异性组织的逐个像素的数据。差分偏光激光扫描显微镜采用模块化设计，可以直接安装到用户现有的激光扫描显微镜上，不用担心改变原来的光路和电子。我公司提供方便安装的差分偏光激光扫描显微镜DPLSM模块,可直接安装到激光扫描显微镜上，不需要改变电路和光路就可使用差分偏光激光扫描显微镜DPLSM功能。差分偏光激光扫描显微镜：[url]http://www.f-lab.cn/microscopes-system/dplsm.html[/url]

  • 激光扫描共聚焦显微镜在细胞凋亡研究中的应用

    摘要激光扫描共聚焦显微镜作为80年代发展起来的一种高精度分子细胞生物学分析仪器，具有组织细胞断层扫描、活细胞动态荧光监测、三维图像重建、共聚焦图像定量分析等先进功能，在近年的细胞凋亡这一研究热点中得到了大量创造性的应用。本文拟就对激光扫描共聚焦显微镜在凋亡的形态学、分子水平变化及重要生理过程三方面研究中的应用及其成果做一综述。细胞凋亡(apoptosis)是不同于细胞坏死的一种细胞主动死亡方式，并由特定的基因控制。凋亡细胞在形态上出现变圆皱缩、染色质浓缩边集、核碎裂、凋亡小体形成等变化，并最终由非炎症过程清除。由于细胞凋亡独特地影响着机体的细胞发育和代谢，在监测和清除肿瘤细胞与突变细胞等方面也可能发挥重要的作用，近年来受到了细胞生物学、分子生物学、免疫学等多学科的广泛关注。激光扫描共聚焦显微镜(laser scaing confocal microscopy, LSCM)是80年代发展起来的一种高精度分子细胞生物学分析仪器，辅以各类免疫荧光探针或荧光染料与被测物质特异性结合，不仅可观察固定的细胞组织切片，还可对活细胞的结构、分子和离子进行实时动态地观察和检测。在细胞凋亡的研究中，激光扫描共聚焦显微镜已被广泛地应用于形态学、分子水平监测及重要生理改变等各方面，其中不乏新颖之处，并获得了大量成果，以下将就此做一简单的介绍。激光扫描共聚焦显微镜与凋亡的形态学激光扫描共聚焦显微镜用点光源扫描标本的光学横断面，以代替普通光学显微镜所使用的场光源，并用探测针孔滤去离焦光线，所以消除了来自焦平面以外的衍射或散射光的干扰，可实现高清晰、高分辨率的组织细胞断层扫描。并且由于激光扫描共聚焦显微镜采用数字化成像，因而辅以一定的软件就能对图像进行定量分析及三维重建等操作。过去对细胞凋亡的形态学研究方法局限于活性细胞和组织切片染色、荧光镜观察，或者石蜡切片原位末端标记法。由于普通光镜的分辨率和清晰度有限，而电镜又显然不适合对凋亡这一复杂动态过程的监测，激光扫描共聚焦显微镜的应用使人们对细胞凋亡的形态学观察分析提高到了一个前所未有的新水平。细胞核核膜的破坏对于染色质聚集并形成凋亡小体起重要作用。lamin是构成核片层的蛋白质，位于核膜的内表面，由caase-6介导的lamin裂解可影响核膜的完整性。在McCall等的研究中，对果蝇卵子发生晚期的细胞凋亡现象进行了动态观察。以单抗mAb101标记其哺育细胞核内膜的laminDm0（哺乳类laminB的同源体），用激光扫描共聚焦显微镜加以观察。正常哺育细胞到11期时，染色的lamin呈弥散的雾状分布并围绕核周，而dcp-1GLC哺育细胞即使到了较晚的14期时，仍然显示界线明确的染色。可见dcp-1突变体在核lamin蛋白的酶切或解聚方面存在缺陷。细胞器Li 等在对C(6)-酰基鞘氨醇诱导胞内囊泡产生的研究中，在不产生中毒效应的情况下，加入10microM C(6)-酰基鞘氨醇以诱导鼠纤维母细胞(3T3-L1和3T3-F442A)凋亡。观察到囊泡的形成与C(6)-酰基鞘氨醇的诱导呈时间依从和剂量依从关系。大量小泡在其加入后8小时内出现，并且随时间而增大；大泡最终分布在核周，而小泡分布在细胞边缘。用抗-溶酶体膜蛋白抗体和共聚焦免疫荧光显微分析，证明增大的囊泡为晚期内吞体/溶酶体。另外，胞内的细胞器都有其适用的荧光探针，如高尔基复合体常用的探针有Dceramide、BODIPY ceramide等，内质网常用的有Dil、DiOC6等，经标记均可进行精细的观察。当然，激光扫描共聚焦显微镜在形态学中的优势更在于其对图像的三维重建功能，从而揭示过去只能在平面上显现的凋亡细胞在三维空间中的结构；而对细胞凋亡的动态过程，它可以用三维加时间的四维方式进行观察，来获取最逼真的形态学资料。凋亡过程中一些特征性的三维形态变化正期待着进一步具体的工作去发现。激光扫描共聚焦显微镜对凋亡细胞的分子水平监测随着分子生物学突飞猛进的发展，关于细胞凋亡分子机制的研究已有了很大的突破。细胞凋亡的信号传递途径及其调控涉及到大量的酶级联反应、生物大分子的空间转移等。而激光扫描共聚焦显微镜以其定性、定量、定时的优点，结合众多荧光探针的应用，成为了研究细胞凋亡分子水平变化的有力手段。DNA大分子DNA断裂以及染色质的异常凝聚，是细胞凋亡的关键，同时也是细胞核在细胞凋亡中具有标志性的变化。Columbara等报道将激光扫描共聚焦显微镜与原位TdT和Poll免疫荧光技术相结合，进而确定双链和单链DNA的断裂点。而在对细胞凋亡和细胞坏死区别的研究中，Kreel等在培养的K562细胞中加入放线菌素D以诱导凋亡，并对细胞的DNA片段进行了3’-末端标记。经激光扫描共聚焦显微镜观察发现K562细胞凋亡早期有大量DNA片段出现，且DNA片段弥散分布于除核仁外的细胞核区。伴随着凋亡的进展，细胞核内出现大量高标记密度的圆形小体。而采用NaN3或快速冻融法使细胞坏死，经激光扫描共聚焦显微镜观察证实，在坏死开始阶段并无DNA片段的出现，至少在坏死发生24小时后才有DNA片段产生。Caase家族Caases是一组高度保守的半胱氨酸蛋白酶，目前发现有11个成员。多数细胞凋亡是以Caase家族蛋白的激活并作用于其关键底物而实现的，而caases激活的关键又在于该家族蛋白间的级联反应，因此caases被认为是细胞凋亡的中心环节和执行者，成为研究的热点。Mandal等用激光扫描共聚焦显微镜对细胞凋亡中激活的caase-3的重分布进行了研究。用丁酸处理细胞后，观察到DNA-PKcs的裂解与caase-3的激活成正相关，而Bcl-2的过度表达则可抑制上述两个过程。同时还证明（1）激活后的caase-3重分布到核区，（2）裂解局部的DNA-PKcs和PARP（polyADP-ribosepolymerase，聚腺苷二磷酸核糖多聚酶），（3）裂解产物又被释放到核外的细胞液。caase-3的抑制物四肽DEVD-CHO又可抑制上述的三个连续的步骤。该研究提示：激活的caase-3在核内的重分布构成了丁酸所诱导的细胞凋亡中的一个重要凋亡信号。另外，在用激光扫描共聚焦显微镜对Q79诱导大鼠神经元凋亡的研究中，Sanchez等发现了Q79对caase-8的聚集和激活，而对caase-8的抑制则阻止了被诱导的细胞凋亡；加以Westernblot分析，还建立了caase-8的激活和某些神经退行性疾病（如舞蹈病）的联系。Grazyme丝氨酸蛋白酶grazyme为另一种重要的凋亡信号分子，对某些caase家族蛋白也有激活作用。Trapani等就证明了杀伤淋巴细胞利用穿孔素和grazymeB的协同作用来诱导靶细胞的凋亡，在其研究中通过激光扫描共聚焦显微镜观察到（1）50%细胞的胞核内快速聚集了以FITC荧光标记的grazymeB（最长7分钟，t1/2为2分钟），然后发生凋亡；（2）其它的细胞只有细胞液内有FITC-grazyme B的摄取，避免了凋亡。此间至少在13分钟后才有DNA碎片的出现，说明核内的grazyme B聚集出现在凋亡的执行阶段之前。并且通过对核内液的处理（加入70KDa FITC-dextran），间接观察到grazyme B的转移并非是因为核膜受caases的作用而破损，而是由于穿孔素的协同。其它以上的介绍显示，激光扫描共聚焦显微镜在检测活细胞酶活性动态变化方面有着突出的优势。实际上，对于细胞凋亡的分子机制这样一个极其复杂的课题，激光扫描共聚焦显微镜的应用远不只限于上述的几种离子和大分子，而是渗透到了大量的分枝课题中去。如在对重要的凋亡负调控蛋白Bcl-2的研究中，Beham等利用基因毒性损害（genotoxic damage）诱导细胞凋亡，并以Bcl-2蛋白抑制其凋亡过程。用激光扫描共聚焦显微镜和Immunoblotting观察显示，Bcl-2的作用在于阻止了诱导产生的p53蛋白向核内的转运。而Ohsawa等对独立于caase家族的另一种重要蛋白酶—组织蛋白酶进行了研究，用血清剥夺法诱导PC12细胞凋亡，并用激光扫描共聚焦显微镜监测了其精细超微结构改变过程和细胞内组织蛋白酶B和D的免疫活度的对比变化。又如，在人胰岛淀粉样多肽（hIA）的研究中，Hiddinga等用表达hIA的质粒转染COS-1细胞诱导凋亡，辅以免疫组化染色，用激光扫描共聚焦显微镜证明了hIA在细胞的内质网和高尔基复合体内呈簇状沉积，并与细胞

  • 激光扫描共聚焦显微镜在细胞生物学中的应用

    激光扫描共聚焦显微镜是近十年发展起来的医学图像分析仪器，与传统的光学显微镜相比，大大地提高了分辨率，能得到真正具有三维清晰度的原色图像。并可探测某些低对比度或弱荧光样品，通过目镜直接观察各种生物样品的弱自发荧光。能动态测量Ca2+ 、pH值，Na+、Mg2+等影响细胞代谢的各种生理指标，对细胞动力学研究有着重要的意义。同时激光扫描共聚显微镜可以处理活的标本，不会对标本造成物理化学特性的破坏，更接近细胞生活状态参数测定。可见激光扫描共聚焦显微镜是普遍显微镜上的质的飞跃，是电子显微镜的一个补充，现已广泛用于荧光定量测量，共焦图像分析，三维图像重建、活细胞动力学参数分析和胞间通讯研究等方面，在整个细胞生物学研究领域有着广阔的应用前景。1. 定量荧光测量ACAS可进行重复性极佳的低光探测及活细胞荧光定量分析。利用这一功能既可对单个细胞或细胞群的溶酶体，线粒体、DNA、RNA和受体分子含量、成份及分布进行定性及定量测定，还可测定诸如膜电位和配体结合等生化反应程度。此外，还适用于高灵敏度快速的免疫荧光测定，这种定量可以准确监测抗原表达，细胞结合和杀伤及定量的形态学特性，以揭示诸如肿瘤相关抗原表达的准确定位及定量信息。2. 定量共聚焦图像分析借助于ACAS激光共焦系统，可以获得生物样品高反差、高分辨率、高灵敏度的二维图像。可得到完整活的或固定的细胞及组织的系列及光切片，从而得到各层面的信息，三维重建后可以揭示亚细胞结构的空间关系。能测定细胞光学切片的物理、生物化学特性的变化，如DNA含量、RNA含量、分子扩散、胞内离子等，亦可以对这些动态变化进行准确的定性、定量、定时及定位分析。3. 三维重组分析生物结构ACAS使用SFP进行三维图像重组，SFP将各光学切片的数据组合成一个真实的三维图像，并可从任意角度观察，也可以借助改变照明角度来突出其特征，产生更生动逼真的三维效果。4. 动态荧光测定Ca2+、pH 及其它细胞内离子测定，利用ACAS能迅速对样品的点，线或二维图像扫描，测量单次、多次单色、双发射和三发射光比率，使用诸如Indo-1、BCECF 、Fluo-3等多种荧光探针对各种离子作定量分析。可以直接得到大分子的扩散速率，能定量测定细胞溶液中Ca2+对肿瘤启动因子、生长因子及各种激素等刺激的反应，以及使用双荧光探针Fluo-3和CNARF进行Ca2+和pH的同时测定。5. 荧光光漂白恢复（FRAP）——活细胞的动力学参数荧光光漂白恢复技术借助高强度脉冲式激光照射细胞某一区域，从而造成该区域荧光分子的光淬灭，该区域周围的非淬灭荧光分子将以一定速率向受照区域扩散，可通过低强度激光扫描探测此扩散速率。通过ACAS可直接测量分子扩散率、恢复速度，并由此而揭示细胞结构及相关的机制。6. 胞间通讯研究动物细胞中由缝隙连接介导的胞间通讯被认为在细胞增殖和分化中起非常重要的作用。ACAS可用于测定相邻植物和动物细胞之间细胞间通讯，测量由细胞缝隙连接介导的分子转移，研究肿瘤启动因子和生长因子对缝隙连接介导的胞间通讯的抑制作用，以及胞内Ca2+、PH和cAMP水平对缝隙连接的调节作用。7. 细胞膜流动性测定ACAS设计了专用的软件用于对细胞膜流动性进行定量和定性分析。荧光膜探针受到极化光线激发后，其发射光极性依赖于荧光分子的旋转，而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围的膜流动性，因此极性测量间接反映细胞膜流动性。这种膜流动性测定在膜的磷脂酸组成分析、药物效应和作用位点，温度反应测定和物种比较等方面有重要作用。8. 笼锁-解笼锁测定许多重要的生活物质都有其笼锁化合物，在处于笼锁状态时，其功能被封闭，而一旦被特异波长的瞬间光照射后，光活化解笼锁，使其恢复原有活性和功能，在细胞的增值、分化等生物代谢过程中发挥功能。利用ACAS可以人为控制这种瞬间光的照射波长和时间，从而达到人为控制多种生物活性产物和其它化合物在生物代谢中发挥功能的时间和空间作用。9. 粘附细胞分选ACAS是目前唯一能对粘附细胞进行分离筛选的分析细胞学仪器，它对培养皿底的粘附细胞有两种分选方法： ① Coolie-CutterTM法，它是Meidian公司专利技术，首先将细胞贴壁培养在特制培养皿上，然后用高能量激光的欲选细胞四周切割成八角形几何形状，而非选择细胞则因在八角形之外而被去除，该分选方式特别适用于选择数量较少诸如突变细胞、转移细胞和杂交瘤细胞，即使百万分之一机率的也非常理想。 ② 激光消除法，该方法亦基于细胞形态及荧光特性，用高能量激光自动杀灭不需要的细胞，留下完整活细胞亚群继续培养，此方法特别适于对数量较多细胞的选择。10. 细胞激光显微外科及光陷阱技术借助ACAS可将激光当作“光子刀”使用，借此来完成诸如细胞膜瞬间穿孔、切除线粒体、溶酶体等细胞器、染色体切割、神经元突起切除等一系列细胞外科手术。通过ACAS光陷阱操作来移动细胞的微小颗粒和结构，该新技术广泛用于染色体、细胞器及细胞骨架的移动。

