基因甲基化检测

哪位同仁曾用高效液相色谱测过 基因组总水平甲基化程度 交流交流

[color=#444444]我自己接手一个新的实验项目，是用高效液相色谱质谱联用技术测人群的全基因组甲基化水平，想问问有没有哪个大神有做过这个类似的实验么，好多问题都不懂。DNA是之前用试剂盒提取了的，用了蛋白酶K把蛋白质消解了，这种情况下进一步水解DNA还需不需要进一步超滤去蛋白呢（哪个超滤好像好贵，成本好高）；测的时候是不是也需要同时30 毫摩尔每升、pH为6.8的乙酸钠，30毫摩尔每升、pH 为7.8的乙酸钠溶液，具体怎么配啊，能用乙酸调么？谢谢[/color]

我准备分离小RNA，然后用核酸酶将其切成单个核苷酸，ESI质谱，首先先来检测是否有甲基化修饰的核酸，不知道这样行不行。如果行的话，对样品的纯度浓度有什么要求，希望各位有经验的大侠多多指点。先谢过了

高效液相色谱检测DNA总甲基化水平哪位做过高效液相色谱检测DNA总甲基化水平，想请教一下，做这个要求DNA纯度很高么？有了解的帮帮忙，谢了！

[size=20px]DNA[/size][size=20px]甲基化[/size][size=20px]及其影响[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]甲基化是指在[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]甲基转移酶（[/size][size=16px]DNA methyltransferase[/size][size=16px]，[/size][size=16px]DNMT[/size][size=16px]）的催化作用下，[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]双螺旋的胞嘧啶核苷酸嘧啶环的第[/size][size=16px]5[/size][size=16px]位碳原子甲基化，并与其[/size][size=16px]3[/size][font='等线'][size=16px]'[/size][/font][size=16px]端鸟嘌呤形成甲基化的胞嘧啶[/size][size=16px]-[/size][size=16px]鸟嘌呤二核苷酸[/size][size=16px](Cytosine -phosphoric acid-Guanine, CpG)[/size][size=16px]。[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]低甲基[/size][size=16px]化增加[/size][size=16px]染色体不稳定性[/size][size=16px],[/size][size=16px]启动子[/size][size=16px]CpG[/size][size=16px]岛局部高甲基化可使其下游基因[/size][size=16px]([/size][size=16px]包括抑癌基因[/size][size=16px])[/size][size=16px]失活从而发挥致癌作用。与[/size][size=16px]TCGA (The Cancer Genome Atlas)[/size][size=16px]数据库中其他癌种相比，[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]的[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]启动子甲基化水平是最高的[/size][font='times new roman'][sup][size=16px][1][/size][/sup][/font][size=16px]，它与[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]神经内分泌特性关系密切，影响[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]发生发展。[/size][size=20px]1.1 DNA[/size][size=20px]甲基化定义[/size][size=20px]SCLC[/size][size=20px]不同亚型且影响[/size][size=20px]SCLC[/size][size=20px]神经内分泌特性[/size][size=16px]Poirier[/size][size=16px]等[/size][font='times new roman'][sup][size=16px][1][/size][/sup][/font][size=16px]发现甲基化与基因表达相关并能区分原发性[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]亚型。[/size][size=16px]M1[/size][size=16px]、[/size][size=16px]M2[/size][size=16px]和[/size][size=16px]SQ-P[/size][size=16px]是[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]三个亚型，它们具有不同的甲基化模式和基因表达，[/size][size=16px]SQ-P[/size][size=16px]甲基化频率明显低于[/size][size=16px]M1[/size][size=16px]和[/size][size=16px]M2[/size][size=16px]。但这种分型与[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]临床预后无关。随后，[/size][size=16px]Saito Yuichi [/size][font='times new roman'][sup][size=16px][2][/size][/sup][/font][size=16px]等发现了甲基化模式和预后均不同的两种[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]类型[/size][size=16px]:[/size][size=16px]一类是[/size][size=16px]CpG[/size][size=16px]岛甲基化表型[/size][size=16px](CpG island methylator phenotype, CIMP)[/size][size=16px]整体高而预后差的聚类[/size][size=16px]1 (SCLC CIMP)[/size][size=16px]，另一类是[/size][size=16px]CIMP[/size][size=16px]低而预后较好的聚类[/size][size=16px]2 (non-CIMP)[/size][size=16px]。他们证明了甲基化水平的升高与预后不良有关，[/size][size=16px]SCLC CIMP[/size][size=16px]可能是手术治疗的预后指标。因此，我们可以利用[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]甲基化及基因表达分析定义[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]亚型并进一步预测[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]临床预后。[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]起源于肺神经内分泌细胞。[/size][size=16px]Kalari[/size][size=16px]等[/size][font='times new roman'][sup][size=16px][3][/size][/sup][/font][size=16px]发现[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]的[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]甲基化图谱提示神经内分泌细胞存在分化缺陷，甲基化基因作为转录因子在神经元分化过程中显著富集。他们推测[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]的起源可能有两种机制：一是启动子甲基化导致细胞分化过程中关键转录因子的缺失；二是[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]甲基化导致相应结合位点区域的功能失活使起源细胞向恶性状态发展。二者共同促进神经内分泌细胞分化缺陷，增强肿瘤干细胞向其转化的能力。由此可见，[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]甲基[/size][size=16px]化通过[/size][size=16px]影响[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]神经内分泌特性来影响[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]发生发展。[/size][size=20px]1[/size][size=20px].2 [/size][size=20px]DNA[/size][size=20px]甲基化可筛选早期[/size][size=20px]SCLC[/size][size=16px]肺癌的发展是一个多步骤的过程，其中包括[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]状态的改变。肿瘤相关基因启动子高甲基化是一种常见的改变，常与抑癌基因失活相关，由于其稳定性好，易于在组织和体液中检测，可作为癌症检测和监测的候选生物标志物[/size][font='times new roman'][sup][size=16px][4][/size][/sup][/font][size=16px]。