骨髓细胞分类计

名 称：骨髓细胞的提取目的：分离并培养骨髓间充质干细胞原理：先分离出单核细胞然后再通过培养分离出骨髓间充质干细胞内容：步骤一：小鼠骨髓细胞的获取1． 断颈处死小鼠（7-12周，雌雄均可），投入盛有250ml左右的0.1%新洁尔灭或75%酒精中浸泡3-5分钟，拎出后将小鼠仰面翻铺于超净台上一个消毒托盘上。2． 用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。将它们放入另外一个消毒托盘中，并换一套新的剪子和镊子。手术器械事先均必须消毒。3． 小心剥离肌肉，分别剪下Femurs and Tibias, 剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔。注意尽可能少的剪走骨髓腔。4． 拿两支5ml无菌注射器，每支吸取5ml IMDM(10%FBS, 50/50u/ml Pen/Strep)，换装一个4号针头（又称皮针）或1ml注射器的针头，并用无菌的针头套管将之轻轻拧弯。轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌15ml离心管，将细胞冲出。每根骨用2.5ml IMDM培养液左右即可基本冲下骨髓腔内的细胞。5． 300C下离心，1200转/10分钟，去上清，但留1ml，以便用于在振荡器上悬浮细胞。6． 加进氯化铵溶液（NH4Cl: 8.99g/L, KHCO3: 1g/L, Na4-EDTA: 0.037g/L ，过滤灭菌, 40C储存）裂解红细胞，按1: 9比例，即1ml 细胞悬液，加进9ml氯化铵溶液，混匀，冰上10分钟。 7． 300C离心，1200转/10分钟，去上清。步骤二：淋巴细胞分离液分离小鼠骨髓细胞1． 按步骤二方法采集小鼠骨髓细胞，并破红细胞2． 细胞用4ml培养液悬浮，缓慢留置于8ml淋巴细胞分离液液面上，2000rpm for 20min.3． 小心吸取云雾状底层的基质细胞约1.5ml的体积，置于1个盛有1ml无菌细胞培养用PBS的15ml离心管中，颠倒混匀，1200rpm for 10min, 去上清4． 如果是注射用细胞，则用5ml PBS洗涤细胞2次；5． 离心沉淀下来的细胞用50-200ul PBS，计数细胞，并计算所需细胞体积数铺板培养