  • 激光扫描共聚焦显微镜在医学领域中的应用

    一、在细胞及分子生物学中的应用1. 细胞、组织的三维观察和定量测量 共聚焦显微镜的分辨率超过普通光学显微镜，染色过程简便，可以在活细胞上进行无创伤性的染色，最大程度地维持细胞的正常形态。多种自发性的荧光染料，已被广泛地用于诸如RNA、DNA细胞核、线粒体、内质网、肌动蛋白、细胞膜等结构的标记。运用免疫荧光技术，将不同波长的两三种荧光物质标记在内部不同结构的相应抗体上，以这几种荧光物质特定的光谱特性选择激发光和滤光片，则可以观察到细胞内部各结构间的毗邻关系。特别是在荧光着丝点易被遮盖（如荧光原位杂交实验）的情况下，这种三维图像的多角度观察提供了极大的优越性。细胞有丝分裂中细胞核内染色体数目（双倍体、多倍体）、形态和位置的变化，一直是细胞生物学肿瘤研究中的热点。着丝点是细胞核内的重要结构，被认为在有丝分裂中起重要的作用，应用共聚焦显微镜的定量测量技术，可以较精确地测定着丝点在不同分裂期的位置。共聚焦显微镜生成厚度小于0.2微米的依次相连的光学切片，即使较厚的组织的三维数据也可被计算机获取，运用适当的图像分析软件，可以测量并确定所观察结构的表面特征，体积等参数，为相互结合定量测量提供了新手段。2. 活细胞生理信号的动态监测：活细胞的功能监测在细胞生物学、神经生理学、药理学等领域都有重要意义。许多荧光染料可以聚集在细胞的特定结构，而对细胞的活性基本上不产生影响。可以利用这一特性来反映细胞受到刺激后形态或功能的改变。如亲脂性染料DiOC6（3）主要聚集在内质网，且对细胞的毒副作用极小。肌细胞中的肌浆网与ER有相同的属性，是胞内钙库，应用共聚焦显微镜，就可以动态观察肌细胞兴奋时SR的变化。许多参与神经元兴奋传导的离子如K+、Na+、Ca2+及H+、Cl-、Mg2+ 等，都有其自发性的荧光染料。Ca2+ 在细胞的兴奋、分化、死亡等过程中都起重要作用，是许多生理反应的胞内第二信使，是目前研究得最为充分的离子; 通过激光扫描共聚焦显微镜对胞内、核内钙转移的研究、对心肌细胞的钙变化研究、免疫细胞钙信号的研究、对Ca2+信号在凋亡细胞中作用的研究都取得了可喜的结果，而更多的研究则是将激光扫描共聚焦显微镜应用于神经生物学中对神经元Ca2+动态测量的研究。目前激光扫描共聚焦显微镜以其独特的优势成为钙研究中的重要手段之一。3. 粘附细胞的分选(adherent cell sorting) 对特异细胞的分选和克隆，是研究单个细胞或细胞系生物特性的先决条件。 将细胞贴壁培养在特制培养皿上，培养皿底部有一层特殊的膜，用高能量激光在欲选细胞四周切割成八角形几何形状，掀去培养皿底部的膜，非选择细胞则被去除。目前对粘附细胞分选方法多用于对杂交瘤和突变细胞的分选，也有用于对经转化的平滑肌细胞，卵巢癌细胞及人畸胎瘤干细胞等的分选和克隆，还可用于基因调控、基因治疗等研究。4. 细胞激光显微外科和光陷阱功能： 激光扫描共聚焦显微镜可将激光当作一把“光刀子”使用，完成诸如细胞膜瞬间穿孔，染色体切割，神经元突起切除等一系列细胞外科手术。光镊是利用激光的力学效应，将一个微米级大小的细胞或其它结构钳制于激光束的焦平面上，也称为光陷阱。光镊可以用来进行细胞融合（如卵细胞受精）、机械刺激或细胞骨架弹性测量等，特别是在测量植物细胞的细胞骨架时很有意义。5. 光漂白后的荧光恢复（FRAP）: 细胞在相互接触后彼此间即有低阻抗的通道形成，以进行细胞间通讯；被经合成肽测试法证明只允许低于1.5KD分子通过的通道被称作缝隙连接。缝隙连接是存在于相邻细胞间的一类蛋白通道，普遍认为缝隙连接通过介导细胞间的信息传递，在诸如增殖、分化、代谢等过程中发挥极其重要作用。FRAP技术借助脉冲式激光照射细胞的某一区域，从而该区域荧光分子的光淬灭，该区域周围的未淬灭的荧光分子将以一定速率向受照区域扩散，而此扩散速率可通过低强度激光扫描探测。在研究细胞骨架构成、跨膜大分子迁移率、细胞膜流动性、胞间通讯等领域中有较大的意义。6. 在细胞凋亡研究中的应用细胞凋亡是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程，细胞凋亡作为生理性、主动性过程，能够确保正常发育、生长、维持内环境稳定，发挥积极的防御功能。用激光扫描共聚焦显微镜观察凋亡细胞，可见凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩，细胞核变小，出现染色质沿核膜内侧排列的核边聚集现象。细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。细胞凋亡（Apoposis）是生物体内广泛存在的，由细胞特定基因控制，以细胞DNA 降解为特征的细胞自发过程，与机体中多种生理及病理过程密切相关。因而，对Apoposis 的研究现已成为研究细胞生物学研究的热点之一。而激光扫描共聚集显微镜结合众多荧光探针的应用，成为细胞Apoposis超微结构及分子水平变化的有力手段。二、在神经科学中的应用1. 定量荧光测定：对活细胞进行定量测定，具有很好的重复性，分析神经细胞和胶质细胞的某些物理及生物化学特性；监测抗原表达，细胞结合和杀伤等特征。在多发性硬化病人大脑活检标本上观察病变组织的微血管内皮细胞特异性地表达。2. 细胞内离子的测定：使用多种荧光探针，对神经细胞的Ca2+、PH及其它各种细胞内离子进行定量和动态分析。3. 神经细胞的形态学观察：激光扫描共聚焦显微镜使用模拟荧光处理，可将系列光学切片的数据合成三维图像，并可从任意角度观察。如Joshi等观察了细胞突触的骨架的三维图像。三维重建图像可使神经细胞及细胞器的形态学结构更加生动逼真。三、在耳鼻喉科学中的应用1. 在内耳毛细胞亚细胞结构研究上的应用：1993年Ikeda等应用激光扫描共聚焦显微镜研究内耳毛细胞的亚细胞结构，用Rhodamine 123染色，见线粒体分布于表皮板下和核下，加入1mmol/L三硝基酚使线粒体膜电位减小，荧光强度明显减弱。用DIOC6（3）染色，观察到内质网分布于表皮板下直至细胞核区域，呈网状、核下及侧膜下也有分布，胞质中则极少，探讨了蛋白激酶（PKC）在三磷酸肌醇/钙信号系统中的作用。2. 激光扫描共聚焦显微镜的荧光测钙技术在内耳毛细胞研究中的应用钙离子在细胞的生命活动中起着重要作用，它参与调节细胞功能，如肌肉收缩，细胞运动，递质合成与释放，信息传递，细胞换能等。激光扫描共聚焦显微镜的荧光测钙技术可探测到细胞内钙浓度的细微变化，当内耳毛细胞受到各种生理及病理因子刺激时，可用荧光测钙技术观察细胞内钙离子浓度的变化。为研究毛细胞的机能提供了新的手段。3. 激光扫描共聚焦显微镜在内耳毛细胞离子通道研究上的应用Issa等用膜片钳的全细胞记录法将Fluo-3已导入毛细胞，用激光扫描共聚焦显微镜观察，当毛细胞去极化时其底部侧膜上平均有18个亮点（钙内流所至），然后对同一毛细胞进行连续超薄切片电镜观察，证明这些亮点即为突触前活性区。4. 激光扫描共聚焦显微镜在嗅觉研究中的应用：Schild等用激光扫描共聚焦显微镜和钙荧光探针研究嗅觉感受器神经元的钙通道分布，以Fluo-3和Fura-red 染色后行双发射比例测量，测出其胞内游离钙呈不均匀分布，观察显示嗅觉感受器神经元的钙通道位于胞体部，与同一部位的钾通道一起构成适应性调节机制，而对树突尖端纤毛的钙依赖性换能过程无干扰。四、在肿瘤研究中的应用激光扫描共聚焦显微镜的出现，在一定程度上推动了肿瘤的研究进展。它为肿瘤细胞生物学、分子生物学、细胞通讯、细胞形态学研究、细胞的抗药物代谢、细胞膜及其受体等领域的研究，提供了有效手段。1. 定量免疫荧光测定：激光扫描共聚焦显微镜采用免疫荧光对肿瘤细胞的抗原表达、细胞结构特征、抗肿瘤药物的作用及机理等方面进行定量的观察和监测，为较理想的形态学观察方法。先采用荧光标记特异性抗原或抗体，使其与特异性抗体或抗原结合，再采用激光扫描共聚焦显微镜对其进行定性、定量和形态学分析。近年来报道较多的是P53肿瘤相关抗原等的定位、定性和定量分析。采用荧光标记某些蛋白分子，然后测定其平均荧光强度和积分荧光强度，从而对某些细胞结构蛋白分子进行定量分析。2. 细胞内离子分析激光扫描共聚焦显微镜可以准确地测定细胞内Ca2+ 、 K+ 、 Na+ 、 Mg2+ 、 pH等