有研究者利用[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]甲基[/size][size=16px]化板通过[/size][size=16px]血液活检的方式对肺癌男性患者进行早期筛选，发现[/size][size=16px] RAS[/size][size=16px]相关区域家族[/size][size=16px]1A[/size][size=16px]基因[/size][size=16px](Ras association domain family 1A gene, RASSF1A)[/size][size=16px]对[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]的敏感性为[/size][size=16px]75%[/size][size=16px]，特异性为[/size][size=16px]88%[/size][size=16px]。基于此，异常的[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]启动子甲基[/size][size=16px]化可能[/size][size=16px]是一个有价值的早期[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]微创检测方法，可以提高患者的依从性、降低医疗成本并有助于癌症分型和预后[/size][font='times new roman'][sup][size=16px][5][/size][/sup][/font][size=16px]。但这项研究只针对男性，研究成果是否可以应用于所有人群仍需进一步验证[/size][size=20px]1.3 [/size][size=20px]DNA[/size][size=20px]甲基化与[/size][size=20px]SCLC[/size][size=20px]耐药相关[/size][size=16px]H3[/size][size=16px]赖氨酸[/size][size=16px]27[/size][size=16px]三[/size][size=16px]甲基化[/size][size=16px](H3K27me3) [/size][size=16px]与多药耐药有关，它由[/size][size=16px]ZEST[/size][size=16px]同源增强子[/size][size=16px]2(EZH2)[/size][size=16px]催化，二者在[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]组织和多药耐药的[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]细胞中的表达水平明显升高。长链非编码[/size][size=16px]RNA (lncRNA) HOX[/size][size=16px]转录本反义[/size][size=16px]RNA (HOTAIR)[/size][size=16px]可以预测肿瘤进展。[/size][size=16px]HOTAIR[/size][size=16px]通过下调耐药[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]中[/size][size=16px]DNMT1[/size][size=16px]和[/size][size=16px]DNMT3b[/size][size=16px]的表达来调节[/size][size=16px]HOXA1[/size][size=16px]的[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]甲基化。研究表明，在[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]细胞系中，敲除[/size][size=16px]HOTAIR[/size][size=16px]基因可显著降低[/size][size=16px]H3K27me3[/size][size=16px]和[/size][size=16px]EZH2[/size][size=16px]水平，且二者通过[/size][size=16px]HOTAIR[/size][size=16px]来影响[/size][size=16px]HOXA1 DNA[/size][size=16px]甲基化，[/size][size=16px]H3K27me3[/size][size=16px]很可能是[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]化疗耐药的潜在治疗靶点[/size][font='times new roman'][sup][size=16px][6][/size][/sup][/font][size=16px]。位于人端粒酶逆转录酶[/size][size=16px](HTERT)[/size][size=16px]启动子区的表观遗传学改变是癌症中最常见的非编码基因组修饰之一。[/size][size=16px]HTERT[/size][size=16px]上调可促进[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]细胞系的增殖和迁移，其启动子区经辐射诱导后的高度甲基化可上调其下游效应因子[/size][size=16px]EZH2[/size][size=16px]的表达从而使[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]具有放射抗性[/size][font='times new roman'][sup][size=16px][7][/size][/sup][/font][size=16px]。胞质三核苷酸修复外切酶[/size][size=16px]1(TREX1)[/size][size=16px]是一种高效的[/size][size=16px]3[/size][size=16px]’[/size][size=16px]→[/size][size=16px] 5[/size][size=16px]’[/size][size=16px]胞质外切酶，能迅速降解双链和单链[/size][size=16px]DNA([/size][size=16px]双链和单链[/size][size=16px]DNA)[/size][font='times new roman'][sup][size=16px][8][/size][/sup][/font][size=16px]。[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]细胞系在[/size][size=16px]CCLE[/size][size=16px]中具有最高的[/size][size=16px]TREX1[/size][size=16px]甲基化和最低的[/size][size=16px]TREX1[/size][size=16px]表达，低[/size][size=16px]TREX1[/size][size=16px]可增加[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]对[/size][size=16px]Aurora[/size][size=16px]激酶抑制剂治疗的敏感性，可作为[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]新的分子标记或靶点[/size][font='times new roman'][sup][size=16px][9][/size][/sup][/font][size=16px]。[/size][size=16px]Y[/size][size=16px]样染色体基因（[/size][size=16px]Chromo-domain Y like[/size][size=16px]，[/size][size=16px]CDYL[/size][size=16px]）是一种新型表观遗传因子，调控神经系统的神经元发育。[/size][size=16px]CDYL[/size][size=16px]通过调控[/size][size=16px]CDKN1C[/size][size=16px]启动子[/size][size=16px]H3K27[/size][size=16px]三[/size][size=16px]甲基化来促进[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]化疗耐药，且其表达水平与患者临床分期相关，可用于预测[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]患者的疾病进展和预后，为[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]临床诊治提供了一个新的分子靶点[/size][font='times new roman'][sup][size=16px][10][/size][/sup][/font][size=16px]。[/size][size=16px]综上，[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]甲基化在[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]中水平较高，甲基化分析可以区分[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]亚型，阐明[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]发病及耐药机制，发现癌症的特异性生物标志物，有助于[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]早期诊断及判断预后。[/size]