大神们，帮忙推荐台主要针对小鼠骨髓细胞数检测的仪器，再一个就是能对小鼠血细胞的种类分类，计数。要求不高。。但是这种针对性的仪器还这难找。。

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骨髓间充质干细胞总结 2003年8月，为给大家提供一个网上交流干细胞研究经验的平台，我们干细胞版设立了骨髓间充质干细胞培养讨论区，经过近三个月的讨论学习，我们既学习丰富了自己的知识体系，也对间充质干细胞尤其是分离培养方面有了更为详实的认识，为了大家阅读的方便，我们决定把本版中的相关内容，同时参考部分书目和文献，做一总结。一、骨髓间充质干细胞的分离 目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。1. 直接培养法（全骨髓培养法） 1987年，Friedenstein等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞扩增20－30代后仍能保持其多向分化潜能，这类细胞即为骨髓间充质干细胞（BMSC），其工作对今后MSC的研究具有重要意义，不仅证实了骨髓MSC的存在，而且创建了一种体外分离和培养MSC的简便可行的方法，得到了广泛的应用。culture-spirit采用直接贴壁法，24-36小时首次换液，换液时用PBS洗两次，7-10天传第一代，以后2-3天传代。培养基采用Hyclone的DMEM/F-12（1：1），血清是天津TBD的FBS（顶级），得到了较好的培养结果。布兰卡根据自己培养大鼠MSC的经验，详细介绍了实验步骤：（1）接种后60-80分钟,换液去除悬浮细胞（2）原代培养24 h,48 h各换液一次（3）观察细胞情况，在原代培养7天左右时，如观察到成片的典型形态的细胞，在瓶底用Marker笔标记，0.25%胰酶消化，镜下观察控制，约5-10分钟（室温太低时应放置到孵箱中），加入全培养基终止消化，瓶体朝上，吸管轻轻吹打4-8分钟，尤其是标记部位。不要用力吹打，以免把贴壁较牢的成纤维细胞，上皮样细胞吹打下来。（4）传代到新瓶中，加入少量培养基，孵箱静置20-30分钟后，MSC大多牢固贴壁。瓶底朝上，轻轻吹打，丢弃悬浮以及贴壁不牢的细胞（大多是上皮样细胞），加入全培养基开始传代培养，如观察仍有较多杂细胞，可重复上述步骤。（5）经上述处理后，原代的那瓶细胞仍有一些MSC生长，可继续按原代培养，如观察到MSC的克隆，仍可按上述步骤纯化处理。（6）原代或传代的细胞如观察的少量成片的杂细胞，可直接镜下瓶底标记后，超净台里用长吸管尖端机械刮除，吸出去掉。菊花与刀用的是全骨髓培养法，直接用含10%的FBS培养基冲洗大鼠的股骨和胫骨，为了避免冲起许多气泡应缓慢冲，冲的次数不应太多。冲洗后不用离心直接接种在培养瓶里，48 h~72 h后首次换液，一般7~10天可传代。天之饺子介绍的小鼠MSC的分离方法：取6 w小鼠的股骨和胫骨，直接用含培养基冲出骨髓，一定要尽量把干垢端的骨髓冲干净。冲洗后不离心直接接种在培养瓶里，24－48 h后去悬浮，再接下来的每3－4天换液一次，直到需要传代。2. 密度梯度离心法 裴雪涛等用比重为1.073 g/ml的percoll分离（400 g×20 min）人骨髓MSCs，取界面处细胞层，离心后洗涤以2×105/cm2的密度接种，72 h后更换培养液，弃掉未贴壁细胞，以后每3 d换液一次。细胞长到80％汇合时1：1传代。菊花与刀利用PERCOLL密度1.073分离大鼠MSC 时，用2400 rpm×20 mins后可见中间有一层约1～2 mm厚的白色层，仔细用吸管吸取这一层再用PBS离心2遍即可加培养基和胎牛血清培养即rMSCs。周进明等利用密度为1.082的percoll分离小鼠MSCs，500g×30min离心后，取中间的单个核细胞层，PBS洗两次，接种于IMDM培养基，1 d后换液，去掉非贴壁细胞，以后每3-4天换液。jetter用过FICOLL,FERCOLL,上海二分厂的淋巴细胞分离液分离MSC细胞效果都不错，当然所获细胞群的纯度不一，Percoll最纯，而上海二分厂的淋巴细胞分离液所获细胞群的传代能力优秀（35 PASSAGE）。本版的部分园友认为MSC贴壁培养得到的细胞不均一，但是多能分化能力和增殖力好，percoll分离得到的细胞较为均一，多能分化性和增殖力不如贴壁培养的，尤其是增殖力相差很远，有人添加bFGF或/和表皮生长因子发现可以增强增殖能力。二、骨髓间充质干细胞的培养 天之饺子认为，间质干细胞的培养一定要用塑料培养瓶，不能用玻璃的。因为象间质干这类的基质细胞不易贴玻璃，而且现在买的进口好品牌的培养瓶都涂有一层促细胞贴壁的物质，多数园友培养时都添加10－15％胎牛血清。分离培养结果的差异可能是由于各个研究小组标本来源、采用的分离方法不同从而所获得的细胞不同，或者用来检测的细胞代数不同，或者培养过程中用的胎牛血清不同，导致MSCs获得或失去这些表面标记物的表达。三、骨髓间充质干细胞的特性 体外培养的MSC体积小，成梭形，核浆比大。不表达分化相关的细胞标志，如I、II、III型胶原、碱性磷酸酶或Osteopontin；也不表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124、CD166和多种表面蛋白，这群细胞特性稳定，扩增一代和两代后的细胞同质性分别达到95％和98％。MSC联系传代培养和冷冻保存后仍能具有多向分化潜能，而且保持正常的核型核端粒酶活性，但不易自发分化，在体外特定的诱导条件下，MSC可以分化为骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉、神经等多种细胞。四、其他相关内容 Jiang将从成人以及成年大鼠和小鼠骨髓分离的间充质干细胞（CD45－TER119－）命名为多潜能成年祖细胞，他们证明，MAPC高表达端粒酶，而且随着细胞的扩增，端粒的长度不变，单个MAPC来源的细胞群不仅能在体外向3个胚层的细胞分化，而且能在体内能够向各种组织细胞分化，相比较而言，形态与MSC相似的体外培养的皮肤成纤维细胞则不具有类似的分化潜能。参考文献 生理学报2003.55（2）：153－159 人骨髓间充质干细胞在成年大鼠脑内的迁移及分化中华放射医学与防护杂志.2002,22(3).-167-169 培养小鼠骨髓间充质干细胞及其移植后在体内的定位分布Exp Biol Med Vol. 226:507 520, 2001 Mesenchymal Stem CellsNATURE |VOL 418 | 4 JULY 2002 Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow干细胞生物学 裴雪涛 主编

近日，来自加利福尼亚大学的研究者发现了在人类骨髓干细胞和所有的免疫细胞之间存在一类“环节缺失”（missing link）的细胞。这或许为我们深入理解免疫系统以及免疫系统疾病发生的分子机制提供帮助。相关研究刊登在了9月2日的国际杂志Nature Immunology上。这项研究是在人类骨髓中进行的，因为其包含了产生人类自出生后所需血液的所有的干细胞。理解成人正常血液的形成是揭开白血病发病机制关键的一步。之前的研究中，研究者重点研究了骨髓中的血液干细胞，这种干细胞生存时间比较久，可以再生，而且可以产生所有的血液细胞。在这过程中，干细胞可以分裂产生其发育的中间状态体，称为前体干细胞，前体干细胞可以产生血液的不同谱系，比如产生红细胞或者血小板等。和干细胞一样，祖细胞也非常稀少，因此研究就好比海里捞针一样，研究者Lisa这样说，此前的研究工作中，他们发现了一种具有部分分化能力、相当成熟的淋巴祖细胞。在这项最新的研究中，研究者描述了一种更为原始的可以分化为整个免疫系统所需细胞的祖细胞。