  • 双光子激光扫描显微镜的检测模式及其在生物医学领域的应用

    双光子激光扫描显微镜的检测模式及其在生物医学领域的应用

    [align=center][b]双光子激光扫描显微镜的检测模式及其在生物医学领域的应用[/b][/align][align=center][font=宋体]刘皎[/font][sup]1[/sup]，吴晶[sup]1[/sup][/align][align=center]1. [font=宋体]北京大学医药卫生分析中心，北京，[/font]100191[/align][b][font=黑体][[/font]摘要] [/b]双光子激光扫描显微镜（two-photon laser scan microscope, TPLSM[font=宋体]）具有低光毒性、高时空分辨率、高信噪比等优点，结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术，广泛应用于脑科学、免疫学、肿瘤、胚胎发育等生物医学相关研究领域。本文结合作者所在的北京大学医药卫生分析中心共聚焦平台的工作经验，概述了[/font]TPLSM适用的样本、检测模式以及在生物医学领域的应用，以期为相关科研技术人员提供参考。[b][font=&][Abstract][/font] [/b]Two-photon laser scan microscopy (TPLSM) has the advantages of low phototoxicity, high spatial and temporal resolution, and high signal-to-noise ratio.TPLSM combines laser scanning confocal microscopy with two-photon excitationtechnology and it is widely used in brain science, immunology, tumor, embryodevelopment and other biomedical related research fields. Based on the author'swork experience in the confocal center of Peking University Medical and HealthAnalysis Center, this paper summarizes the applicable samples, detection modesand applications of TPLSM in the biomedical field, in order to provide referencefor related scientific researchers and technicians.[b][font=黑体][[/font]关键词] [/b]显微镜双光子，检测模式，应用[b]1 引言[/b]双光子激发技术的基本原理是在高光子密度情况下，荧光分子可同时吸收2个长波长光子，产生一个一半波长光子去激发荧光分子的相同效果。双光子激光扫描显微镜（two-photon laser scan microscope, TPLSM[font=宋体]）在激光扫描共聚焦显微镜的基础上，以红外飞秒激光作为光源，长波长的近红外激光受散射影响小，易穿透标本，可深入组织内部非线性激发荧光，对细胞毒性小且具有高空间分辨率，适合生物样品的深层成像及活体样品的长时间观察成像[/font][1]。使用高能量锁模脉冲激光器，物镜焦点处的光子密度最高，在焦点平面上才有光漂白及光毒性，焦点外不损伤细胞。双光子效应只发生在焦点处，所以双光子显微镜无需共聚焦针孔，也能做到点激发点探测，提高了荧光检测效率[2]。[b][/b]双光子激光扫描显微镜显微镜可以通过XYZ，XYT，XYλ，XYZT，XYλT等多种模式实现多维成像，亦可进行更复杂实验的拍摄，比如二次谐波成像（Second Harmonic Generation Imaging,SHG[font=宋体]）、双光子荧光寿命成像（[/font]Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, TP-FLIM[font=宋体]）、荧光寿命[/font]-[font=宋体]荧光共振能量转移成像（[/font]FluorescenceLifetime - Fluorescence Resonance Energy Transfer Imaging, FLIM-FRET[font=宋体]）等实验以满足对样品的定性、定量、定位、共定位等多维度多功能的研究。[/font]TPLSM已成为生命科学各领域重要的研究工具，可在细胞及亚细胞水平对活体动物的神经细胞形态结构、离子浓度、细胞运动、分子相互作用等生理现象进行直接的长时间成像监测，还能进行光激活染及光损伤等光学操纵，广泛应用于脑科学、免疫学、肿瘤、胚胎发育等生物医学相关研究[3-5]。本文拟通过按TPLSM常见的检测模式分别阐述其在生物医学领域的应用，以其为相关科研技术人员提供参考。[b]2. TPLSM适用的样本[/b]TPLSM适用的样本非常广泛，从液体、固体等形式的材料或制剂、细菌、细胞、细胞团、类器官、组织切片、到各种模式动物（如线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠、大鼠、兔、猴等）及其[font=宋体]脑、脊髓、肝脏、肺、皮肤等器官[/font]，都可以通过搭载不同载物台进行测试。相对于传统激光扫描共聚焦显微镜200μm的成像深度极限，双光子显微镜成像深度可达800μm，如果是透明化样品可更厚。TPLSM尤其适合活体动物成像，且比小动物荧光成像有更高的分辨率和信噪比，一般TPLSM的XY轴分辨率为200 nm左右，Z轴分辨率为300 nm左右。[b]3. TPLSM的检测模式[/b]3.1 二维成像模式TPLSM可以实现点扫描、点探测，得到生物样品高反差、高分辨率、高灵敏度的二维图像，从而获得细胞/组织等光学切片的物理、生物化学特性及变化。也可以对所感兴趣的区域进行准确的定性、定量及定位分析。激光扫描显微镜的zoom功能，可以用来调节扫描区域的放大倍数。但受物镜分辨率的限制，一味的增大zoom值，不能得到相应的高清图像，需根据实际情况参考piexl size进行设定。TPLSM可以实现XY、XZ或XT的二维成像模式，XT线扫会在后文与XYT时间序列成像一起进行举例说明（图2b）。3.2 三维成像模式3.2.1 Z轴序列三维成像（XYZ）[align=left]TPLSM可沿Z轴方向通过电动载物台的连续扫描对样品进行无损伤的光学切片（XYZ），获得三维立体图像。同理，通过沿Y轴方向连续扫描，可获得连续的XZY图像。如图1所示TPLSM[font=宋体]可以顺利观察到可以观察到血管清晰形态结构：单个胚胎的胎盘微血管（图[/font]1a）、肝脏血窦微血管（图1b）和后肢微血管（图1c）[6]。[/align][align=center][img=,690,230]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/12/202212151626576232_4807_3237657_3.png!w690x230.jpg[/img][/align][align=center]图1（a）胚胎胎盘微（b）肝脏血窦和（c）后肢的微血管三维成像[/align]3.2.2 时间序列扫描模式（XYT）[align=left]按照一定的时间间隔重复采集，则可实现对该样品的实时监测（XYT）。此类实验可观察组织区域内特异荧光探针标记的单个细胞或细胞内不同部位接受刺激后的整个变化过程。[font=宋体]如图[/font]2[font=宋体]（[/font]a[font=宋体]），可以根据微血管[/font]XYT[font=宋体]序列扫描的成像结果中某一血细胞在前后两张图的位置移动和这两帧图的扫描时间间隔计算血流速度。若血流速度很快，[/font]XYT扫描不足以捕捉实际流速，可以使用XT线扫计算。如图2（b），微血管XT扫描图像中绿色荧光背景里的黑色线条代表单个血细胞的流动轨迹，每条线条的横坐标代表血细胞移动的距离（distance / μm[font=宋体]），纵坐标代表此段时间（[/font]time/ ms[font=宋体]），根据这两个数据可以计算出单位时间内血细胞的流动速度（[/font]μm / ms）[6]。[/align][align=center][img=,690,262]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/12/202212151627102569_8367_3237657_3.png!w690x262.jpg[/img] [/align][align=center]图2 微血管（a）XYT扫描结果和（b）XT一维扫描结果图像计算血流说明示意图[/align]3.2.3 光谱扫描模式（XYλ/XYΛ）通常配置有可调节接受范围的检测器的TPLSM，可以实现从400nm-800nm的发射波谱扫描。通过配置具有连续可调波长的双光子激光器，还可以实现750nm-1300nm激发波谱扫描。这对于开发研制特殊染料探针的课题来说是很方便、全面的检测功能。3.3四维成像模式（XYZT/XYλT/XYΛT）基于上述三维成像模式，结合时间序列扫描，可以实现TPLSM的四维成像。3.4二次谐波成像（SHG）SHG是一个二阶非线性过程，且一般为非共振过程，适合富含胶原纤维的样本成像，如角膜、鼠尾肌腱、皮肤等。生物组织产生的二次谐波最主要的转换源自胶原，不同生物组织中的二次谐波信号强弱与组织中的胶原含量密切相关，含胶原丰富的组织包括结缔组织和肌肉组织等二次谐波信号也比较强，另外还有一些能产生强二次谐波的生物结构是微管，如细胞分裂中纺锤体。对于具有中心对称性的生物结构，如果局部中心对称性的破坏也会产生二次谐波：在两中心对称介质的界面，不同物态分子的相互作用使局部微观场特性在交界面（如细胞膜）发生突变，从而产生界面二次谐波[7]。除了动物组织外，一些含有特殊分子结构的植物组织也能产生二次谐波。二次谐波显微成像具有高空间分辨率、深成像深度、低损伤、以及对结构对称性的高度敏感性的特点，如果能与其他成像技术结合，将成为生物样品研究的有力工具[8]。3.5双光子荧光寿命成像（TP-FLIM）[9]FLIM技术是研究细胞内生命活动状态的一种非常可靠的方法。荧光寿命是荧光团在返回基态之前处于激发态的平均时间，是荧光团的固有性质，因此其不受探针浓度、激发光强度和光漂白效应等因素影响，且能区分荧光光谱非常接近的不同荧光团，故具有非常好的特异性和很高的灵敏度。此外，由于荧光分子的荧光寿命能十分灵敏地反映激发态分子与周围微环境的相互作用及能量转移，因此FLIM技术常被用来实现对微环境中许多生化参数的定量测量，如细胞中折射率、黏度、温度、pH值的分布和动力学变化等，这在生物医学研究中具有非常重要的意义。目前FLIM技术在细胞生物学中一些重要科学问题的研究、临床医学上一些重大疾病的诊断与治疗研究以及纳米材料的生物医学应用研究等方面均有广泛应用，并取得了许多利用传统的研究手段无法获取的数据。FLIM检测需要脉冲激光，TPLSM带有的高能量锁模脉冲激光器可以满足激发要求。3.6荧光寿命-荧光共振能量转移成像（FLIM-FRET）[10]传统的FRET过程分析通常是基于荧光强度成像来实现，分析的结果容易受光谱串扰的影响。而将FLIM技术应用于FRET过程分析，利用FLIM技术可定量测量这一优势，可非常灵敏地反映供体荧光分子与受体荧光分子之间的能量转移过程。当受体分子与供体之间的距离10nm时，供体的能量转移到受体，受体从基态发生能量跃迁，从而影响供体的荧光寿命。与没有受体分子的时候相比，发生FRET的供体分子的荧光寿命降低。因此，FRET-FLIM联合能够实时监测生物细胞中蛋白质的动态变化，如蛋白质折叠、分子间（蛋白-蛋白，蛋白-核酸）相互作用和细胞间信号分子传递、分子运输以及病理学研究等。[b]4 结论和展望[/b]综上，TPLSM应用灵活，具备多种检测模式，适用于多种样本，亦可实现多种实验目的，如荧光的定量、定性、定位、共定位，动态荧光的测定等。一些特殊的实验模式，将TPLSM在生物医学领域的应用进一步扩大。通过结合其他技术（多手段联合拓展，如膜片钳、原子力显微镜、光电联用等），TPLSM必将成为助力生物医学领域研究的有力工具。双光子荧光成像由于具有天生的三维层析能力以及深穿透能力，在活体生物组织成像上广受欢迎。双光子显微镜镜下空间增大后，可广泛应用于猴、大小鼠、兔等较大的模式动物的活体成像。且可结合电生理技术、光遗传技术，广泛应用于麻醉、清醒或运行行为等生理状态下的动物脑科学神经相关研究，在单细胞、单树突精度上对神经元群体活动进行监控。如结合膜片钳技术，对活体脑组组急性切片神经元进行双光子深层成像[11]；结合光遗传技术，实现视觉皮层同一神经元和神经元群体的稳定操控和长期多次重复记录[12]；对在健身球上移动的头部固定小鼠小脑进行成像，探讨觉醒状态和运动行为对胶质网络中钙离子的激发的影响[13]；结合多种疾病模型，探讨大脑皮层神经元及胶质细胞活性的改变及作用等[14]。随着多种双光子显微镜系统的出现，双光子显微镜成像技术将以其实时、无损地探测、诊断及检测能力，在生物医药及临床医学应用中发挥更大作用。[b]参考文献[/b][1] [font=宋体]李娟[/font],[font=宋体]张岚岚[/font],[font=宋体]吴珏珩[/font].[font=宋体]双光子显微镜的应用优势与维护要素[/font][J].[font=宋体]中国医学装备[/font],2021,18(12):158-163.[2] HendelT,Mank M, Schnell B,et al.Fluorescence changes of genetic calcium indicatorsand OGB1correlated with neural ac tivity and calcium in vivo and in vitro[J].JNeurosci, 2008,28(29):7399-7411.[3] DolginE.What leva lamps and vinaigrette can teach us about cellbiology[J].Nature,2018,555(7696):300-302.[4] Noguchi J,Nagaoka A, Watanabe S,et al.in vivo two-photon uncaging of glutamate revealingthe structure-function relatio nships of dendritic spines in the neocortex ofadult mice[J]. J Physiol,2011,589(Pt 10):2447-2457.[5] BishopD,Nikiél, Brinkoetter M,et al.Nearinfrared branding efficiently correlateslight and electron microscopy[J]. Nat Methods,2011,8(7):568-570.[6] [font=宋体]刘皎[/font],[font=宋体]丛馨[/font],[font=宋体]何其华[/font].[font=宋体]活体小鼠微血管血流倒置双光子激光扫描显微镜检测方法的建立[/font][J].解剖学报,2022,53(02):261-265.[7] [font=宋体]屈军乐[/font],[font=宋体]陈丹妮[/font],[font=宋体]杨建军[/font],[font=宋体]许改霞[/font],[font=宋体]林子扬[/font],[font=宋体]刘立新[/font],[font=宋体]牛憨笨[/font].[font=宋体]二次谐波成像及其在生物医学中的应用[/font][J].[font=宋体]深圳大学学报[/font],2006,(01):1-9.[8] [font=宋体]孙娅楠[/font],[font=宋体]赵静[/font],[font=宋体]李超华[/font],[font=宋体]等[/font].[font=宋体]二次谐波结合双光子荧光成像方法观察人源胶原蛋白透皮吸收情况[/font][J].激光生物学报,2017,26(1):24-29.[9] [font=宋体]刘雄波，林丹樱，吴茜茜，严伟，罗腾，杨志刚，屈军乐，荧光寿命显微成像技术及应用的最新研究进展。物理学报，[/font]2018,67（17）：178701-1-178701-14[10] [font=宋体]罗淋淋，牛敬敬，莫蓓莘，林丹樱，刘琳，荧光共振能量转移[/font]-荧光寿命显微成像（FRET-FLIM[font=宋体]）技术在生命科学研究中的应用进展。光谱学与光谱分析，[/font]2021,41（4）：1023-1031[11] Isom-BatzG,Zimmem PE.Collagen injection for female urinary incontinence after urethralor periurethral surgery[J].J Unol,2009,181(2):701-704.[12] JuN,Jiang R,Mrcknik SL,et al.Long-term all-optical interrogation of corticalneurons in awake-behaving nonhuman prim ates[J].LOSBiology,2018,16(8):e2005839.[13]Nimmerjahn A,Mukamel EA, Schnitzer MJ.Motor behavior activates Bergmann glialnetworks[J].Neuron,2009,62(3):400-412.[23] Huang L, Lafaille JJ, YangG.LearningDependent dendritic spine plasticity is impaired in spontaneousautoimmune encep halomyelitis[J].Dev Neurobiol,2021,81(5):736-745.[14] Huang L,Lafaille JJ,Yang G.LearningDependent dendritic spine plasticity is impaired inspontaneous autoimmune encep halomyelitis[J].Dev Neurobiol, 2021,81(5):736-745.