[size=20px]1 DNA[/size][size=20px]甲基化[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]甲基化是指在[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]甲基转移酶（[/size][size=16px]DNA methyltransferase[/size][size=16px]，[/size][size=16px]DNMT[/size][size=16px]）的催化作用下，[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]双螺旋的胞嘧啶核苷酸嘧啶环的第[/size][size=16px]5[/size][size=16px]位碳原子甲基化，并与其[/size][size=16px]3[/size][font='等线'][size=16px]'[/size][/font][size=16px]端鸟嘌呤形成甲基化的胞嘧啶[/size][size=16px]-[/size][size=16px]鸟嘌呤二核苷酸[/size][size=16px](Cytosine -phosphoric acid-Guanine, CpG)[/size][size=16px]。[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]低甲基[/size][size=16px]化增加[/size][size=16px]染色体不稳定性[/size][size=16px],[/size][size=16px]启动子[/size][size=16px]CpG[/size][size=16px]岛局部高甲基化可使其下游基因[/size][size=16px]([/size][size=16px]包括抑癌基因[/size][size=16px])[/size][size=16px]失活从而发挥致癌作用。与[/size][size=16px]TCGA (The Cancer Genome Atlas)[/size][size=16px]数据库中其他癌种相比，[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]的[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]启动子甲基化水平是最高的[/size][font='times new roman'][size=16px][1][/size][/font][size=16px]，它与[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]神经内分泌特性关系密切，影响[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]发生发展。[/size][size=20px]1.1 DNA[/size][size=20px]甲基化定义[/size][size=20px]SCLC[/size][size=20px]不同亚型且影响[/size][size=20px]SCLC[/size][size=20px]神经内分泌特性[/size][size=16px]Poirier[/size][size=16px]等[/size][font='times new roman'][size=16px][1][/size][/font][size=16px]发现甲基化与基因表达相关并能区分原发性[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]亚型。[/size][size=16px]M1[/size][size=16px]、[/size][size=16px]M2[/size][size=16px]和[/size][size=16px]SQ-P[/size][size=16px]是[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]三个亚型，它们具有不同的甲基化模式和基因表达，[/size][size=16px]SQ-P[/size][size=16px]甲基化频率明显低于[/size][size=16px]M1[/size][size=16px]和[/size][size=16px]M2[/size][size=16px]。但这种分型与[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]临床预后无关。随后，[/size][size=16px]Saito Yuichi [/size][font='times new roman'][size=16px][2][/size][/font][size=16px]等发现了甲基化模式和预后均不同的两种[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]类型[/size][size=16px]:[/size][size=16px]一类是[/size][size=16px]CpG[/size][size=16px]岛甲基化表型[/size][size=16px](CpG island methylator phenotype, CIMP)[/size][size=16px]整体高而预后差的聚类[/size][size=16px]1 (SCLC CIMP)[/size][size=16px]，另一类是[/size][size=16px]CIMP[/size][size=16px]低而预后较好的聚类[/size][size=16px]2 (non-CIMP)[/size][size=16px]。他们证明了甲基化水平的升高与预后不良有关，[/size][size=16px]SCLC CIMP[/size][size=16px]可能是手术治疗的预后指标。因此，我们可以利用[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]甲基化及基因表达分析定义[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]亚型并进一步预测[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]临床预后。[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]起源于肺神经内分泌细胞。[/size][size=16px]Kalari[/size][size=16px]等[/size][font='times new roman'][size=16px][3][/size][/font][size=16px]发现[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]的[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]甲基化图谱提示神经内分泌细胞存在分化缺陷，甲基化基因作为转录因子在神经元分化过程中显著富集。他们推测[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]的起源可能有两种机制：一是启动子甲基化导致细胞分化过程中关键转录因子的缺失；二是[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]甲基化导致相应结合位点区域的功能失活使起源细胞向恶性状态发展。二者共同促进神经内分泌细胞分化缺陷，增强肿瘤干细胞向其转化的能力。由此可见，[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]甲基[/size][size=16px]化通过[/size][size=16px]影响[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]神经内分泌特性来影响[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]发生发展。[/size][size=20px]1[/size][size=20px].2 [/size][size=20px]DNA[/size][size=20px]甲基化可筛选早期[/size][size=20px]SCLC[/size][size=16px]肺癌的发展是一个多步骤的过程，其中包括[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]状态的改变。肿瘤相关基因启动子高甲基化是一种常见的改变，常与抑癌基因失活相关，由于其稳定性好，易于在组织和体液中检测，可作为癌症检测和监测的候选生物标志物[/size][font='times new roman'][size=16px][4][/size][/font][size=16px]。