【序号】：2【作者】：黄可欣1于军2石搏【题名】：大鼠骨髓间充质干细胞培养方法改良与鉴定【期刊】：中国老年学杂志. 【年、卷、期、起止页码】：2019,39(14)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7iLik5jEcCI09uHa3oBxtWoNXIvaiQB80L3Jul38AtFf3UeTB_BlOzKJibUJyew7WW&uniplatform=NZKPT

【序号】：1【作者】：杨涛【题名】：不同层软骨细胞与骨髓间充质干细胞在体内外三维共培养时细胞外基质特点的实验研究【期刊】：大连医科大学【年、卷、期、起止页码】：2017【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C447WN1SO36whLpCgh0R0Z-ifBI1L3ks338rpyhinzvy7Kt4RMGSMaxxH2WkQVeTlx_sUqdJWIk0PB_cP8FsBxdg&uniplatform=NZKPT

【序号】：3【作者】：周年1,2,3刘波1,4徐彭【题名】：大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和分化能力鉴定【期刊】：江西中医药. 【年、卷、期、起止页码】：2018,49(05)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7i0-kJR0HYBJ80QN9L51zrP3ylMAV4CgQ9wpp7ZMmE5O8NBqbZq4aly75LaltU8u1l&uniplatform=NZKPT

【序号】：4【作者】：李倩晓1那荣妹2刘百亭【题名】：SD大鼠骨髓间充质干细胞原代培养条件的选择【期刊】：中国老年学杂志. 【年、卷、期、起止页码】：2017,37(05)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7iAEhECQAQ9aTiC5BjCgn0RqLtq4qv82HhSJrd4mMlLD1sEVOCJ2Utcht-M6YZ-Ko0&uniplatform=NZKPT

【序号】：1【作者】：柏秀娟李一凡时霄冰【题名】：SD大鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及鉴定【期刊】：中国煤炭工业医学杂志. 【年、卷、期、起止页码】：2022,25(02)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7iJTKGjg9uTdeTsOI_ra5_XQ1nc-PzVE0xyf-gP3YJd2uBAacMkWEJ5FZ3Wo5eFSGS&uniplatform=NZKPT

【序号】：1【作者】：刘璐璐【题名】：三维培养条件下骨髓间充质干细胞的形态学观察【期刊】：山西医科大学【年、卷、期、起止页码】：2022【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C475KOm_zrgu4lQARvep2SAkueNJRSNVX-zc5TVHKmDNkhj_JpBBTDZS90To-XUT-zkJYyY14qZp-BPIDn6w4bDJ&uniplatform=NZKPT

【序号】：5【作者】：王博荣1鲁曦1张敏龙【题名】：一种改良大鼠骨髓间充质干细胞培养方法【期刊】：中华肺部疾病杂志(电子版). 【年、卷、期、起止页码】：2017,10(01)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7iAEhECQAQ9aTiC5BjCgn0RrntXS8bbQWa2nxXxa6LsSXxNfFO7FPG8wvrj5FsSgFx&uniplatform=NZKPT