  • 共聚焦激光扫描显微镜的研制

    [b][font='Microsoft YaHei', 宋体, sans-serif]【序号】：１[/font]【作者】：[/b][font=&][size=12px][color=#1c1d1e][b]周一览[/b][/color][/size][/font][font='Microsoft YaHei', 宋体, sans-serif][b][b][/b][/b][/font][font=&]【题名】：[/font][b][b][color=#333333][b][font=&][color=#032d2c][b]共聚焦激光扫描显微镜的研制[/b][/color][/font][/b][/color][/b][/b][font=&]【期刊】：[/font][font=Arial][font=&][size=12px]CNKI[/size][/font][/font][font='Microsoft YaHei', 宋体, sans-serif][color=#545454][b]【链接】：[url=https://link.springer.com/book/10.1007/978-0-387-45524-2]共聚焦激光扫描显微镜的研制 - 中国知网 (cnki.net)[/url][/b][/color][/font]

  • 【分享】激光雷达/激光探测及测距系统

    【分享】激光雷达/激光探测及测距系统

    激光雷达可以按照所用激光器、探测技术及雷达功能等来分类。目前激光雷达中使用的激光器有二氧化碳激光器，Er:YAG激光器，Nd：YAG激光器，喇曼频移Nd：YAG激光器、GaAiAs半导体激光器、氦-氖激光器和倍频Nd：YAG激光器等。其中掺铒YAG激光波长为2微米左右，而GaAiAs激光波长则在0.8-0.904微米之间。根据探测技术的不同，激光雷达可以分为直接探测型和相干探测型两种。其中直接探测型激光雷达采用脉冲振幅调制技术（AM），且不需要干涉仪。相干探测型激光雷达可用外差干涉，零拍干涉或失调零拍干涉，相应的调谐技术分别为脉冲振幅调制，脉冲频率调制（FM）或混合调制。按照不同功能，激光雷达可分为跟踪雷达，运动目标指示雷达，流速测量雷达，风剪切探测雷达，目标识别雷达，成像雷达及振动传感雷达。激光雷达最基本的工作原理与无线电雷达没有区别，即由雷达发射系统发送一个信号，经目标反射后被接收系统收集，通过测量反射光的运行时间而确定目标的距离。至于目标的径向速度，可以由反射光的多普勒频移来确定，也可以测量两个或多个距离，并计算其变化率而求得速度，这是、也是直接探测型雷达的基本工作原理。由此可以看出，直接探测型激光雷达的基本结构与激光测距机颇为相近。相干探测型激光雷达又有单稳与双稳之分，在所谓单稳系统中，发送与接收信号共同在所谓单稳态系统中，发送与接收信号共用一个光学孔径。并由发射/接收（T/R）开头隔离。T/R开关将发射信号送往输出望远镜和发射扫描系统进行发射，信号经目标反射后进入光学扫描系统和望远镜，这时，它们起光学接收的作用。T/R开关将接收到的辐射送入光学混频器，所得拍频信号由成像系统聚焦到光敏探测器，后者将光信号变成电信号，并由高通滤波器将来自背景源的低频成分及本机振荡器所诱导的直流信号统统滤除。最后高频成分中所包含的测量信息由信号和数据处理系统检出。双稳系统的区别在于包含两套望远镜和光学扫描部件，T/R开关自然不再需要，其余部分与单稳系统的相同。美国国防部最初对激光雷达的兴趣与对微波雷达的相似，即侧重于对目标的监视、捕获、跟踪、毁伤评（SATKA）和导航。然而，由于微波雷达足以完成大部分毁伤评估和导航任务，因而导致军用激光雷达计划集中于前者不能很好完成的少量任务上，例如高精度毁伤评估，极精确的导航修正及高分辨率成像。较早出现的一种激光雷达称为“火池”，它是由美国麻省理工学院的林肯实验室投资，于60年代末研制的。70年代初，林肯实验室演示了火池雷达精确跟踪卫星，获得多普勒影像的能力。80年代进行的实验证明，这种CO2激光雷达可以穿透某些烟雾，识破伪装，远距离捕获空中目标和探测化学战剂。发展到80年代末的火池激光雷达，采用一台高稳定CO2激光振荡器作为信号源，经一台窄带CO2激光放大器放大，其频率则由单边带调制器调制。另有工作于蓝-绿波段的中功率氩离子激光与上述雷达波束复合，用于对目标进行角度跟踪，而雷达波束的功能则是收集距离――多普勒影像，实时处理并加以显示。两束波均由一个孔径为1.2M的望远镜发射并接收。据报道，美国战略防御局和麻省理工学院的研究人员于1990年3月用上述装置对一枚从弗吉尼亚大西洋海岸发射的探空火箭进行了跟踪实验。在二级点火后6分钟，火箭进入亚轨道，即爬升阶段，并抛出其有效负载，即一个形状和大小均类似于弹道导弹再入飞行器的可充气气球。该气球有气体推进器以提供与再入飞行器和诱饵的物理结构相一致的动力学特性。目标最初由L波段跟踪雷达和X波段成像雷达进行跟踪。并将这些雷达传感器取得的数据交给火池激光雷达，后者成功地获得了距离约800千米处目标的像。[~116966~][~116967~][~116968~][img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/01/201701191651_624049_1602049_3.jpg[/img]

  • 【分享】“凤凰号”火星探测器携带七种探测仪器

    “凤凰号”火星探测器携带七种探测仪器 “凤凰号”探测器是一个由3条腿支持的平台，平台直径1.5米，高约2.2米，其中心是一个多面体仪器舱，舱左右两侧各展开一面正八边形太阳能电池阵，跨度5.52米。与“火星极地着陆器”相比，“凤凰号”探测器的最大变化是提高了太阳能电池的性能。 “凤凰号”探测器将携带7种科学探测仪器，分别是： (1)机械臂(RA) 它是“凤凰号”探测器上最重要的设备，用以挖取火星表面及表面下层的土壤样品。它将挖得的样品送入着陆器搭载的“显微镜电化学与传导性分析仪”和“热与气体分析仪”中进行化验分析。 机械臂长2.35米，有4个自由度，末端装有锯齿形刀片和波纹状尖锥，能在坚硬的极区冻土表面，挖掘1米的深坑。机械臂还可为装在臂上的相机调整指向，引导测量热与电传导性的探测器插入土壤。 (2)显微镜电化学与传导性分析仪(MECA) 它是在“火星勘探者”计划中用的仪器基础上略加改进而成，包括湿化学实验室、光学显微镜、原子力显微镜和热与电传导性探测器4台仪器，用以检测土壤的元素成分以及给土壤样品拍摄成像。 (3)热与气体分析仪(TEGA) 它包括微分扫描热量计和质谱仪两部分，用以对土壤样品的吸热和散热过程进行观测记录，并对加热后释放出的挥发物进行分析。 (4)表面立体成像仪(SSI) 用以测绘高分辨率的地质图和机械臂作业区地图，进行多光谱分析和大气观测。 (5)机械臂相机(RAC) 用以拍摄机械臂采集的土壤样品的高分辨率图像，分析土壤颗粒的类型和大小。 (6)火星下降成像仪(MARDI) 用以在“凤凰号”下降过程中拍摄火星表面，堪察着陆点附近的地质情况。 (7)气象站(MS) 这是为“凤凰号”着陆器惟一专门研制的新仪器。它由激光雷达和温度压力测量装置两部分组成，用以了解当地大气的特性。

  • 共聚焦激光扫描光学显微成像关键技术研究

    [b][font='Microsoft YaHei', 宋体, sans-serif]【序号】：１[/font]【作者】：[/b][font=&][size=12px][color=#1c1d1e][b][b]魏通达[/b][/b][/color][/size][/font][font='Microsoft YaHei', 宋体, sans-serif][b][b][/b][/b][/font][font=&]【题名】：[/font][b][b][color=#333333][b][font=&][color=#032d2c][b]共聚焦激光扫描光学显微成像关键技术研究[/b][/color][/font][/b][/color][/b][/b][font=&]【期刊】：[/font][font=Arial][font=&][size=12px]CNKI[/size][/font][/font][font='Microsoft YaHei', 宋体, sans-serif][color=#545454][b]【链接】：[url=https://link.springer.com/book/10.1007/978-0-387-45524-2]共聚焦激光扫描光学显微成像关键技术研究 - 中国知网 (cnki.net)[/url][/b][/color][/font]

  • S-3400N灯丝扫描电镜做能谱分析时能谱探测器显示关闭

    我是一名学生，经过培训已经会熟练操作扫描电镜一些常用的操作。暑假老师让留下做实验，申请使用S-3400N灯丝扫描电镜，于7月31日是我最后一次操作，当天有拍图像及做能谱分析，我很确定这一天仪器没有任何异常。第二天回家了，于今天返校，结果实验室老师说今天开机做扫描想做能谱分析能谱探测器显示关闭，问工程师工程师也不清楚，说要过来检查机器才能确定。有大神知道是什么原因吗？扫描电镜可以拍照，但能谱仪探测器显示关闭。

  • 激光扫描系统中f-θ透镜的光学设计

    [b][font='Microsoft YaHei', 宋体, sans-serif]【序号】：１[/font]【作者】：[/b][font=&][size=12px][color=#1c1d1e][b][b]张双翼 徐熙平[/b][/b][/color][/size][/font][font='Microsoft YaHei', 宋体, sans-serif][b][b][/b][/b][/font][font=&]【题名】：[/font][b][b][color=#333333][b][font=&][color=#032d2c][b]激光扫描系统中f-θ透镜的光学设计[/b][/color][/font][/b][/color][/b][/b][font=&]【期刊】：[/font][font=Arial][font=&][size=12px]CNKI[/size][/font][/font][font='Microsoft YaHei', 宋体, sans-serif][color=#545454][b]【链接】：[url=https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?filename=GXYQ201205010&dbcode=CJFD&dbname=CJFD2012&v=MtjycLTRGnKxILp8twqktbNToUw7nOHEuuWOwWDenuEbA2lD5Pu15j0vTJePCmMS]激光扫描系统中f-θ透镜的光学设计 - 中国知网 (cnki.net)[/url][/b][/color][/font]

  • 【分享】激光共聚焦扫描显微镜基础

    随着计算机技术和光电技术的飞跃发展，八十年代后期开始实际应用的激光共聚焦扫描显微镜（LSM），使人们在医学生物学上对活细胞的动态观察、细胞无损伤探测、免疫荧光标记和离子荧光探针的观察和研究上有了更加得心应手的手段和工具。随着计算机、光学显微镜、大数值孔径复消色差物镜、高分辨率分析显示、激光源、激光功率、高敏感度探测器、声光转换电子控制和各种荧光标记物的发展，使得LSM向更精、更快、多维和无损伤性分析的方向发展。