有研究者利用[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]甲基[/size][size=16px]化板通过[/size][size=16px]血液活检的方式对肺癌男性患者进行早期筛选，发现[/size][size=16px] RAS[/size][size=16px]相关区域家族[/size][size=16px]1A[/size][size=16px]基因[/size][size=16px](Ras association domain family 1A gene, RASSF1A)[/size][size=16px]对[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]的敏感性为[/size][size=16px]75%[/size][size=16px]，特异性为[/size][size=16px]88%[/size][size=16px]。基于此，异常的[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]启动子甲基[/size][size=16px]化可能[/size][size=16px]是一个有价值的早期[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]微创检测方法，可以提高患者的依从性、降低医疗成本并有助于癌症分型和预后[/size][font='times new roman'][size=16px][5][/size][/font][size=16px]。但这项研究只针对男性，研究成果是否可以应用于所有人群仍需进一步验证[/size][size=20px]1.3 [/size][size=20px]DNA[/size][size=20px]甲基化与[/size][size=20px]SCLC[/size][size=20px]耐药相关[/size][size=16px]H3[/size][size=16px]赖氨酸[/size][size=16px]27[/size][size=16px]三[/size][size=16px]甲基化[/size][size=16px](H3K27me3) [/size][size=16px]与多药耐药有关，它由[/size][size=16px]ZEST[/size][size=16px]同源增强子[/size][size=16px]2(EZH2)[/size][size=16px]催化，二者在[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]组织和多药耐药的[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]细胞中的表达水平明显升高。长链非编码[/size][size=16px]RNA (lncRNA) HOX[/size][size=16px]转录本反义[/size][size=16px]RNA (HOTAIR)[/size][size=16px]可以预测肿瘤进展。[/size][size=16px]HOTAIR[/size][size=16px]通过下调耐药[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]中[/size][size=16px]DNMT1[/size][size=16px]和[/size][size=16px]DNMT3b[/size][size=16px]的表达来调节[/size][size=16px]HOXA1[/size][size=16px]的[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]甲基化。研究表明，在[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]细胞系中，敲除[/size][size=16px]HOTAIR[/size][size=16px]基因可显著降低[/size][size=16px]H3K27me3[/size][size=16px]和[/size][size=16px]EZH2[/size][size=16px]水平，且二者通过[/size][size=16px]HOTAIR[/size][size=16px]来影响[/size][size=16px]HOXA1 DNA[/size][size=16px]甲基化，[/size][size=16px]H3K27me3[/size][size=16px]很可能是[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]化疗耐药的潜在治疗靶点[/size][font='times new roman'][size=16px][6][/size][/font][size=16px]。位于人端粒酶逆转录酶[/size][size=16px](HTERT)[/size][size=16px]启动子区的表观遗传学改变是癌症中最常见的非编码基因组修饰之一。[/size][size=16px]HTERT[/size][size=16px]上调可促进[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]细胞系的增殖和迁移，其启动子区经辐射诱导后的高度甲基化可上调其下游效应因子[/size][size=16px]EZH2[/size][size=16px]的表达从而使[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]具有放射抗性[/size][font='times new roman'][size=16px][7][/size][/font][size=16px]。胞质三核苷酸修复外切酶[/size][size=16px]1(TREX1)[/size][size=16px]是一种高效的[/size][size=16px]3[/size][size=16px]’[/size][size=16px]→[/size][size=16px] 5[/size][size=16px]’[/size][size=16px]胞质外切酶，能迅速降解双链和单链[/size][size=16px]DNA([/size][size=16px]双链和单链[/size][size=16px]DNA)[/size][font='times new roman'][size=16px][8][/size][/font][size=16px]。[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]细胞系在[/size][size=16px]CCLE[/size][size=16px]中具有最高的[/size][size=16px]TREX1[/size][size=16px]甲基化和最低的[/size][size=16px]TREX1[/size][size=16px]表达，低[/size][size=16px]TREX1[/size][size=16px]可增加[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]对[/size][size=16px]Aurora[/size][size=16px]激酶抑制剂治疗的敏感性，可作为[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]新的分子标记或靶点[/size][font='times new roman'][size=16px][9][/size][/font][size=16px]。[/size][size=16px]Y[/size][size=16px]样染色体基因（[/size][size=16px]Chromo-domain Y like[/size][size=16px]，[/size][size=16px]CDYL[/size][size=16px]）是一种新型表观遗传因子，调控神经系统的神经元发育。[/size][size=16px]CDYL[/size][size=16px]通过调控[/size][size=16px]CDKN1C[/size][size=16px]启动子[/size][size=16px]H3K27[/size][size=16px]三[/size][size=16px]甲基化来促进[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]化疗耐药，且其表达水平与患者临床分期相关，可用于预测[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]患者的疾病进展和预后，为[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]临床诊治提供了一个新的分子靶点[/size][font='times new roman'][size=16px][10][/size][/font][size=16px]。[/size][size=16px]综上，[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]甲基化在[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]中水平较高，甲基化分析可以区分[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]亚型，阐明[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]发病及耐药机制，发现癌症的特异性生物标志物，有助于[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]早期诊断及判断预后。[/size]