随着医学知识的普及，“骨髓移植”早已不是什么新鲜词了，很多人都知道，如果人的骨髓出现问题，失去造血功能，就可能不得不接受骨髓移植手术。但是成功接受骨髓移植后，患者的身体方面会发生什么变化，一般人恐怕都不了解。 　　像还是不像？　　前些时候，有人提出：进行骨髓移植后，两个非亲非故的陌生人的相貌越长越像。还有一种比较流行的说法认为患者的性格会发生变化。　　这些问题，大都源于一些媒体的报道。　　说相貌越来越像的报道举了实例。第一个例子是１９９６年中华（上海）骨髓库第一个配型成 功，并捐献造血干细胞的志愿者孙伟，据报道，当年２６岁的他与１１岁的小患者术后一直保持联系，通信、寄照片。上海红十字会的工作人员表示：“所有见过照片的人，都觉得像极了。”而另一位捐髓者周海燕也是同样的情况。文章还提到，越长越像的是两位移植时间比较长的患者，因为孙伟和周海燕的捐髓手术分别是全国的第一例和第三例。　　还有报道说：“一名皮肤白皙的女士成功地将骨髓捐给一名皮肤黝黑的女大学生，奇怪的是这名大学生的皮肤奇迹般地日渐白皙；脾气暴躁的一名患者在接受了骨髓移植后，渐渐地脾气如同骨髓捐献者一般温和了。在中国仅有的十几例骨髓成功移植案例中，这种奇迹不能仅仅用巧合来解释。”　　这种说法有科学性吗？有的读者看到报道后告诉记者，生活中两个非亲缘关系的人越长越像是有可能的，“夫妻脸”就是一个例子，甚至还有说法认为孩子会长得像保姆或是奶妈，而血液，似乎比共同生活、奶水哺育等因素更“可靠”。　　骨髓移植，移植的是造血干细胞，干细胞在揭示生命奥秘方面的巨大潜力叫人对这些问题产生疑惑。　　骨髓移植到底改变了什么？　　中国医学科学院血液学研究所造血干细胞移植中心主任韩明哲博士接受了本报记者的采访，他从事血液病临床和基础研究工作已经近２０年。　　谈到骨髓移植，韩明哲博士更倾向使用的词是“造血干细胞移植”。他说，造血干细胞移植是经大剂量放化疗或其他免疫抑制预处理，清除受体体内的肿瘤细胞、异常克隆细胞，阻断发病机制，然后把自体或异体造血干细胞移植给受体，使受体重建正常造血和免疫，从而达到治疗目的的一种治疗手段。　　据介绍，造血干细胞移植目前广泛应用于恶性血液病、非恶性难治性血液病、遗传性疾病和某些实体瘤治疗，并获得了较好的疗效。１９９０年后这种治疗手段迅速发展，全世界１９９７年移植例数达到４．７万例以上，自１９９５年开始，自体造血干细胞移植例数超过异基因造血干细胞移植，占总数的６０％以上。同时移植种类逐渐增多，提高了临床疗效。　　造血干细胞移植后，患者身体的确会发生一些变化。韩明哲博士告诉记者，根据现有的已经被普遍接受的研究资料，接受骨髓移植者，最常见的改变是血型，移植后患者的红细胞血型变为供者红细胞血型。比如供者是Ａ型，移植后不论移植前患者血型为何型，均变为Ａ型。内分泌系统也会改变：由于移植前预处理为大剂量照射和化疗，这种治疗对身体器官有很大的损伤。移植后很多器官组织短期内得到恢复，但是性激素分泌变化显著。男性患者出现精子数量减少，但其性功能（性生活）不受影响。女性患者常常出现闭经。另外，由于移植后的免疫反应，部分患者会出现口腔溃疡、皮肤色素沉着。　　典型的伪科学思维？　　对于骨髓移植“移植”走了相貌、性格，某科技网站发表评论说：“这是典型的伪科学思维。即使所说的事例不是编造的，要在两个人之间找到某种无法定量测定的相似性有什么难的？为什么这一对是相貌相似，那一对是肤色相似，另一对又是性格相似？骨髓的影响会因人而异不成？怎么知道这种相似性就是骨髓引起的？如果统计表明大部分骨髓移植的结果是肤色都变相似了，还可以怀疑是否不是巧合。像这样因人而异的不同方面的相似性，连巧合都算不上。”　　也有专家认为，报道中所谓的“像”与“不像”是缺乏科学定义的，因为相貌受遗传背景控制，涉及到皮肤、骨骼、毛发等上百种细胞类型及其空间结构，是个相当复杂的多基因性状。而骨髓移植，主要为了将造血干细胞输给患者，以重建造血功能，这些都只能在血液中表达，怎么可能改变相貌呢？　　韩明哲博士告诉记者，近几年，研究结果表明造血干细胞具有可塑性，可以转变为血管、肝脏、脂肪、神经、肌肉等组织细胞。因此很多研究单位、医院研究用造血干细胞治疗冠心病、神经损伤、血管闭塞性疾病。但是他认为，因为成人患者骨骼生长已经停止，所以移植患者长相不会有大的改变。另外，同胞之间本身有一定的相似。他很肯定地说，据他所知，国内的研究和治疗中还没有出现这种情况，国外的科学文献也没有报道过这样的先例。　　韩明哲博士认为，接受捐赠者在性格方面的确可能会有改变，但是他强调这并非是造血干细胞移植的结果，而主要是因为患者通过一系列治疗后，对人生有另一种认识。并且移植后一段时间免疫力低下，在饮食、社交活动中需要注意避免感染，故很多患者会变得小心谨慎。　　至于其他方面，如异性之间的骨髓移植是否会改变患者的性别，韩明哲博士很明确表示绝对不会。他说，骨髓移植只是替换造血系统，尽管有的器官当中存在少量的供者细胞，但其他器官没有很大的改变，尤其是性器官。人的一生很多关键的生长发育是在胎儿期间完成的，一个器官的形成需要非常复杂的发育过程。因此，单纯通过骨髓移植改变人的性别是不可能的。　　不过也不是所有的专家都对此持怀疑态度，上海市血液中心专门从事白血病研究的仇志根博士在接受媒体采访时表示，也许有“越来越像”的可能，他说：传统观念认为，不同组织种类的干细胞是“世袭终身制”，不可逆转，然而在１９９９年，美国科学家首先证明人体干细胞具有“横向分化”的功能，比如造血干细胞可能转化为肌肉细胞、神经细胞、成骨细胞等等，反之亦然。这一里程碑式的发现立即轰动世界，两年后，《科学》杂志评出“２１世纪最重要的科学领域”，干细胞列十项之首。美国科学家曾将黑鼠的骨髓移植给白鼠，白鼠长出了黑毛发；英国科学家将骨髓植入心脏病人的心脏，结果骨髓干细胞分化构建成小的毛细血管，改善了心脏功能。在他看来，相貌的“移植”恐怕不仅仅是猜测或者空想。　　讨论还将继续。也有专家表示，关于国内的骨髓移植，可能这些话题都还不应该是“主角”，尽快解决国内骨髓库捐献者资料稀缺的问题才是目前最迫切的事情。