  • 激光扫描共聚焦显微镜的检测模式及其在生物医学领域的应用

    [align=center][font='times new roman'][size=16px]激光扫描共聚焦显微镜的[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]检测[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]模式及其在生物医学领域的应用[/size][/font][/align][align=center][font='times new roman'][size=14px]吴晶[/size][/font][font='times new roman'][sup][size=14px]1[/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=14px]，刘皎[/size][/font][font='times new roman'][sup][size=14px]1[/size][/sup][/font][font='times new roman'][sup][size=14px], *[/size][/sup][/font][/align][align=center]1. [font='times new roman']北京大学医药卫生分析中心，北京，100191[/font][/align][font='times new roman'][/font][align=center][font='times new roman'][size=13px]* [/size][/font][font='times new roman']通讯作者[/font][/align][font='times new roman']摘要[/font][font='times new roman']由于激光扫描共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）特有的分辨率和技术优势，使得其成为了生物学、医学及药学等领域重要的科研工具。本文结合[/font][font='times new roman']作[/font][font='times new roman']者所在的北京大学医药卫生分析中心共聚焦平台的工作经验，概述了CLSM适用的样本、[/font][font='times new roman']检测[/font][font='times new roman']模式以及在生物医学领域的应用，以期为相关科研技术人员提供参考。[/font][font='times new roman']A[/font][font='times new roman']bstract[/font][font='times new roman']Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) has become an important scientific research tool in the fields of biology, medicine and pharmacy due to its unique resolution and technical advantages. Based on the author's work experience in the confocal [/font][font='times new roman']center[/font][font='times new roman'] of Peking University Medical and Health Analysis Center, this paper summarizes the applicable samples, detection modes and applications of CLSM in the biomedical field, in order to provide reference for related scientific researchers and technicians.[/font][font='times new roman']关键词[/font][font='times new roman']激光扫描共聚焦显微镜，[/font][font='times new roman']检测[/font][font='times new roman']模式，应用[/font][font='times new roman']1 引言[/font][font='times new roman']从17世纪世界上第一台原始的光学显微镜问世以来，光学显微镜在20世纪经历了快速发展时期[1]。但由于普通的光学显微镜受光波衍射效应的限制，分辨率已接近理论极限值。因此，为改善成像质量，提高图像清晰度，从而提高显微镜的成像分辨率，人们采用增加物象与背景的反差来实现此目的[2]。激光扫描共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）的诞生，在一定程度上实现了这一目的。1984年，Bio-Rad公司首次推出世界第一台商品化的CLSM，从此CLSM迅速发展成为现代生物医学等领域科研的有力工具，广泛应用于细胞生物学、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、免疫学和神经生物学等领域。[/font][font='times new roman']伴随着光学、计算机等技术的迅速发展，CLSM的分辨率甚至可以突破光学极限（0.2μm），达到0.05μm甚至0.02μm。与分辨率可以达到0.2nm的电子显微镜相比，CLSM的优势是既可以用于固定样品的拍摄，还可以用于活细胞实验，比如观察在特定刺激下细胞某个结构或者荧光强度的变化等。同时还可以通过XYZ[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']XYT[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']XYλ[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']XYZT[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']XYλT等多种模式实现多维成像，亦可进行更复杂实验的拍摄，比如荧光共振能量转移（[/font][font='times new roman']Fluorescence Resonance Energy Transfer, [/font][font='times new roman']FRET）,荧光漂白恢复（[/font][font='times new roman']Fluorecence Recovery After Photobleaching, [/font][font='times new roman']FRAP），荧光寿命成像（[/font][font='times new roman']Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, [/font][font='times new roman']FLIM）[/font][font='times new roman']，荧光相关光谱/荧光互相关光谱（Fluorescence Correlation/Co-Correlation Spectroscopy, [/font][font='times new roman']FCS[/font][font='times new roman']/FCCS）[/font][font='times new roman']等实验以满足对样品的定性、定量、定位、共定位等多维度多功能的研究。[/font][font='times new roman']本文拟通过按CLSM常见的[/font][font='times new roman']检测[/font][font='times new roman']模式分别阐述其在生物医学领域的应用，以其为相关科研技术人员提供参考。[/font]2. [font='times new roman']CLSM适用的样本[/font][font='times new roman']CLSM适用的样本非常广泛，从液体、固体等形式的材料或制剂、细菌、培养的粘附细胞、悬浮细胞、细胞团、类器官、各种染色、非染色荧光标记的组织或组织切片、到各种动物（如模式动物线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠、大鼠等），都可以通过搭载不同载物台进行测试。所有的样品都可以通过匹配不同的器皿（包括共聚焦专用小皿、玻片、transwell小室、孔板等等）和固定器（比如不同热台、孔板支架等）放置到载物台上进行测试。[/font]3. [font='times new roman']CLSM的[/font][font='times new roman']检测[/font][font='times new roman']模式[/font]3.1 [font='times new roman']单一光切片模式（XY或XZ）[/font][font='times new roman']CLSM的最基本优势在于利用激光代替传统场光源，借助于激光扫描共聚焦显微镜的软件系统，CLSM可以实现点扫描、点探测，得到生物样品高反差、高分辨率、高灵敏度的二维图像，从而获得细胞/组织等光学切片的物理、生物化学特性及变化。也可以对所感兴趣的区域进行准确的定性、定量及定位分析。[/font][font='times new roman']CLSM特有的zoom功能，可以用来调节扫描区域的放大倍数。增加选定区域的zoom值，其图像会被放大。但zoom值会受吴晶分辨率的限制，一味的增大zoom值，不能得到相应的高清图像。因此，需根据实际情况参考piexl size进行设定。[/font]3.2 [font='times new roman']三维成像模式[/font]3.2.1 [font='times new roman']Z轴系列及三维成像模式，三维定位/图像重构[/font][font='times new roman']CLSM可对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的系列光学切片，获得标本真正意义上的三维数据，这一功能被称为“细胞CT”：通过扫描振镜在X、Y方向的连续扫描，控制软件将扫描的像素点组成共聚焦图像，通过电动载物台沿Z轴方向的连续扫描，可获得样品不同层面连续的光切图像（xyz）。同理，通过沿Y轴方向连续扫描，可获得连续的xzy图像。再经计算机图像处理及三维重建软件，可产生生动逼真的动态效果。[/font]3.2.2 [font='times new roman']时间序列扫描模式(XYT)[/font][font='times new roman']共聚焦显微镜若按照一定的时间间隔、重复地采集样品内固定区域的荧光图像，并对其进行定位、定性及定量分析，则可实现对该样品的实时监测（XYT），此类实验可观察特异荧光探针标记的单个细胞不同部位或不同组织区域接受刺激后的整个变化过程，常用于对单个细胞内各种离子、膜电位、活性氧的比例及动态变化做实时定量分析，例如动态测定活细胞或组织内游离Ca[/font][font='times new roman'][sup][size=13px]2+[/size][/sup][/font][font='times new roman']、Mg[/font][font='times new roman'][sup][size=13px]2+[/size][/sup][/font][font='times new roman']、K[/font][font='times new roman'][sup][size=13px]+[/size][/sup][/font][font='times new roman']、Na[/font][font='times new roman'][sup][size=13px]+[/size][/sup][/font][font='times new roman']等离子的分布和浓度的变化、活细胞内H[/font][font='times new roman'][sup][size=13px]+[/size][/sup][/font][font='times new roman']浓度的变化、细胞/线粒体膜电位，自由基等。当Y方向上的扫描行数设为1时，便可进入特殊的XT模式，在这种扫描模式下得到的图像，可以用来计算血流速度等。[/font]3.2.3 [font='times new roman']光谱扫描模式（XYλ/XYΛ/XZλ）[/font][font='times new roman']通常配置有可调节接受范围的检测器[/font][font='times new roman']的CLSM[/font][font='times new roman']，可以实现从400nm-800nm的发射波谱扫描。通过配置具有连续可调波长的白激光，CLSM还可以实现激发波谱扫描。[/font][font='times new roman']3.3四维成像模式（XYZT/XYλT/XYΛT）[/font][font='times new roman']基于[/font][font='times new roman']上述[/font][font='times new roman']三维成像[/font][font='times new roman']模式[/font][font='times new roman']，结合时间序列扫描，可以实现CLSM的四维成像。[/font][font='times new roman']3.4反射光/透射光/微分干涉（DIC）成像模式[3-4][/font][font='times new roman']反射光成像主要是指光源发出的光到达样品后发生反射，检测器将此反射光信号转化为电信号进而生成样品表面的图像。利用反射光成像，能够更好的获得样品的表面纹理等信息，是对荧光图像信息的进一步补充。[/font][font='times new roman']透射光成像技术是通过光源发出的光到达样品后，透过样品的光进入检测器生成光信号，再由检测器转变为电信号所形成的图像信息。透射光成像通常能够更好的呈现目标的外轮廓信息，亦是对荧光图像信息的进一步补充。[/font][font='times new roman']很多CLSM配置有DIC模式。与其他成像技术相比，DIC成像技术通过对光路中梯度变化的呈现，实现“伪立体”效果，如在梯度比较小的区域中，相对比较扁平的上皮细胞亦可以较好的实现“立体”结构，同时，由于DIC成像技术不存在相差成像等技术中出现的光晕，还可以利用这个特点检测到细胞表面分布着的细菌，这是很多成像技术所观察不到的。因此DIC成像技术的主要优势在于不需要对相差环和聚光镜遮挡等因素进行考虑，可以直接实现高数值孔径的物镜观察，即可以提高轴向分辨率，这在对分辨率要求十分高的实验中具有重要的应用价值。[/font][font='times new roman']3.6 特殊[/font][font='times new roman']检测[/font][font='times new roman']模式[/font][font='times new roman']3.6.1 荧光漂白恢复（FRAP）[/font][font='times new roman'][5][/font][font='times new roman']FRAP技术由Axelrod等于20世纪70年代研发，指对细胞内的某一区域荧光漂白后，通过测定荧光分子的恢复速率，来研究活细胞中生物分子的动力学特征。[/font][font='times new roman']通过FRAP实验可以研究生物膜脂质分子的侧向扩散、细胞间的通讯、胞浆及细胞器内小分子物质转移性的观测、以及细胞骨架、核膜结构或大分子组装等。[/font][font='times new roman']3.6.2荧光能量共振转移（FRET）[/font][font='times new roman'][6][/font][font='times new roman']FRET是指两个荧光基团间能量通过偶极-偶极耦合作用以非辐射方式从供体传递给受体的现象。目前FRET技术可广泛用于单个固定细胞、亚细胞或活细胞原位生理环境下检测生物大分子的构象变化和分子间的直接相互作用，如检测配体-受体、蛋白分子共定位、转录机制、蛋白折叠以及蛋白质二聚化等，亦可用于检测酶活性变化、细胞凋亡以及膜蛋白的研究等。[/font][font='times new roman']在FRET体系中，常用的荧光能量供体、受体对主要有：CFP/YFP、BFP/RFP、CY3/CY5等。[/font][font='times new roman']进行FRET实验时，需要满足以下几个条件：① 所检测样品包含两个荧光分子，能量的提供者叫做供体，能量的接受者叫做受体；② 供体与受体的距离在[/font][font='times new roman']10[/font][font='times new roman']nm之间；③ 供体的发射波长与受体的激发波长一致。当供体的激发波长照射样品时，若没有FRET效应产生，只会检测到供体的发射光；反之，如果有FRET效应发生，则CLSM可检出供体发射的荧光减弱，而受体的发射光增强。[/font][font='times new roman']3.6.4 荧光寿命成像（[/font][font='times new roman']FLIM[/font][font='times new roman']）[7][/font][font='times new roman']FLIM技术是研究细胞内生命活动状态的一种非常可靠的方法。荧光寿命是荧光团在返回基态之前处于激发态的平均时间，是荧光团的固有性质，因此其不受探针浓度、激发光强度和光漂白效应等因素影响，且能区分荧光光谱非常接近的不同荧光团，故具有非常好的特异性和很高的灵敏度。此外，由于荧光分子的荧光寿命能十分灵敏地反映激发态分子与周围微环境的相互作用及能量转移，因此FLIM技术常被用来实现对微环境中许多生化参数的定量测量，如细胞中折射率、黏度、温度、pH值的分布和动力学变化等，这在生物医学研究中具有非常重要的意义。目前FLIM技术在细胞生物学中一些重要科学问题的研究、临床医学上一些重大疾病的诊断与治疗研究以及纳米材料的生物医学应用研究等方面均有广泛应用，并取得了许多利用传统的研究手段无法获取的数据。[/font][font='times new roman']3.6.5 荧光共振能量转移-荧光寿命成像（FRET- [/font][font='times new roman']FLIM[/font][font='times new roman']）[8][/font][font='times new roman']FRET本身不是一种成像技术，而是一个物理过程。传统的FRET过程分析通常是基于荧光强度成像来实现，分析的结果容易受光谱串扰的影响。而将FLIM技术应用于FRET过程分析，利用FLIM技术可定量测量这一优势，可非常灵敏地反映供体荧光分子与受体荧光分子之间的能量转移过程。当受体分子与供体之间的距离10nm时，供体的能量转移到受体，受体从基态发生能量跃迁，从而影响供体的荧光寿命。与没有受体分子的时候相比，发生FRET的供体分子的荧光寿命降低。因此，FRET-FLIM联合能够实时监测生物细胞中蛋白质的动态变化，如蛋白质折叠、分子间（蛋白-蛋白，蛋白-核酸）相互作用和细胞间信号分子传递、分子运输以及病理学研究等。[/font][font='times new roman']3.6.3 荧光相关光谱/荧光互相关光谱（[/font][font='times new roman']FCS[/font][font='times new roman']/FCCS）[9-12][/font][font='times new roman']FCS[/font][font='times new roman']和FCCS都是在涨落光谱技术的基础上衍生而来的，通过检测某一微小区域内荧光信号的瞬时涨落变化，分析分子的密度、扩散以及分子之间的相互作用，是一种新兴的单分子检测技术。由于FCS/FCCS的高灵敏性可以用来检测生物系统中发生的小概率时间，因此此技术主要用于分子之间相互作用、活细胞分析、核酸分析、蛋白质的寡聚化、蛋白质的动力学研究以及纳米制剂粒径测量等研究，在检测物质浓度、扩散速度、分子结合速率等方面体现出巨大的优越性，亦可用于肿瘤的早期诊断以及高通量药物筛选等。[/font][font='times new roman']FCS技术，即在CLSM焦点的微小测量区域内，通过对荧光强度随时间变化的自发性波动分析和其时间函数自相关的分析，并通过计算机统计与拟合运算，在活细胞内单分子水平给出分子的扩散系数、分子数目、分子浓度及分子之间结合与分离状态等动力学参数的检测方法。其实质是监测带有荧光基团的物质在激光作用体积内的扩散情况，可揭示异质群体中的每个个体，并对各自的亚群进行鉴定、分类、定量比较，亦可对复杂的生化反应提供详细、确定的动力学参数。[/font][font='times new roman']发明FCS的最初目的是在生物系统中研究非常稀的样本浓度的化学动力学特征。随着探测手段、自相关电子学等方面的技术进步，FCS在生物化学中的研究和应用越来越广泛，如经典的细胞膜中脂质扩散研究就是通过CLSM整合了FCS技术后所取得的巨大进展。[/font][font='times new roman']FCCS技术，确切来说是FCS技术的一种延伸应用。其既保持了FCS技术的灵敏性，又可以解决FCS对两种粒子的扩散速度要有明显不同的要求（至少相差2倍，即二者质量差相差8倍）。该技术在实验中通常将两种粒子用不同的荧光进行标记，荧光分子被激发后，产生两种互不干扰的荧光信号，分别被两个独立的检测器探测，然后将探测到的信息进行交叉函数分析。如果分子间存在相互作用，那么两种不同的荧光信号将同时经过检测通道，这时两个检测器就会产生同步的信号波动，从而产生互相关信号；而当单色荧光分子独立在微区域内运动时，则不会产生互相关信号。这样，相互作用的荧光分子和独立运动的荧光分子就被区分开来。由于FCCS技术直接反映分子间的相互作用，而不像FRET技术那样受分子扩散或聚集的影响，因此在生物分子互作、蛋白寡聚化、酶活性研究领域中有重要的应用前景。[/font][font='times new roman']4 结论和展望[/font][font='times new roman']综上，CLSM应用灵活，具备多种检测[/font][font='times new roman']模式，适用于多种样本，[/font][font='times new roman']亦可[/font][font='times new roman']实现多种实验目的，如荧光的定量、定性、定位、共定位，动态荧光的测定等[/font][font='times new roman']。一些特殊的实验模式，将CLSM在生物医学领域的应用进一步扩大。通过[/font][font='times new roman']结合其他[/font][font='times new roman']技术[/font][font='times new roman']（多手段联合拓展[/font][font='times new roman']，如膜片钳、原子力显微镜、光电联用等[/font][font='times new roman']）[/font][font='times new roman']，CLSM必将成为[/font][font='times new roman']助力生物医学领域研究[/font][font='times new roman']的有力工具[/font][font='times new roman']。[/font][font='times new roman']参考文献[/font]1. [font='times new roman']黄德娟，浅谈显微镜的发展史及其在生物学中的用途。赤峰教育学院学报，2000，2：51-52[/font]2. [font='times new roman']肖艳梅，付道林，李安生，激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）及其生物学应用。激光生物学报，1999,8（4）：305-311[/font]3. [font='times new roman']弓宇, 郭英玲, 张枫, 刘红旗, 基于反射光和透射光成像的图像识别方法比较。机电产品开发与创新，2013,26(3):7-9[/font]4. [font='times new roman']虞兆芳, DIC成像技术的优势。求知导刊，2016,2：53[/font]5. [font='times new roman']隋鑫，满奕，张越，林金星，荆艳萍，荧光漂白恢复技术及其在生物膜系统研究中的应用。电子显微学报，2017,36（6）：601-609[/font]6. [font='times new roman']肖忠新，张进禄，荧光共振能量转移技术在激光共聚焦显微镜中的应用。中国医学装备，2014,8（11）：73-75[/font]7. [font='times new roman']刘雄波，林丹樱，吴茜茜，严伟，罗腾，杨志刚，屈军乐，荧光寿命显微成像技术及应用的最新研究进展。物理学报，2018,67（17）：178701-1-178701-14[/font]8. [font='times new roman']罗淋淋，牛敬敬，莫蓓莘，林丹樱，刘琳，荧光共振能量转移-荧光寿命显微成像（FRET-FLIM）技术在生命科学研究中的应用进展。光谱学与光谱分析，2021,41（4）：1023-1031[/font]9. [font='times new roman']曲绍峰，林金星，李晓娟，FCS/FCCS技术及其在植物细胞生物学中的应用。电子显微学报，2014，33（5）：461-468[/font]10. [font='times new roman']张普敦，任吉存，荧光相关光谱及其在单分子检测中的应用进展。分析化学，2005,33（6）：875-880[/font]11. [font='times new roman']黄茹，周小明，荧光相关光谱在生物化学领域中的应用。激光生物学报，2013,22（4）：289-293[/font]12. [font='times new roman']游俊，荧光相关光谱（FCS）在生物活细胞中的应用。湖北大学学报（自然科学版），2005，27（1）：53-56[/font]