看一篇关于一种除草剂（灭草松）的农残检测方法，其中前处理说到要用重氮甲烷进行甲基化以后才能进GC—ECD检测，想请教大家的是甲基化的作用是什么？为什么一定要甲基化这个步骤？

我最近想做两种带羧基的化合物GC/MS检测，需要进行甲基化衍生。但我不想使用三氟化硼甲醇试剂，我查了一下，使用三氟甲基磺酸甲酯、N,N-二甲基二甲缩醛、硫酸二甲酯等也可以进行甲基化衍生，有没有高人推荐一下，使用哪个比较好啊？

我现在想探讨鱼类胚胎发育和总基因组DNA甲基化之间的关系，因此想用高效液相色谱测定总基因组DNA甲基化水平，即总基因组５甲基孢嘧啶含量，急需这方面的文献　请大虾们帮一下[color=red]楼主，在本版面发帖前请您仔细的看看置顶中的规定！！！[/color]

DNA甲基化是表观遗传学的重要研究内容之一，它可以在转录水平抑制基因的表达。具体的过程是在胞嘧啶－鸟嘧啶（CpG二核苷酸）的5位碳原子上添加了一个额外的甲基团，形成5－甲基胞嘧啶。CpG二核苷酸密度较高的区域在人体基因组中呈非随机分布于，优先分布于基因的启动子区，并被称为CpG岛 。对于癌症，其基因组的甲基化分布发生变化 。正常状态下应甲基化的区域未甲基化，而症状状态下非甲基化区域出现甲基化，例如CpG岛相关启动子呈超甲基化。这可导致受累基因座的染色质结构发生变化，致使基因沉默。启动子超甲基化可导致有关肿瘤演进的重要基因再次沉默，例如那些有关DNA修复、细胞周期调控和凋亡的基因。因此，可以认为DNA甲基化与肿瘤研究密切相关。肿瘤中某些基因的DNA甲基化状态的变化通过其生物学特征反映出来。因此，评估DNA甲基化的快速高通量方法对研究者和临床医生在诊断、治疗和预后都非常有实用价值 。当前对于DNA甲基化研究，普遍使用的方法有甲基化特异性PCR，变性高效液相色谱法（DHPLC），联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法（COBRA）等，这些方法各有优势，但是均存在诸如实验设计复杂，易产生假阴性或假阳性等问题，提示科学家寻找更加容易且准确的分析手段。甲基化敏感性高分辨熔解分析（MS-HRM）是近年兴起的一种适用于评估特定基因DNA甲基化的新技术。它基于当前实时荧光PCR仪器的前沿应用 – 高分辨率熔解曲线分析（HRM），使用既可扩增甲基化序列也可扩增非甲基化序列的引物对来自经重亚硫酸盐修饰的DNA的相关区进行PCR扩增。重亚硫酸盐修饰DNA，让非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5－甲基胞嘧啶保持不变，随后通过PCR扩增检测感兴趣区域的甲基化状态。在MS-HRM中，在饱和的DNA结合染料存在的情况下进行PCR反应，在扩增后进行高分辨熔解曲线分析，HRM分析的特点为可以区分扩增产物中少至1个碱基变化的序列差异，从而通过尿嘧啶/胞嘧啶的差异判断扩增子来源于甲基化还是非甲基化的初始模板变异体。MS-HRM可评估引物之间整条扩增子的甲基化状态。由于它是一种闭管方法，可初步快速评估甲基化。相比于传统的方法，它的成本低廉，分辨率高，通量灵活（最多一次筛查384个样本，最少几个样本），并且准确率大大提升。结合标准品的特征熔解曲线，还可以对样本中存在的甲基化DNA比率进行基本的定量。更多有关特定CpG位点的甲基化的详细信息，可采用重亚硫酸氢盐修饰后测序分析。http://www.biomart.cn/upload/asset/2010/07/30/1280471779.jpgLightCycler主要应用：实时荧光PCR技术进行快速准确的DNA甲基化分析我们使用罗氏诊断公司的LightCycler®480高分辨熔解扩增试剂盒在LightCycler®480实时荧光PCR仪上，通过MS-HRM测定法对两种已知的经过启动子（FANCE和MGMT）甲基化的DNA修复基因的检测性能。材料和方法将多种细胞株的DNA样本作为检测模板。每μg的每种DNA样本都经过重亚硫酸盐修饰。通过在正常DNA（经过重亚硫酸盐修饰）池中按50％、25％、10%、5％和1％稀释100％的甲基化对照DNA（经过重亚硫酸盐修饰）以创建甲基化标准品。MS-HRM引物按Wojdacz和Hansen描述的方法设计。使用LightCycler®480高分辨熔解扩增试剂盒在96孔LightCycler®480仪器中执行扩增和熔解反应。http://www.biomart.cn/upload/asset/2010/07/30/1280471781.jpg图1：（a）含100％甲基化和非甲基化质控品和50％、25％、10％、5％和1％的甲基化标准品的FANCE MS-HRM测定法。使用“Tm Calling”和“HRM基因扫描”软件模块分析的数据。（b）含100％甲基化和非甲基化质控品和50％、25％、10％、5％和1％的甲基化标准品的MGMT MS-HRM测定法。使用“Tm Calling”和“HRM基因扫描”软件模块分析的数据。

我做[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]要甲基化，用重氮甲烷，ECD检测器 ，但是重氮甲烷太不稳定，毒性又大，请大家给点建议吧，谢啦！

大家好，我们在进行蛋白质修饰鉴定过程中，发现有异亮氨酸甲基化的修饰（采用二级CID碎裂模式），分析软件（BioPharmaView)中给定的修饰中也含有异亮氨酸，为了确定甲基化修饰的机理，我们推测，甲基化修饰在了异亮氨酸形成的肽键N上，对此我们使用etHCD碎裂模式进行二级碎裂，结果显示，甲基化并非修饰在肽键N上，我们查询文献并没有相关的报道，想问下各位大神，有知道蛋白中异亮氨酸发生甲基化是发生在哪个位置么？如果有文献支持就更好了。

各位前辈,请问什么是甲基化酒精?怎样才能制备?国内有哪家厂家在生产?甲基化酒精是不是也称为甲乙醚?一下子问这么多问题是因为真的很急,非常感谢大家!!