【序号】：2【作者】：李振江1徐晨阳1丁炳谦【题名】：羧甲基壳聚糖温敏凝胶诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化【期刊】：中国组织工程研究. 【年、卷、期、起止页码】：2017,21(18)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7iAEhECQAQ9aTiC5BjCgn0Rg-Tv-L7sw-Jm0dHsN_sl7lEo4tBe2CTlHaZE6W7FGns&uniplatform=NZKPT

【序号】：1【作者】：张宁李小佩肖倩茹【题名】：梯度交联水凝胶用于骨髓间充质干细胞的三维培养与分化【期刊】：东南大学学报(医学版). 【年、卷、期、起止页码】：2018,37(04)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7i0-kJR0HYBJ80QN9L51zrPykMtHqC9zZyLumdUzSnd49uxratj2CePE0w9L8JUMwY&uniplatform=NZKPT

【序号】：3【作者】：张宁李小佩肖倩茹【题名】：梯度交联水凝胶用于骨髓间充质干细胞的三维培养与分化【期刊】：东南大学学报(医学版). 【年、卷、期、起止页码】：2018,37(04)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7i0-kJR0HYBJ80QN9L51zrPykMtHqC9zZyLumdUzSnd4-Vv49Lrf5qmxCA42hyYsyg&uniplatform=NZKPT

【序号】：2【作者】：朱晓宇【题名】：人骨髓间充质干细胞成脂分化的体外优化培养体系研究【期刊】：上海交通大学【年、卷、期、起止页码】：2016【全文链接】：https://kns.cnki.net/kns8/DefaultResult/Index?dbcode=SCDB&crossDbcodes=CJFQ%2CCDMD%2CCIPD%2CCCND%2CCISD%2CSNAD%2CBDZK%2CCCJD%2CCCVD%2CCJFN&korder=SU&kw=%E4%B8%89%E7%BB%B4%E5%9F%B9%E5%85%BB%20%E7%BB%86%E8%83%9E%20%E5%87%9D%E8%83%B6

【序号】：2【作者】：李军张鹏卢雪玲【题名】：壳聚糖负载原代培养自体骨髓间充质干细胞修复全层关节软骨缺损实验研究【期刊】：潍坊医学院学报. 【年、卷、期、起止页码】：2019,41(05)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7iLik5jEcCI09uHa3oBxtWoFvEHGTUVWmEdg45V5dosGvy6fb7mrvKACrbEH0OKOFk&uniplatform=NZKPT

【序号】：1【作者】：范谊【题名】：搭载骨髓间充质干细胞的可注射水凝胶促进临界性骨缺损修复的研究【期刊】：吉林大学【年、卷、期、起止页码】：2023【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=GARc9QQj0GUGt7oTxWCcNiNLWNEqhogDOrAClcQUs6s-PgpOuE8G_usmhF5mRGRgawugNtgN0jeGmVA7mchcs4Eleqh2D0Ky2LWUuGSo1MnHIOWgme-guhT4HAbd1jBHbOgmHme8nJ37V0Z8aHvDqg==&uniplatform=NZKPT&language=CHS

【序号】：5【作者】：张洋【题名】：仿生杂化水凝胶的制备及用于骨髓间充质干细胞体外3D培养的研究【期刊】：北京协和医学院【年、卷、期、起止页码】：2018【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C475KOm_zrgu4lQARvep2SAk-6BvX81hrs37AaEFpExs0Jr05fYy6UvubZSZnKcMjNnWslIQkwvtg3XpY8vwW0K9&uniplatform=NZKPT

【序号】：3【作者】：平措卓嘎1,2王剑利1徐燕【题名】：自体造血干细胞移植治疗多发性骨髓瘤的疗效评价及影响因素：单中心真实世界研究【期刊】：西安交通大学学报(医学版). 【年、卷、期、起止页码】：2023,44(03)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7ioT0BO4yQ4m_mOgeS2ml3UD1jEw1SpgmMwojC3DSx7U3rDsqM34rgpF1W6HZ22weu&uniplatform=NZKPT