  • 【资料】激光共聚焦扫描显微镜一些介绍

    激光共聚焦扫描显微镜简介一、 激光共聚焦显微镜的基本组成激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope LSCM)是20世纪80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品，是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器。激光共聚焦显微镜利用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦的原理和装置，以及通过针孔的选择和PMT的收集，并带有一套对其所观察到的对象进行数字图像分析处理的系统软件。与传统光学显微镜相比，它具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点。所以它问世以来在生物学的研究领域中得到了广泛应用。激光共聚焦显微镜主要有四部分组成：1、显微镜光学系统。2、扫描装置。3、激光光源。4、检测系统。整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。1.1 显微镜光学系统　　显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成象质量。显微镜光路以无限远光学系统可方便地在其中插人光学选件而不影响成象质量和测量精度。物镜应选取大数值孔径平场复消色 差物镜，有利于荧光的采集和成象的清晰。物镜组的转换，滤色片组的选取，载物台的移动调节，焦平面的记忆锁定都应由计算机自动控制。1.2 扫描装置　　LSCM使用的扫描装置在生物领域一般为镜扫描。由于转镜只需偏转很小角度就能涉及很大的扫描范围，图象采集速度大大提高，512×512画面每秒可达4帧以上，有利于那些寿命短的离子作荧光测定。扫描系统的工作程序由计算机自动控制。1.3 激光光源　　LSCM使用的激光光源有单激光和多激光系统。多激光器系统在可见光范围使用多谱线氩离子激光器，发射波长为457nm、488nm和514nm的蓝绿光，氦氖绿激光器提供发射波长为543nm的绿光，氦氖红激光器发射波长为633nm的红光，新的405nm半导体激光器的出现可以提供近紫外谱线，但是小巧便宜而且维护简单。1.4 检测系统　　LSCM为多通道荧光采集系统，一般有三个荧光通道和一个透射光通道，能升级到四个荧光通道，可对物体进行多谱线激光激发，样品发射荧光的探测器为感光灵敏度高的光电倍增管PMT，配有高速12位A/D转换器，可以做光子计数。PMT前设置针孔，由计算机软件调节针孔大小，光路中设有能自动切换的滤色片组，满足不同测量的需要,也有通过光栅或棱镜分光后进行光谱扫描功能的设置。二、激光共聚焦显微镜的特点以及在生物领域的应用传统光学显微镜相比，激光共聚焦显微镜具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点，在对生物样品的观察中，激光共聚焦显微镜有如下优越性：1、对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。2、 可以得到比普通荧光显微镜更高对比度、高解析度图象、同时具有高灵敏度、杰出样品保护。3、***图象的获得，如7 维图象(XYZaλIt): xyt 、xzt 和xt 扫描,时间序列扫描旋转扫描、区域扫描、光谱扫描、同时方便进行图像处理。 4、细胞内离子荧光标记，单标记或多标记，检测细胞内如PH和钠、钙、镁等离子浓度的比率测定及动态变化。5、荧光标记探头标记的活细胞或切片标本的活细胞生物物质，膜标记、免疫物质、免疫反应、受体或配体，核酸等观察；可以在同一张样品上进行同时多重物质标记，同时观察； 6、对细胞检测无损伤、精确、准确、可靠和优良重复性；数据图像可及时输出或长期储存。 由于共聚焦显微镜的以上优点，激光共聚焦显微镜在以下研究领域中应用较为广泛：1、细胞生物学：如：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结构和分布变化、细胞凋亡机制；各种细胞器、结构性蛋白、DNA、RNA、酶和受体分子等细胞特异性结构的含量、组分及分布进行定量分析；DNA、RNA含量、利用特定的抗体对紫外线引起的DNA损伤进行观察和定量；分析正常细胞和癌细胞细胞骨架与核改变之间的关系；细胞黏附行为等 2、生物化学：如：酶、核酸、受体分析、荧光原位杂交、杂色体基因定位等，利用共聚焦技术可以取代传统的核酸印迹染交等技术，进行基因的表达检测，使基因的转录、翻译等检测变的更加简单、准确。3、药理学：如：药物对细胞的作用及其动力学；药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量 4、生理学、发育生物学：如：膜受体、离子通道、离子含量、分布、动态；动物发育以及胚胎的形成，骨髓干细胞的分化行为；细胞膜电位的测量.荧光漂白恢复（FRAP）、荧光漂白丢失（FLIP）的测量等。 5、遗传学和组胚学：如：细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断； 6、神经生物学：如：神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递； 7、微生物学和寄生虫学：如：细菌、寄生虫形态结构； 8、病理学及病理学临床应用：如：活检标本的快速诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病的诊断； 9、免疫学、环境医学和营养学。如：免疫荧光标记（单标、双标或三标）的定位，细胞膜受体或抗原的分布,微丝、微管的分布、两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位；对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中的时空表达，荧光能量共转移（FRET）。

  • 【数据采集应用案列】采用USB-2533集成散射光探测器

    【数据采集应用案列】采用USB-2533集成散射光探测器

    [img=,690,293]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/05/201905171114090988_8823_3859729_3.jpg!w690x293.jpg[/img]简 介OSI Optoelectronics是一家生产标准或定制二极管和光学传感器的制造商，其产品应用于医学、商业、军事、X-射线、无线电通讯等各个领域。项目需求OSI公司准备开发一款低成本的数据采集系统，需要从48个独立的探测器上采集信号并将其数字化，用 USB总线将数字信号上传至PC。48路探测器被巧妙地集成在一个仪器上，用于采集物体的散射光。由于散射光密度很低，所以要选择低噪音、高敏度的探测器。此项目计划在2个月之内完成产品雏形。OSI Optoelectronics曾采用PCI板卡采集方案，现准备用USB采集卡替换此方案。OSI的方案变更有以下几个原因：探测器密度越高，越能更好地感应低密度的散射光；无需使用连接PCI板卡和模拟信号的带状电缆；模数转换靠近模拟信号源，降低了信号噪声；实现更高的采样率，使得从48个通道获取信号在时间上更加同步；用笔记本电脑取代了台式机；数据采集硬件成本降低；解决方案探测器选择的是高敏度OSI Optoelectronics的光电DP系列，特点是低电容、高响应度、低噪音及巨变温度下的高稳定性。数据采集元件选择的是MCC的16位USB-2533数据采集卡。选择USB-2533基于多方面原因。首先1MHz的采样率高于现有的PCI板卡，使得切换通道时间变短。其次，使用USB板卡的成本是PCI板卡的1/3。而且USB-2533的体积玲珑，可以安置在仪器内，从而使得 AD转换靠近模拟信号源、降低噪声、增加信噪比。高敏度探测器与USB-2533的完美结合实现了产品的预期效果。OSI设计的定制接口板安装在USB-2533上，为独立的光电探测器的48个模拟通道提供了接口。[img=,690,690]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/05/201905171114214252_786_3859729_3.jpg!w690x690.jpg[/img]结果MCC的销售及工程师提供的支持具有很高的价值，销售团队在需求提报后的三天内评估了USB-2533和UL软件的方案。技术支持工程师则提供了C++的编程应用案例，这些案例开启了应用代码的开发，使得OSI在计划时间内完成了产品原型。重新设计的仪器的采样率更高，各探测器信号的扫描更同步；USB-2533的16位分辨率也使得仪器精度大大提高。高敏度的探测器（对于特定波长有高响应度）在微光下提供更精确的信号，因此提高了成像质量（信噪比）。新产品很快上市，在降低成本的同时提高了产品性能。如需了解更多内容请关注嘉兆科技

  • 【原创】光电导探测器主要应用范围

    [size=4] photoconductive detector 利用半导体材料的光电导效应制成的一种光探测器件。所谓光电导效应，是指由辐射引起被照射材料电导率改变的一种物理现象。光电导探测器在军事和国民经济的各个领域有广泛用途。在可见光或近红外波段主要用于射线测量和探测、工业自动控制、光度计量等；在红外波段主要用于导弹制导、红外热成像、红外遥感等方面。光电导体的另一应用是用它做摄像管靶面。为了避免光生载流子扩散引起图像模糊，连续薄膜靶面都用高阻多晶材料,如PbS-PbO、Sb2S3等。其他材料可采取镶嵌靶面的方法，整个靶面由约10万个单独探测器组成。 1873年，英国W.史密斯发现硒的光电导效应，但是这种效应长期处于探索研究阶段，未获实际应用。第二次世界大战以后，随着半导体的发展，各种新的光电导材料不断出现。在可见光波段方面，到50年代中期，性能良好的硫化镉、硒化镉光敏电阻和红外波段的硫化铅光电探测器都已投入使用。60年代初，中远红外波段灵敏的Ge、Si掺杂光电导探测器研制成功，典型的例子是工作在3～5微米和8～14微米波段的Ge:Au（锗掺金）和Ge:Hg光电导探测器。60年代末以后,HgCdTe、PbSnTe等可变禁带宽度的三元系材料的研究取得进展。 工作原理和特性 光电导效应是内光电效应的一种。当照射的光子能量hv等于或大于半导体的禁带宽度Eg时，光子能够将价带中的电子激发到导带，从而产生导电的电子、空穴对,这就是本征光电导效应。这里h是普朗克常数，v是光子频率,Eg是材料的禁带宽度（单位为电子伏）。因此，本征光电导体的响应长波限λc为 λc=hc/Eg=1.24/Eg (μm) 式中 c为光速。本征光电导材料的长波限受禁带宽度的限制。在60年代初以前还没有研制出适用的窄禁带宽度的半导体材料，因而人们利用非本征光电导效应。Ge、Si等材料的禁带中存在各种深度的杂质能级，照射的光子能量只要等于或大于杂质能级的离化能，就能够产生光生自由电子或自由空穴。非本征光电导体的响应长波限λ由下式求得 λc＝1.24/Ei 式中Ei代表杂质能级的离化能。到60年代中后期，Hg1-xCdxTe、PbxSn1-xTe、PbxSn1-xSe等三元系半导体材料研制成功,并进入实用阶段。它们的禁带宽度随组分x值而改变，例如x＝0.2的HG0.8Cd0.2Te材料，可以制成响应波长为 8～14微米大气窗口的红外探测器。它与工作在同样波段的Ge：Hg探测器相比有如下优点：①工作温度高（高于77K），使用方便,而Ge:Hg工作温度为38K。②本征吸收系数大,样品尺寸小。③易于制造多元器件。表1和表2分别列出部分半导体材料的Eg、Ei和λc值。 通常，凡禁带宽度或杂质离化能合适的半导体材料都具有光电效应。但是制造实用性器件还要考虑性能、工艺、价格等因素。常用的光电导探测器材料在射线和可见光波段有：CdS、CdSe、CdTe、Si、Ge等 在近红外波段有：PbS、PbSe、InSb、Hg0.75Cd0.25Te等 在长于8微米波段有:Hg1-xCdxTe、PbxSn1-x、Te、Si掺杂、Ge掺杂等；CdS、CdSe、PbS等材料可以由多晶薄膜形式制成光电导探测器。 可见光波段的光电导探测器 CdS、CdSe、CdTe 的响应波段都在可见光或近红外区域，通常称为光敏电阻。它们具有很宽的禁带宽度（远大于1电子伏）,可以在室温下工作，因此器件结构比较简单，一般采用半密封式的胶木外壳，前面加一透光窗口，后面引出两根管脚作为电极。高温、高湿环境应用的光电导探测器可采用金属全密封型结构，玻璃窗口与可伐金属外壳熔封。 器件灵敏度用一定偏压下每流明辐照所产生的光电流的大小来表示。例如一种CdS光敏电阻,当偏压为70伏时，暗电流为10-6～10-8安，光照灵敏度为3～10安/流明。CdSe光敏电阻的灵敏度一般比 CdS高。光敏电阻另一个重要参数是时间常数 τ，它表示器件对光照反应速度的大小。光照突然去除以后，光电流下降到最大值的 1/e（约为37％）所需的时间为时间常数 τ。也有按光电流下降到最大值的10％计算τ的 各种光敏电阻的时间常数差别很大。CdS的时间常数比较大（毫秒量级）。 红外波段的光电导探测器 PbS、Hg1-xCdxTe 的常用响应波段在 1～3微米、3～5微米、8～14微米三个大气透过窗口。由于它们的禁带宽度很窄，因此在室温下，热激发足以使导带中有大量的自由载流子，这就大大降低了对辐射的灵敏度。响应波长越长的光，电导体这种情况越显著，其中1～3微米波段的探测器可以在室温工作（灵敏度略有下降）。3～5微米波段的探测器分三种情况：①在室温下工作，但灵敏度大大下降，探测度一般只有1～7×108厘米瓦-1赫；②热电致冷温度下工作(约-60℃),探测度约为109厘米瓦-1赫 ③77K或更低温度下工作,探测度可达1010厘米瓦-1赫以上。8～14微米波段的探测器必须在低温下工作，因此光电导体要保持在真空杜瓦瓶中，冷却方式有灌注液氮和用微型制冷器两种。 红外探测器的时间常数比光敏电阻小得多,PbS探测器的时间常数一般为50～500微秒,HgCdTe探测器的时间常数在10-6～10-8秒量级。红外探测器有时要探测非常微弱的辐射信号,例如10-14 瓦；输出的电信号也非常小,因此要有专门的前置放大器。[/size]