请问各位老师葡萄糖甲苷2位甲基化和3位甲基化在弱极性[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]柱中的出峰顺序，最近在DB-17MS柱分析葡萄糖甲苷的甲基化样品时，有两个峰可以确定是葡萄糖甲苷2位甲基化和3位甲基化，但是由于质谱图很类似，碎片离子相同，只是个别丰度不同；所以无法归属。不知各位老师有没有做过这方面的研究，谢谢赐教。

用什么方法区分甲基化发生在哪个氮上？

请问各位老师葡萄糖甲苷2位甲基化和3位甲基化在弱极性[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]柱中的出峰顺序，最近在DB-17MS柱分析葡萄糖甲苷的甲基化样品时，有两个峰可以确定是葡萄糖甲苷2位甲基化和3位甲基化，但是由于质谱图很类似，碎片离子相同，只是个别丰度不同；所以无法归属。不知各位老师有没有做过这方面的研究，谢谢赐教。

请问，脂类的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/bp][color=#3333ff]气质联用[/color][/url]测定一定要甲基化吗？

六甲基二硅胺烷和三甲基氯硅烷作为硅甲基化试剂与醇的反应机理！ 另外，六甲基二硅胺烷可以与醇反应，为什么还要加入三甲基氯硅烷？三甲基氯硅烷不是也可以与醇反应吗？请指教！

要做气相色谱，但是甲基化不清楚具体怎么做，你当时怎么解决的，请赐教，谢谢！

请问脂肪酸用BF3-甲醇甲基化之后，加进去的那个甲基C在计算同位素比例时，该如何反算C同位素比例呢?

随着生物知识的普及，仪器的广泛使用，人们对基因、DNA充满了好奇，是否想了解一下DNA检测方面的知识呢？如果您身边有LCMS,也许您也可以一试喔！为您分享一篇DNA甲基化的检测方法，如果好奇，那就动手试试吧。

科技日报讯（戴欣郭阳虎）近日，解放军302医院临床检验医学中心科研人员开发出一种针对丙型肝炎患者的新型基因检测技术。该技术对患者本身的白介素28B基因进行多态性分析，在国内率先将多色荧光探针技术（PCR）运用于丙肝患者临床抗病毒疗效的预测和评估中。这为快速检测丙肝患者对某种抗病毒药物是否有效提供了重要依据，从而能更有效地指导临床医务人员准确选择用药，提升治疗效果。 由于患者身体基因型的不同而导致抗病毒用药使用疗效的差异，一直是广大医师用药的困扰。业界许多专家认为，丙肝患者体内白介素28B基因的分布与抗病毒疗效可能存在非常密切的关系，掌握其分布有助于更准确的用药选择。目前国内外科研人员已相继开发了多项针对这一基因位点的检测技术，但由于操作程序复杂、周期长、准确性较差，很难应用推广，给丙肝临床诊断治疗带来一定困难。 302医院的临床检验医学中心毛远丽和王海滨带领的课题组，通过对上千例丙肝患者基因样本进行分析、检测，成功研制出一套针对丙肝患者的抗病毒治疗易感基因检测技术。该技术对多组白介素28B的基因进行筛选，通过合成DNA序列探针，构建双色荧光PCR体系，通过对患者的染色体内白介素28B的基因进行多态性分析，从而得出患者本身个别基因突变的位点。运用该方法，一小时即可完成检测，快速准确，能为患者的临床治疗提供更加准确有效的诊疗依据。 该技术在国内率先将多色荧光探针技术运用于丙肝患者临床抗病毒疗效的预测和评估，大大提高了丙肝临床诊治水平，也标志丙肝个性化诊疗迈出了重要一步。它有助于临床医生更好地选择适合丙肝患者的个性化治疗方案，准确选择抗病毒药物的种类和治疗持续时间，有效缩短患者治疗时间的同时减少就医成本。来源：中国科技网-科技日报 作者：郭阳虎 2014年01月21日