超声波细胞破碎仪是利用超声波在液体中的分散效应,使液体产生空化的作用,从而使液体中的固体颗粒或细胞组织破碎。常规使用方法是把要破碎的材料放到烧杯中，开电源设定时间（震动时间和间歇时间），将破碎仪的探头放到材料中。使用过程中，超声波发生器电路将50/60Hz的市电转换成18-21KHz的高频高压电能，因此破碎过程中会大量产热，一般在冰浴下破碎。超声波细胞破碎仪的两大组成部件为超声波发生器和换能器（有的配置有隔音箱）。1、超声波发生器：工作原理：由信号发生器来产生一个特定频率的信号，这个特定频率就是换能器的频率，一般应用在超声波设备中的超声波频率为20KHz、25KHz、28KHz、33KHz、40KHz、60KHz。2、换能器组件：换能器组件主要由换能器和变幅杆组成。3、隔音箱：可以有效地的降低工作过程中的所发出的噪音，保持实验室安静。超声波细胞破碎仪在我国的行业推广已进入成熟阶段，而应用仍不够普及!该仪器(设备)应用范围非常广泛，这是其它仪器设备所不能比拟的。也正因如此，该仪器(设备)的市场潜力很大，所以生产厂家也日趋增多，这也同时造成了超声清洗行业及市场的相对混乱，可以用八个字来形容“鱼龙混杂，良莠不齐”!超声波细胞破碎仪分类如下：一、按探头（“tip”）直径分类处理不用体积的样品需要选择不同“tip”头的超声波破碎仪。由于各制造厂家的产品结构不同，其“tip”头直径不尽相同。一般“tip”头从微量5mm(适合1ml处理量)到25mm(适合1000ml处理量)，有连续流探头，处理量可达80升/小时。可能会发生磨损的高能应用中会用到可更换“tip”头。当能量通过“tip”头被传递时，金属表面留下痕迹的地方会发生腐蚀。随着时间的推移，发生腐蚀的地方会产生轻微的蚀损斑。“tip”头可以用砂纸或纱布来打磨，除非是损坏到一定的程度；当这种情况发生时，“tip”头将很难进行调谐频率，取而代之的可能是发出长而尖的噪音，最终产生裂纹。 要有效地加工给定剂量的样品，有两个主要的因素需要考虑：“tip”头尺寸和输出功率。这两个因素必须同时匹配才能获得最佳效果。小功率大“tip”头，则“tip”头无法工作；而太大的功率则“tip”头可能损坏。购买时请注意所需型号附件。二、按功率分类超声波细胞破碎仪的功率大小是客户的首选指标，它决定着被破碎物的数量、大小、质量及效果。所以各生产厂家对此指标也都非常重视。一般情况下，实验室、化验室、研究所、药品检验所等科研单位，使用的功率都不大，（一般在500W以下）；而生物公司、制药厂、化工企业等生产单位，所用的功率大都在500W-2000W左右。由于各制造厂家的产品结构不同，其功率的标注方法也不尽相同。不过按照用户常用的惯例，一般有以下几种：50W、100W、150W、250W、300W、350W、500W、1000W、2000W。一般超声波细胞破碎仪输出功率可根据需要适度调节。 标准超声波细胞粉碎机产品的额定工作频率是20千赫兹。一些超声波细胞粉碎机有自动调谐功能可以使频率在一个小的范围内变化。

原文是Purton, L.E., and Scadden, D.T. (2007). Limiting Factors in Murine Hematopoietic Stem Cell Assays. Cell Stem Cell 1, 263-270.发表在2007年cell stem cell 杂志上，最近由于要进行相应的课题研究，拿来精读了一番，做了一个笔记，发上来和大家分享，由于初涉小鼠造血干细胞这个领域，肯定有很多地方理解不全和错误，请大家指正。下面是我的精读笔记：小鼠造血干细胞研究方法综述一．关于HSC 免疫表型1. Thy1.1lo,Lin-Sca-1+Cells:其缺点是Thy1.1只表达于C57BL/Ka-Thy1.1小鼠，不表达于常用的C57BL/6小鼠；2. Lin- c-Kit+ Sca-1+ Cells（LSK）：异质性，含有祖细胞，HSC含量不超过10%；结合CD34和Flt3可以分为long-term repopulating HSCs (LKS+ CD34- Flt3-) ，short-term repopulating HSCs (LKS+ CD34+ Flt3-) ，以及multipotent progenitors(LKS+ CD34+ Flt3+)；3.荧光染料标记HSC: Rhodamine 123, Hoescht 33342, 以及Side Population，Rhodamine 123为线粒体染料，Hoescht 33342为DNA染料，HSC能够更多地将这两种染料泵出细胞外，所以染色较浅；4. SLAM Family Members：SLAM antigens (CD150+ CD244-CD48- cells)，其优点是不像Thy1.1和Sca-1其表达受到品系和发育阶段等的影响，在更多的种系的小鼠中适用二．克隆形成实验：主要反映的是祖细胞的造血能力，不反映HSC，检测T系和B系需要另外特定的培养条件；三．Cobblestone Area-Forming Cells/Long-Term Culture-Initiating Cells，鹅卵石样区域形成细胞实验/长期培养-启动细胞实验：体外检测更早期造血干/祖细胞的方法，但由于feeder layers和培养条件不同，实验结果在不同实验室间稳定性较差，对于其是否真正能检测造血干细胞也比较有争议，不过在一些情况下，比如归巢（homing）或植入（engraftment）有缺陷导致体内造血重建实验无法进行时，这两个方法是较好的替代方法；四．Colony-forming unit-spleen (CFU-S)脾集落单位形成实验：属于短期（1-3周）体内重建实验，检测的干祖细胞比体外CFC早，但比HSC晚；五．long-term repopulating assays，长期重建实验，包括：1. competitive repopulation assay：竞争重建实验：属于定性或者半定量研究HSC重建能力的方法，不能区别是HSC的数量还是质量造成的结果差异，得到的结果为RU即重建单位；2. limiting dilution assay：统计的指标是造血重建失败的小鼠数目，采用泊松分布来计算HSC的频率，得到的结果为CRU即竞争重建单位；Stem Cell公司的免费软件L-Calc,可用于分析实验结果。limiting dilution assay有两种方法：1CRU assay，采用最小数的HSC作为竞争细胞，可以在单细胞水平检测HSC；2也称为CRU assay，采用标准的，足量的HSC作为竞争细胞，不能在单细胞水平检测HSC；3serial transplant assay，多代移植，最为严格的检测造血干细胞的方法；六：Limiting Dilution Assays需要考虑的几个重要因素：1.竞争细胞：1compromised bone marrow，即连续两代重建成功的骨髓细胞，比较耗时2W41/W41受体小鼠：c-kit基因发生突变，具有更加敏感的宿主微环境，能够检测更少的植入的HSC，不需要另外的HSC作为支持细胞（竞争细胞）；3全骨髓细胞（whole bone marrow cells）：经验表明2 X105 competing bone marrow cells比较适合2.受测细胞（Test Cells, Unknown HSC Potential）：有人用LKS+ CD34- cells，但作者认为全骨髓细胞最好，原因是这种方法是在功能上评价HSC，避免了HSC在基因修饰的小鼠中免疫表型发生变化导致的结果的不可靠，在作者实验室通常采用的受测全骨髓细胞数为8 X 103到2 X106；3.重建失败的标准：现在一般认为受测细胞的重建比例小于1%为重建失败；在重建比例中，红细胞是不计算在内的，因为其不表达CD45,但一般认为只要其他系重建成功，红系应该也会重建成功；4.分析重建的时间点：看长期造血重建，最少要16周，最佳是六个月；5.其他考虑因素：归巢，HSC各系分化阻滞或减弱，祖细胞增殖动力学特性的改变，造血微环境对HSC的影响等等七．区分供体，受体的遗传学标志：最常用的是CD45.1,CD45.2系统，还有可以通过性别（Y染色体）来区分。