  • 非制冷势垒型InAsSb基高速中波红外探测器

    高速响应的中波红外探测器在自由空间光通信和频率梳光谱学等新兴领域的需求逐渐增加。中长波XB?n势垒型红外光探测器对暗电流等散粒噪声具有抑制作用。近期，由中国科学院半导体研究所、昆明物理研究所、中国科学院大学和陆装驻重庆军代局驻昆明地区第一军代室组成的科研团队在《红外与毫米波学报》期刊上发表了以“非制冷势垒型InAsSb基高速中波红外探测器”为主题的文章。该文章第一作者为贾春阳，通讯作者为赵俊总工程师和张逸韵研究员。本工作制备了不同直径的nBn和pBn结构的中波InAsSb/AlAsSb红外接地-信号-接地（GSG）探测器。对制备的探测器进行了变温暗电流特性，结电容特性和室温射频响应特性的表征。[align=center][size=18px][back=#ffff00][b]材料生长、器件制备和测试[/b][/back][/size][/align]通过固态源分子束外延装置在2英寸的n型Te-GaSb衬底上外延生长nBn和pBn器件。势垒型器件的生长过程如下所示：先在衬底上生长GaSb缓冲层来平整表面以及减少应力和位错，接着生长重掺杂（101? cm?3）n型InAsSb接触层，然后生长2.5 μm厚的非故意掺杂（101? cm?3）InAsSb体材料吸收层。之后生长了150 nm厚的AlAsSb/AlSb数字合金电子势垒层，通过插入超薄的AlSb层实现了吸收区和势垒层的价带偏移的显著减少，有助于空穴向接触电极的传输，同时有效阻止电子以减小暗电流。最后分别生长300 nm厚的重掺杂（101? cm?3）n型InAsSb和p型GaSb接触层用于形成nBn和pBn器件结构。其中，Si和Be分别被用作n型和p型掺杂源。生长后，通过原子力显微镜（D3100，Veeco，USA）和高分辨X射线衍射仪（Bede D1，United Kingdom）对晶片进行表征以确保获得高质量的材料质量。通过激光划片将2英寸的外延片划裂为1×1 cm2的样片。样片经过标准工艺处理，包括台面定义、钝化和金属蒸镀工艺，制成直径从10 μm到100 μm的圆形台面单管探测器。台面定义工艺包括通过电感耦合等离子体（ICP）和柠檬酸基混合溶液进行的干法刻蚀和湿法腐蚀工艺，以去除器件侧壁上的离子诱导损伤和表面态。器件的金属电极需要与射频探针进行耦合来测试器件的射频响应特性，因此包括三个电极分别为Ground（接地）、Signal（信号）和Ground，其中两个Ground电极相连，与下接触层形成欧姆接触，Signal电极与上接触层形成欧姆接触，如图1（c）和（f）所示。通过低温探针台和半导体参数分析仪（Keithley 4200，America）测试器件77 K-300 K范围的电学特性。器件的光学响应特性在之前的工作中介绍过，在300 K下光电探测器截止波长约为4.8 μm，与InAsSb吸收层的带隙一致。在300 K和反向偏置为450 mV时，饱和量子效率在55%-60%。通过探针台和频率响应范围10 MHz-67 GHz的矢量网络分析仪（Keysight PNA-XN5247B，America）对器件进行射频响应特性测试。[align=center][size=18px][back=#ffff00][b]结果与讨论[/b][/back][/size][/align][b]材料质量表征[/b]图1（a）和（d）的X射线衍射谱结果显示，从左到右的谱线峰分别对应于InAsSb吸收层和GaSb缓冲层/衬底。其中，nBn和pBn外延片的InAsSb吸收区的峰值分别出现在60.69度和60.67度，GaSb衬底的峰值则出现在60.72度。因此，InAsSb吸收层与GaSb 衬底的晶格失配分别为-108 acsec和-180 acsec，符合预期，表明nBn和pBn器件的InAsSb吸收区和GaSb衬底几乎是晶格匹配的生长条件。因此，nBn和pBn外延片都具有良好的材料质量。原子力显微镜扫描的结果在图1的（b）和（e）中，显示出生长后的nBn和pBn外延片具有良好的表面形貌。在一个5×5 μm2的区域内，nBn和pBn外延片的均方根粗糙度分别为1.7 ?和2.1 ?。[align=center][img]https://img1.17img.cn/17img/images/202401/uepic/92230b98-4dac-4ee0-aeaa-282dcd342995.jpg[/img][/align][align=center][color=#0070c0]图1 （a）和（a）分别为nBn和pBn外延片的X射线衍射谱；（b）和（e）分别为nBn和pBn外延片的原子力显微扫描图；（c）和（f）分别为制备的圆形GSG探测器的光学照片和扫描电子照片[/color][/align][b]器件的变温暗电流特性[/b]图2（a）显示了器件直径90 μm的nBn和pBn探测器单管芯片的温度依赖暗电流密度-电压曲线，通过在连接到Keithley 4200半导体参数分析仪的低温探针台上进行测量。图2（b）显示了件直径90 μm的nBn和pBn探测器在77 K-300 K下的微分电阻和器件面积的乘积R?A随反向偏压的变化曲线，温度下降的梯度（STEP）为25 K。图2（c）显示了在400 mV反向偏压下，nBn和pBn探测器表现出的从77 K到300 K的R?A与温度倒数（1000/T）之间的关系，温度变化的梯度（STEP）为25 K。[align=center][img]https://img1.17img.cn/17img/images/202401/uepic/a8f8001f-cd03-42f4-a32f-8b1acc94131d.jpg[/img][/align][align=center][color=#0070c0]图2 从77K到300K温度下直径90 μm的nBn和pBn探测器单管芯片（a）暗电流密度-电压曲线；（b）微分电阻和器件面积的乘积R?A随反向偏压的变化曲线；（c）R?A随温度倒数变化曲线[/color][/align][b]器件暗电流的尺寸效应[/b]由于势垒型红外探测器对于体内暗电流可以起到较好的抑制作用，因此研究人员关注与台面周长和面积有关的表面泄露暗电流，进一步抑制表面漏电流可以进一步提高探测器的工作性能。图3（a）显示了从20 μm到100 μm直径的nBn和pBn器件于室温工作的暗电流密度和电压关系，尺寸变化的梯度（STEP）为10 μm。图3（b）显示从20 μm-100 μm的nBn和pBn探测器的微分电阻和台面面积的乘积R?A随反向偏压的变化曲线。图3（d）中pBn器件的相对平缓的拟合曲线说明了具有较高的侧壁电阻率，根据斜率的倒数计算出约为1.7×10? Ωcm。[align=center][img]https://img1.17img.cn/17img/images/202401/uepic/e7fba8aa-eabe-40a4-a863-6ebcdd264744.jpg[/img][/align][align=center][color=#0070c0]图3 从20 μm到100 μm直径的nBn和pBn器件于室温下的（a）暗电流密度和电压变化曲线和（b）R?A随反向偏压的变化曲线；（c）在400 mV反偏时，pBn和nBn器件R?A随台面直径的变化；（d）（R?A）?1与周长对面积（P/A）变化曲线[/color][/align][b]器件的结电容[/b]图4（a）显示了使用Keithley 4200 CV模块在室温下不同直径的nBn和pBn探测器的结电容随反向偏压的变化曲线，器件直径从20 μm到100 μm按照10 μm梯度（STEP）变化。对于势垒层完全耗尽的pBn探测器，预期器件电容将由AlAsSb/AlSb势垒层电容和InAsSb吸收区耗尽层电容的串联组合给出，其中包括势垒层和上接触层侧的InAsSb耗尽区。[align=center][img]https://img1.17img.cn/17img/images/202401/uepic/c09b63df-6442-42f2-b548-df4f539db6eb.jpg[/img][/align][align=center][color=#0070c0]图4 （a）在室温下不同直径的nBn和pBn探测器的结电容随反向偏压的变化曲线；（b）反偏400 mV下结电容与台面直径的变化曲线。[/color][/align][b]器件的射频响应特性[/b]通过Keysight PNA-X N5247B矢量网络分析仪、探针台和飞秒激光光源，在室温和0-3 V反向偏压下，对不同尺寸的nBn和pBn探测器在10 MHz至67 GHz之间进行了射频响应特性测试。根据图5推算出在3V反向偏压下的40 μm、50 μm、70 μm、80 μm、90 μm、100 μm直径的圆形nBn和pBn红外探测器的3 dB截止频率（f3dB）。势垒型探测器内部载流子输运过程类似光电导探测器，表面载流子寿命对响应速度会产生影响。[align=center][img]https://img1.17img.cn/17img/images/202401/uepic/95acbbf7-8557-4619-b4cd-5829d636aced.jpg[/img][/align][align=center][color=#0070c0]图5 在300 K下施加-3V偏压的40 μm、50 μm、70 μm、80 μm、90 μm、100 μm直径的nBn和pBn探测器的归一化频率响应图[/color][/align][align=center][img]https://img1.17img.cn/17img/images/202401/uepic/541829b0-a336-4b7e-a75b-0a15f8dfd06a.jpg[/img][/align][align=center][color=#0070c0]图6 不同尺寸的nBn和pBn探测器（a）3 dB截止频率随反向偏压变化曲线；（b）在3 V反向偏压下的3 dB截止频率随台面直径变化曲线[/color][/align]图6（a）展示了对不同尺寸的nBn和pBn探测器，在0-3 V反向偏压范围内的3 dB截止频率的结果。随着反向偏压的增大，不同尺寸的器件的3 dB带宽也随之增大。因此，在图6（a）中观察到在低反向偏压下nBn和pBn器件的响应较慢，nBn探测器的截止频率落在60 MHz-320 MHz之间而pBn探测器的截止频率落在70 MHz-750 MHz之间；随着施加偏压的增加，截止频率增加，nBn和pBn器件最高可以达到反向偏压3V下的2.02 GHz和2.62 GHz。pBn器件的响应速度相较于nBn器件提升了约29.7%。[align=center][size=18px][back=#ffff00][b]结论[/b][/back][/size][/align]通过分子束外延法在锑化镓衬底上生长了两种势垒型结构nBn和pBn的InAsSb/AlAsSb/AlSb基中波红外光探测器，经过台面定义、工艺钝化工艺和金属蒸镀工艺制备了可用于射频响应特性测试的GSG探测器。XRD和AFM的结果表示两种结构的外延片都具有较好的晶体质量。探测器的暗电流测试结果表明，在室温和反向偏压400 mV工作时，直径90 μm的pBn器件相较于nBn器件表现出更低的暗电流密度0.145 A/cm2，说明了该器件在室温非制冷环境下表现出低噪声。不同台面直径的探测器的暗电流测试表明，pBn器件的表面电阻率约为1.7×10? Ωcm，对照的nBn器件的表面电阻率为3.1×103 Ωcm，而pBn和nBn的R?A体积项的贡献分别为16.60 Ωcm2和5.27 Ωcm2。探测器的电容测试结果表明，可零偏压工作的pBn探测器具有完全耗尽的势垒层和部分耗尽的吸收区，nBn的吸收区也存在部分耗尽。探测器的射频响应特性表明，直径90 μm的pBn器件的响应速度在室温和3 V反向偏压下可达2.62 GHz，对照的nBn器件的响应速度仅为2.02 GHz，相比提升了约29.7%。初步实现了在中红外波段下可快速探测的室温非制冷势垒型光探测器，对室温中波高速红外探测器及光通讯模块提供技术路线参考。[b]论文链接：[/b][url]http://journal.sitp.ac.cn/hwyhmb/hwyhmbcn/article/abstract/2023157[/url][来源：MEMS][align=right][/align]