基因芯片实验操作流程包括样本DNA或RNA制备、标记、杂交及洗涤等步骤http://img1.jiansuo.net/trademd/upload/asset/meeting/2010/12/02/1291289644.JPG 基因芯片实验操作流程图 1、样本DNA或RNA制备 芯片实验中核酸的抽提没有特殊之处，参照常规的分子生物学实验手册就可以。但对于RNA样本，由于RNA的稳定性很差，在活体内的半衰期也很短，因此取材一定要新鲜，取材后迅速保存在液氮中，在整个处理过程中要非常小心，以免降解，影响实验成功率或结果的可靠性。 2、核酸标记方式 分子生物学常用的标记方法有同位素标记和非同位素标记方法，常用的同位素有33 P、32 P、125 I及3 H等化学发光标记和荧光标记，非同位素标记方法又分为化学发光法和荧光法。常用的化学发光物质有碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶，它们能催化相应的底物产生有颜色的沉淀物；生物素和地高辛是最常用的非同位素标记物。很多荧光染料、碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶可直接同抗地高辛抗体及亲和素偶联。而目前常用的荧光染料种类有德克萨斯红(Texasred)、荧光系、罗丹明、Cy3、Cy5等。生物芯片中的标记方法普遍采用荧光方法，很少采用化学发光法和同位素标记方法。 核酸样本通常采用酶反应法进行标记，蛋白质样本采用化学方法或抗体―抗原间接标记的方式。核酸中常用的酶反应方法有：反转录法、随机引物法、切口平移(nicktranslation)、PCR、体外转录等。在酶反应过程中掺人带荧光的dNTP，从而标记新合成的核酸分子。如果酶反应中需要引物，如PCR、随机引物法和反转录法，也可以将荧光基团通过化学反应加到引物的末端。 3、样品标记方法 样本标记方法很多，这里仅举几种常用的方法。 (1) RNA标记方法：对于表达谱基因芯片和RNA不同剪切体的研究，是针对RNA样本进行标记。最常见的标记方式是用Cy3或Cy5荧光，通过反转录标记法，选择不同激发波长的荧光标记不同的样本。如Cy3或Cy5标记的dNTP，通过酶反应掺人到待测样品中，便可以在一张片子上同时检测两份标本的信息，做到平行性比较，数据更可靠。另外，由于反转录法所需RNA样本量大，一般需要20fig的总RNA。对于微量的组织样本很难制备足够的RNA，这时可以采用RNA线性扩增方法，最普遍采用的RNA扩增方法是RNA体外线性扩增方法。 (2) DNA样本的标记方法：当对样本进行CGH分析、SNP、分子分型或甲基化研究时，主要选用DNA作为样本。对于CGH，可以进行全基因组标记，通常采用随机引物标记方法。这种方法需要的DNA量大，一般在2pg以上的基因组DNA。虽然有人发明了全基因组DNA的线性扩增技术以减少对样本量的需求，但效果上都不很理想，很难真正做到全基因组及完全的线性扩增。对于SNP研究，可以采用类似CGH的标记方式进行全基因组标记。由于SNP检测的是DNA的“质”，而不像表达谱或CGH质检测核酸的“量”，因此不必要考虑标记时DNA的线性关系，可以采用其他的全基因组的扩增方法。但由于杂交条件的限制，一般难以做到真正意义上的高通量。因此，一般只是选择少数目的基因的少数SNP位点进行研究，可以采用多重PCR标记方法标记目的片段代替全基因组标记。甲基化研究有两种方案，一种采用SNP的检测原理，另一种类似CGH的方法。

【序号】：1【作者】： 敖红伟1冯树波1,2杨配贤【题名】：均相羧甲基化法合成脂肪酸单乙醇胺醚羧酸钠的研究【期刊】：化学研究与应用. 【年、卷、期、起止页码】：2017,29(09)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7iAEhECQAQ9aTiC5BjCgn0RlhmTWqSjrA_ziVBgNcxfF5qCO4-2-2Ud1F5Mcax12n8&uniplatform=NZKPT

【序号】：1【作者】：敖红伟1冯树波1,2杨配贤2【题名】：均相羧甲基化法合成脂肪酸单乙醇胺醚羧酸钠的研究【期刊】：化学研究与应用 . 【年、卷、期、起止页码】：2017(09)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=xEDmK2-VgJhzSornE3iMA3TbUnHcBybK2x7M_8rpF8g7Ey4OjEizRIFWHgkgmLy_-tfEEs8RMir3EL7oWJEDkaHDDfQrrbd1-ZbODTEtTbo7D-tNXpIndr8Y4e_PY5NIvUHcjStkNDPbTnKc5R8mMpDTJUttr1mRNQd4O9kvZxsxmzGFEALk7c9xxJ6GsgySBO7se-H_98A=&uniplatform=NZKPT&language=CHS