麻烦各位英文好的大侠搜索一下国外关于骨髓干细胞移植的评价。我有个朋友初步配对成功，现在想知道如果捐献骨髓干细胞，有没有什么副作用。在国内的媒体上好像没有副作用、后遗症的报道，但对国内的媒体有点怀疑。不知道国外有没有权威报道。谢谢各位大侠了。毕竟是救人性命的大事

世界首个艾滋病治愈者出现 移植骨髓后获抗体 核心提示：全球艾滋病患者将看到曙光，世界上第一位艾滋病治愈者出现，康复者叫莫西·雷·布朗，身患两大绝症——艾滋病和白血病，治愈的方法是骨髓移植。 对于医生胡特而言，病人蒂莫西·雷·布朗就像漆黑抗艾研究道路上的一道亮光。这名被冠以“柏林病人”的特殊病患同时兼有白血病和艾滋病。在医学界看来，布朗已经是即将踏入坟墓的人，然而在接受骨髓移植后，布朗竟然奇迹般得以重生。这一事件震惊了整个医学界，医生们从他的身上看到了医学界的奇迹：终结艾滋。　　从1981年6月5日人类发现HIV病毒到现在，已经过去了整整30年。就在HIV30岁之际，世界医疗科技领域已吹响消灭号角，将全力把这种可怕的病毒从世界上消除。这种动力的来源，一是科学的进步；二是金钱压力的迫使。据悉，仅在全球发展中国家，每年用于艾滋病治疗的费用就已高达13亿美元。如果继续下去，到2031年这一数字将会变为现在的三倍。诺贝尔奖得主朗索瓦丝·巴尔·西诺西表示：“艾滋病患者长期用药会带来大量的花费，我们必须要找到治愈他们的方法，我们会不断地努力，直至找到。”　　无心插柳　　———发现骨髓移植法是巧合　　蒂莫西·雷·布朗是一名美国白血病患者，并同时患有艾滋病。2007年他来到柏林找到了胡特医生。胡特医生是一名肿瘤病和血液病专家，现工作于德国西南部的海德堡大学。胡特说：“当时布朗的状态非常不好，病情正在恶化，几乎已经到了死亡的边缘。”随即，胡特做出一个决定：进行骨髓移植，先治白血病。结果却出人意料，经过3年来的临床观察，这次移植同时治愈了布朗的艾滋病。原来，骨髓捐献者的配型不仅非常吻合，而且骨髓中还有一种能天然抵御艾滋病病毒的变异基因。据以往研究发现，这种变异基因只在少数北欧人体内存在。　　“真的不敢相信，我们治愈艾滋病的新方法竟然是这样开始的。”6月2日胡特对路透社记者说，“因为布朗患有艾滋病，本以为做完骨髓移植手术他依然会离开这个世界。真的没有想到，他竟然奇迹般地活了下来，还成为世界第一个被治愈的艾滋病病人。现在，他体内已经没有艾滋病病毒了，已经不再吃药。”　　对于这种骨髓移植方法，大多数科学家则表示，不可能用于其他艾滋病患者。骨髓移植方法费用高昂、复杂、充满风险，而且在这个方法中，需要找到特殊的捐献者———体内具有抵御艾滋病病毒基因的人。据目前研究所知，北欧人的后裔具有这一特征。因此，要找到准确的骨髓捐献者很难，这一部分捐献者只占所有捐献者的一小部分。　　去年，马里兰大学的博士罗伯特·加洛直率地表达了他的反对意见：“这个方法不具有实践性，会害死很多人。”　　面对这项新成果，诺贝尔奖得主西诺西则表示：“虽然这种方法花费巨大、风险也很大，但是从科研人员的角度来看，我不得不说这是一项进步，起码它告诉我们艾滋病是可以治愈的。”　　美国国家卫生局日前提出一项资助艾滋病治愈方法研究计划，这项计划共分为四个阶段，在第一阶段将投入8.5亿美元。研究动力　　———迫于全球抗艾资金压力　　1981年6月5日，美国亚特兰大疾病控制中心在《发病率与死亡率周刊》上介绍了5例艾滋病病人的病史，这是世界上第一次有关艾滋病的正式记载。“5个年轻的艾滋病病人，全部都是同性恋者。”在资料中这样记载着。据联合国所提供的数据显示，全球每天仍有7100多人感染艾滋病。　　在不发达国家，一个艾滋病患者每年花费在医药费上的开销大约为150美元；在发达国家，例如美国，一个患者大约则要花费20000美元。