  • 【技术突破】复旦大学研制成功新型二维探测器光谱仪

    复旦大学信息科学与工程学院日前研制成功“二维ＣＣＤ阵列探测器”光谱仪，可将光谱图的绘制速度比以前提高约１００倍。目前，该研究成果已获国家发明专利。 所谓“光谱仪”，是用来给光“拍照片”的基础科学仪器，能够对光波的能量、波长、带宽、线型等重要特征进行精细分析，在遥感、生物医学、国防和光电子功能材料等科研领域和产业界有着广泛和重要应用，但此前我国在这一高端科学仪器领域主要依赖进口。 “二维ＣＣＤ阵列探测器”光谱仪由复旦大学信息科学与工程学院院长陈良尧负责研制。此光谱仪将１０个光栅平行“捆绑”起来，成为“集成光栅”，犹如１０面“镜子”各司其职，将不同波长的光子各自分拣出来，同时反射到探测器上。这个光的“捕手”能从根本上摆脱机械转动，在２００－１０００纳米的全光谱区获得高分辨率光谱图，绘制效率也从原来的１０分钟提高到０.１秒钟。 目前，红外至紫外光谱区的主流光谱分析仪器一般为“光栅扫描型”光谱仪，其中“光栅”是“灵魂部件”，其外表类似镜面，作用好似“筛子”，能够将不同波长的光子分拣出来，反射到探测器上，再经过数据处理，从而实现光谱的测量和分析。而传统光谱仪通常采用机械转动装置连续旋转光栅，光栅每转动一次，就“放行”一个波长的光。由于一束光包括多个波长，故光栅需要转动多次才能让光全部通过，比较费时。 此外，“一维 ＣＣＤ阵列探测器”光谱仪，虽然无需转动光栅便可对光谱进行测量，但每次测量仅能覆盖的光谱区范围有限。“二维ＣＣＤ阵列探测器”光谱仪的研制成功，将更精确地实现光谱测量和分析，且大大提高光谱图绘制效率。

  • 急,用什么软件将激光扫描共聚焦显微镜图中亮度处理成曲线图

    用激光扫描共聚焦显微镜扫描出的图,就是只有绿黑两种颜色的图,如何用软件把它处理成表示亮度的曲线图啊,很多文献上看到了,不过不知道怎么弄,听说用matlab可以,还有人能帮帮忙,告诉我怎么样的步骤啊,matlab不会用啊谢谢,心里那个急啊,还望大家顶顶贴啊

  • 【求助】高温观察用激光共焦扫描显微镜的疑惑

    最近在了解高温观察用激光共焦扫描显微镜，看了很多有关采用CLSM观察的高温熔化、凝固和固态相变的观察，感觉很不错。但是我在论坛里看见采用激光扫描共焦显微镜拍摄的很多三维组织图像照片，这种激光共焦扫描显微镜和宝钢、首钢的那种高温观察用的激光扫描共焦显微镜是不是不一样啊？？激光共焦扫描显微镜是不是也分好几种啊，请专家解惑，我刚刚接触，不是很了解。另外高温观察用激光共焦扫描显微镜大概多少钱啊，在哪里买呢，谢谢大家

  • 知芯外延：聚焦短波红外探测器研发，助力西安走上“追光”路

    [color=#000000]陕西知芯外延半导体有限公司（简称：知芯外延）于2022年在秦创原平台支持下成立，基于西安电子科技大学微电子学院的研发团队，企业研究的硅基四族外延晶圆打破了国外的设备、技术封锁，解决了我国的“卡脖子”技术，带动了我国高端光电探测器、硅光集成产业、超高速通讯器件等各个方向产品的升级。[/color][align=center][img]https://img1.17img.cn/17img/images/202402/uepic/c45ee993-8944-4fb1-a1b4-793fe9fb49f5.jpg[/img][/align][color=#000000]知芯外延主要研究具有硅基四族外延晶圆，在不同掺杂、厚度、纳米结构等参数下的成熟生长工艺，同时团队还研发出了基于硅锗外延晶圆的红外探测器芯片。目前企业生产的外延晶圆以硅基四族材料为主，包括硅基锗、硅基硅锗，硅基锗锡等，可应用于红外探测器、激光雷达、光通讯、三四族材料硅基衬底等各个领域。[/color][align=center][img]https://img1.17img.cn/17img/images/202402/uepic/c5db2606-b780-4d94-bda7-1f42d7adfd8e.jpg[/img][/align][color=#000000]基于硅锗外延片的硅锗短波红外探测器，作为一种全新的短波探测器技术路径，其高集成度、低成本的优势，将能够成为代替传统材料实现短波红外大规模、各领域应用。在世界各国争相发展短波红外探测技术的当下，陕西知芯外延半导体为我国的技术突破持续发力。公司已入选陕西省光电子产业重点项目，并与多所研究院、军工单位达成合作。项目促进光电子产业创新链发展的同时，也为产业链的发展提供了核心技术支撑，助力西安走上“追光”路。[/color][来源：MEMS][align=right][/align]

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    [color=#000000]陕西知芯外延半导体有限公司（简称：知芯外延）于2022年在秦创原平台支持下成立，基于西安电子科技大学微电子学院的研发团队，企业研究的硅基四族外延晶圆打破了国外的设备、技术封锁，解决了我国的“卡脖子”技术，带动了我国高端光电探测器、硅光集成产业、超高速通讯器件等各个方向产品的升级。[/color][align=center][img]https://img1.17img.cn/17img/images/202402/uepic/c45ee993-8944-4fb1-a1b4-793fe9fb49f5.jpg[/img][/align][color=#000000]知芯外延主要研究具有硅基四族外延晶圆，在不同掺杂、厚度、纳米结构等参数下的成熟生长工艺，同时团队还研发出了基于硅锗外延晶圆的红外探测器芯片。目前企业生产的外延晶圆以硅基四族材料为主，包括硅基锗、硅基硅锗，硅基锗锡等，可应用于红外探测器、激光雷达、光通讯、三四族材料硅基衬底等各个领域。[/color][align=center][img]https://img1.17img.cn/17img/images/202402/uepic/c5db2606-b780-4d94-bda7-1f42d7adfd8e.jpg[/img][/align][color=#000000]基于硅锗外延片的硅锗短波红外探测器，作为一种全新的短波探测器技术路径，其高集成度、低成本的优势，将能够成为代替传统材料实现短波红外大规模、各领域应用。在世界各国争相发展短波红外探测技术的当下，陕西知芯外延半导体为我国的技术突破持续发力。公司已入选陕西省光电子产业重点项目，并与多所研究院、军工单位达成合作。项目促进光电子产业创新链发展的同时，也为产业链的发展提供了核心技术支撑，助力西安走上“追光”路。[/color][来源：MEMS][align=right][/align]

  • 火焰探测器的工作原理与紫外线探测器的渊源

    火焰探测器的工作原理与紫外线探测器的渊源

    火焰探测器又称感光式火灾探测器，即探测火焰燃烧的光照强度和火焰的闪烁频率的一种火灾探测器。下面工采网小编给大家介绍一下火焰探测器工作原理。火焰燃烧过程释放紫外线、可见光、红外线，在特定波长、特定闪烁频率（0.5HZ-20HZ）具有典型特征，有别于其他干扰辐射，阳光、热物体、电灯等辐射出的紫外线、红外线没有闪烁特征。火焰探测器工作原理是通过检测火焰辐射出的特殊波长的紫外线、红外线及可见光等，同时配合对火焰特征闪烁频率来识别，来探测火焰。一般选用紫外光电二极管、紫外线探测器、紫外线传感器等作为探测元件。[img=,446,450]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/12/201712011704_01_3332482_3.jpg!w446x450.jpg[/img]紫外线探测器是将一种形式的电磁辐射信号转换成另一种易被接收处理信号形式的传感器，光电探测器利用光电效应，把光学辐射转化成电学信号。光电效应可分为外光电效应和内光电效应。外光电效应器件通常指光敏电真空器件，主要用于紫外、红外和近红外等波段。具有内增益的外光电效应器件包括光电敏倍增管、像增强器等光敏电真空器件，它们具有极高灵敏度，能将极微弱的光信号转换成电信号，可进行单光子检测，其灵敏度比内电光效应的半导体器件高几个量级。内光电效应分为光导效应和光伏效应。光导效应中，半导体吸收足够能量的光子后，把其中的一些电子或空穴从原来不导电的束缚状态激活到能导电的自由状态，导致半导体电导率增加、电路中电阻下降。光伏效应中，光生电荷在半导体内产生跨越结的P-N小势差。产生的光电压通过光电器件放大并可直接进行测量。根据光导效应和光伏效应制成的器件分别称为半导体光导探测器和光伏探测器。最后给大家介绍三款性能非常优秀的紫外线探测器和紫外线二极管，都是应用在火焰检测和防紫外辐射源等领域的顶尖产品。[b]德国SGLUX 紫外光电探测器 - TOCON_ABC1[img=,298,298]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/12/201712011705_01_3332482_3.jpg!w298x298.jpg[/img]基于碳化硅的宽频紫外光电探测器，带有集成放大器TOCON是5伏供电的紫外光电探测器，带有的集成放大器使紫外辐射转化成0~5V电压输出。TOCON的输出电压引脚可以直接连接到控制器，电压计或其他带有电压输入的数据分析装置。高度现代化的电子元件和带有紫外玻璃窗的密封金属外壳可消除封装内寄生电阻路径导致的噪声或电磁干扰。对各个工业紫外传感应用来说，TOCON 是完美的解决方案，从pW/cm2水平的火焰检测到W/cm2水平的紫外固化灯控制。十种不同的TOCONs覆盖了这13个数量级范围，它们的灵敏度有所不同。TOCONs生产为紫外宽频传感器或带有过滤器进行选择性测量。在恶劣环境和极低或极高的紫外辐射中，精密电子件使TOCON成为了一个可靠的元器件。但是sglux内部生产的SIC探测器芯片使TOCON成为了永存的准传感器，以PTB所报告的强抗辐射为特点。应用在紫外辐射和火焰检测领域。[b]紫外光电探测器TOCON_ABC1特性：[/b]基于碳化硅的宽频紫外光电探测器放于TO5 外壳中，带有集中器镜头盖0…5 V电压输出峰值波长是280 nm在峰值处最大辐射(饱和极限)是18 nW/cm2 ,最小辐射(分辨极限) 是1,8 pW/cm2[b]德国SGLUX 紫外光电探测器 - TOCON_ABC10[/b][img=,298,298]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/12/201712011705_01_3332482_3.jpg!w298x298.jpg[/img]TOCON是5伏供电的紫外光电探测器，带有的集成放大器使紫外辐射转化成0~5V电压输出。TOCON的输出电压引脚可以直接连接到控制器，电压计或其他带有电压输入的数据分析装置。高度现代化的电子元件和带有紫外玻璃窗的密封金属外壳可消除封装内寄生电阻路径导致的噪声或电磁干扰。对各个工业紫外传感应用来说，TOCON 是完美的解决方案，从pW/cm2水平的火焰检测到W/cm2水平的紫外固化灯控制。十种不同的TOCONs覆盖了这13个数量级范围，它们的灵敏度有所不同。TOCONs生产为紫外宽频传感器或带有过滤器进行选择性测量。在恶劣环境和极低或极高的紫外辐射中，精密电子件使TOCON成为了一个可靠的元器件。但是sglux内部生产的SIC探测器芯片使TOCON成为了永存的准传感器，以PTB所报告的强抗辐射为特点。应用在紫外辐射、淬火控制和火焰检测领域。[b]紫外光电探测器TOCON_ABC10特性：[/b]基于碳化硅的宽频紫外光电探测器放于TO5 外壳中，带有衰减器0…5 V 电压输出峰值波长是290 nm在峰值处最大辐射(饱和极限)是18 nW/cm2 ,最小辐射(分辨极限) 是1,8 mW/cm2[b]德国SGLUX 紫外光电二极管 - SG01D-5LENS[img=,394,291]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/12/201712011706_01_3332482_3.jpg!w394x291.jpg[/img]SiC 具有独特的特性，能承受高强度的辐射，对可见光几乎不敏感，产生的暗电流低，响应速度快和噪音低。这 些特性使SiC成为可见盲区半导体紫外探测器的最佳使用材料。SiC探测器可以一直工作于高达170°C(338°F)的温度中。信号（响应率）的温度系数也很低， 0,1%/K。由于噪音低(fA级的暗电流), 能够有效地检测到极低的紫外辐射强度。请注意这个装置需要配置相应的放大器。(参见第3页中的典型电路)。SiC光电二极管有七个不同的有效敏感面积可供选择，从0.06 mm2 到36 mm2。标准版本是宽频UVA-UVB-UVC。四个滤波版本导致更严格的感光范围。所有光电二极管都有密封的金属外壳（TO型），直径为5.5mm的TO18 外壳或9.2mm 的TO5外壳。进一步的选项是2只引脚（1绝缘，1接地）或3只引脚（2绝缘，1接地）。[b]德国SGLUX 紫外光电二极管 SG01D-5LENS 特点[/b]宽频UVA+UVB+UVC, PTB报道的芯片高稳定性, 用于火焰检测辐射敏感面积 A = 11,0 mm2TO5密封金属外壳和聚光镜, 1绝缘引脚和1接地引脚10μW/cm2 峰值辐射约产生350 nA电流[b]德国SGLUX 紫外光电二极管 SG01D-5LENS参数：[/b][b][img=,690,365]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/12/201712011706_02_3332482_3.jpg!w690x365.jpg[/img][/b][/b][/b]

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