BF3- 甲醇与ROOH反应甲基化，生成的产物应该是ROOCH3，还是ROOBF3呢？我觉得是前者，别人说是后者。

事件一：7月4日，俄罗斯总统普京签署法令，禁止在俄境内种植转基因作物、养殖转基因动物、生产转基因食品，并禁止俄罗斯进口转基因食品，违者将处以罚款。=======================================================================事件二：7月29日，美国总统奥巴马签署了一项有关转基因食品销售的法律，要求生产商在食品包装上标注其是否含有转基因成分，从而让消费者“买得明白”。======================================================================= 美俄两个超级大国在转基因领域的大动作，代表着一个趋势，那就是政府部门对转基因食品的监管会越来越严格，立法越来越完善，因此对检测的技术要求也会越来越高。那么目前国内转基因发展现状，转基因成分的检测技术都有哪些，依据什么原理，准确度怎么样呢，就由小编为大家简单介绍一下。~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~据国际农业生物技术应用服务组织（ISAAA）统计报道，目前国内共批准60项转基因作物事件，分别为转基因玉米17项、转基因阿根廷油菜12项、转基因大豆10项、转基因棉花10项、转基因西红柿3项、转基因水稻2项、转基因杨树2项及转基因甜椒、转基因甜菜、转基因矮牵牛花和转基因木瓜各1项。转基因技术的核心是对物种遗传物质进行人为改造，导入外源基因，从而获得预期的目的性状。因此可以通过检测材料中是否含有外源启动子、终止子、标记基因、目的基因(抗虫、抗除草剂、抗病和抗逆等基因)及其表达产物来判断是否含有转基因成分。目前国内外对转基因成分的检测从原理上可以分为两类，基于外源蛋白靶标检测和基于外源核酸成分检测。基于外源蛋白靶标的检测技术主要是以免疫分析技术为基础，利用转基因作物产生的特定的外源蛋白与抗体的特异性识别进行检测和定量的技术。常见的基于外源蛋白靶标的转基因检测技术包括酶联免疫吸附技术（ELISA）、蛋白印迹（Western blot）检测技术、免疫层析试纸条技术及蛋白质芯片技术（Protein chip）等。ELISA方法和免疫层析试纸条法快速准确，但仅可检测一种目标蛋白，而蛋白质芯片可通过设计不同的探针阵列和特定的检测方法，使一次反应同时检测多个蛋白，具有通量高、微型且自动化等优点，但背景信号高、蛋白质活性难以长久保持。蛋白质检测方法往往不能检测加工食品，而且受目的蛋白质在转基因作物中的表达部位、表达时间及环境等的影响，限制了其应用。而核酸成分，尤其是DNA，因其稳定性好，在加工过程中不易降解，被广泛用于转基因检测中。基于外源核酸成分的检测方法主要包括 PCR 技术、恒温扩增技术、基因芯片技术等。PCR技术已经成为转基因作物及产品日常检测工作中应用最广泛的技术，国内以及国际发布的食品和饲料中转基因产品的检测标准方法大都采用的PCR技术原理，应用普通PCR方法或实时荧光定量PCR可以对检测样品进行定性和定量检测。在此基础上，新的PCR技术如巢式和半巢式 PCR、多重 PCR、PCR-免疫层析等技术也成功应用于转基因成分的检测中。同 PCR 检测技术相比，恒温扩增技术具有特异性强、等温高效、操作简单、耗时较短、产物易检测及设备要求低等优势, 在快速检测中具有良好的前景。基因芯片综合了 PCR 技术和分子杂交的优点，可用于一种转基因作物中多个基因的平行检测或对多种转基因作物进行同时检测，其快速简便、自动化、微型化、高通量、准确度高等优点，使其在转基因作物检测方面具有广阔的应用前景。数字 PCR 是一种基于单分子 PCR 的对DNA分子直接计数的绝对定量方法，不需要标准品作为参考，融合了定量 PCR的准确性及基因芯片的高通量，因此有望成为绝对定量新标准，也有潜力解决转基因检测通量和劳力成本的问题。目前, 国内外针对转基因成分的检测主要以DNA为检测对象的核酸扩增检测技术为主，但是却面临着两大挑战：1、Talen和CRISPR等基因组编辑技术在转基因研发中的应用；2、加工技术水平和加工精度的提高, 导致DNA的提取难度加大，提取质量下降。但是我们相信，正是在这些挑战的激励下，我们的检测技术会不断地发展，检测人员的水平也会不断地提高。行路难！行路难！多歧路，今安在？长风破浪会有时，直挂云帆济沧海。

本计划由英国Fapas组织，与cnas互认。Fapas是目前全球最权威的实验室能力验证计划，由英国政府食品和乡村事务部(Defra)的执行机构英国食品与环境研究院（fera）组织。经UKAS认可，由国际标准化组织向全球推荐（如ISO导则43），该计划从2007年开始与CNAS互认。与全球100多个国家的6000多家实验室保持密切的联系。现在中国已有超过300家实验室参加。Fapas计划由以下几个方面组成：1、Fapas 食品理化检测（含23个大项，近500测试轮，数千检测项目）2、Fepas 食品微生物检测（含4个大项，60多个测试轮，近百个测试项目）3、Gemma 食品转基因检测（含3个大项，近20个测试轮，涵盖了常见的转基因检测）4、Leap 饮用水理化检测（含12个大类，70多个测试轮，数百个测试项目）5、Leap 饮用水微生物检测（含8个测试类别，60多个测试轮）6、Leap 污水及土壤环境检测（含33个测试类别，80多个测试轮，近400个测试项目）

"20世纪70年代以来，随着生物技术的飞速发展，尤其是基因工程技术的成熟，转基因技术在农作物的改造中得到广泛运用，转基因农作物的面积越来越大。正是因为转基因品种具有他独特的优势，比如具有很强的抗病虫害能力、高产、减少劳动投入等，给种植的人带来了巨大的经济效益，也降低了成本和人的劳动。但由于转基因食品对于人体的影响，并未经受长期的检验或者有明确的论点证明，因此转基因食品遭到大多数国家及其民众的反对和质疑。将未经验证安全可靠的食品投入市场为民所食用，是极度不安全也是不负责任的做法。因此国家食品安全法指出必须对转基因食品进行标识。而且个人认为，改变传统生物进化的做法是有违进化论，以及人类生命特征发展的。基因是决定一个个体的基础，倘若基因变了，对于食用者真的就没有一丝改变么，而这发生的改变是好是坏如今依旧无法定论。因此对于转基因食品应该做出检测并贴出明确的标识。对转基因食品的检测方法，目前主要有对外源基因的检测和对外源蛋白质的检测二大类。1. 外源基因的检测现阶段对于外源基因的检测主要是对转入的外源基因进行PCR扩增，进而在做紫外检测或荧光检测。PCR技术全称“聚合酶链反应技术”，这是一种聚合反应，是在体外由引物介导的DNA聚合酶催化的，能在短时间内准确地大量复制序列。目前英格尔检测公司（ICAS）是用自己独立的实验室，通过这种方法在做转基因检测。2.蛋白质印迹法蛋白质印迹法将电泳的较高的分离能力、抗体的特异性和显色酶反应的灵敏性结合起来，是检测复杂混合物中特异蛋白质的最有力的工具之一，普遍用于分离、检测特异的目的蛋白质，灵敏度为1-5ng。它可确定一个样品中是否含有低于或超过预定限值水平的目的蛋白质，特别用于不可溶蛋白质的分析。

三甲基溴化锍检测方法?是用离子色谱法还是液相？