无论是发达国家还是不发达国家，当这些开销加在一起，这个数字无疑是巨大的。　　据一项由非政府组织发起的名为AIDS2031的活动显示，到2031年不发达国家每年需要花费35亿美元在防艾和抗艾行动上，而这一数字目前为每年13亿美元。对于发达国家而言，20年后，每年将要花费50亿到60亿美元。　　“很清楚，我们现在需要找到一个可行性的方法去治愈艾滋病，而不是仅仅应对艾滋病患者的发热症状。”澳大利亚墨尔本的莫纳什大学艾滋病问题专家莎伦·卢恩说。　　取得成就　　———基因疗法和抗艾新药等　　治疗艾滋病的终极目标是让病人停止用药，这将减少每年大约12亿美元的抗艾药物需求。这一消息或许对于制药商例如辉瑞、葛兰素史克、默克等公司不是一个好消息。虽然要得到能够普遍推广的治疗艾滋病方法还需要很长时间，但是布朗的新发现，为艾滋病科研打开了一扇新的大门。“布朗的发现告诉我们，我们可以让一个人的细胞变得能够抵御HIV病毒，然后再经过一段时间的治疗最终攻克病魔。”卢因说。　　目前一些科学家正在模拟“柏林病人”案例的做法，并且已经取得初步的进展。关于研究原理，简单地说主要是采用基因治疗法从病人体内取出一些细胞，然后在实验室中将其培养成具有抗HIV病毒的细胞，最后再放回病人体内，并期望这些具有抗病毒能力的细胞能够在病人体内成活进而不断繁殖。　　今年早些时候在柏林举行的HIV研讨会上，美国科学家提供了一系列的研究资料：从6个艾滋病病人的体内取出血细胞，然后去除其中的CCR5基因，再放回病人体内。这个工作就像是用剪刀剪掉细胞DNA中有问题的部分，然后再将它缝合，放回病人体内。这个母细胞就可以通过在人体内不断地繁殖产生新的健康细胞，从而抵御艾滋。　　在研讨会上，科学家们还提出了唤醒体内HIV细胞并杀死的方法。在上个世纪九十年代末期，人们发现HIV病毒可以把自己隐藏在免疫系统内的T细胞中，然后“沉睡”下去。如果HIV病毒躲避起来的话，就会使药物无法消灭它们。这也是为什么现在的抗艾药物无法治愈艾滋病的一个原因。　　“如果当它在一个细胞中‘睡去’，它将会永远地待在那里，那就是为什么我们现在的药物无法把它们彻底消灭的原因。”卢恩说。卢恩和她的科研团队已经研制出一种新的药物名为SAHA，据信这种药可唤醒那些沉睡的HIV细胞。接下来卢恩和她的团队将对SAHA做进一步的临床研究。（据羊城晚报）

德国研究人员在新一期美国《血液》月刊上发表报告称，他们通过骨髓移植疗法“治愈”了一名艾滋病患者。但这一疗法能否推广引发争议。德国柏林沙里泰医院的研究人员介绍说，2007年，一名40多岁的美国男性艾滋病病毒携带者因患白血病在柏林接受骨髓移植治疗，当时捐献者的骨髓配型不仅非常吻合，而且还有一种能天然抵御艾滋病病毒的变异基因。以往研究发现，在很少一部分欧洲人体内存在这种变异基因。3年后，这名美国病人已不再有白血病和艾滋病病毒感染的迹象。研究人员在报告中说：“他们的结果非常明确地显示这名患者的艾滋病得到治愈。”但是，美国艾滋病病毒医学协会前会长迈克尔·扎格认为，如果将这种方法变成标准疗法，存在着较大风险。他说，目前，干细胞或骨髓移植常用于癌症治疗，但对健康人来说其风险尚属未知，因为它涉及利用强力药物和放射物摧毁人体原有的免疫系统，然后输入捐献者的骨髓，以重造一个新的免疫系统，这种疗法及其引发的并发症会提高死亡率。美国国家过敏和传染病研究所主任安东尼·福西也认为，目前这种治疗艾滋病的方法还不能应用，因为费用和风险都太高。不过，它为研究人员利用基因疗法或其他方法治疗艾滋病提供了更多线索。

一、细胞因子的概念细胞因子(cytokine)是由机体多种细胞分泌的小分子蛋白质，通过结合细胞表面的相应受体发挥以调节免疫应答为主的生物学作用。细胞因子具有 非常广泛的生物学活性，包括促进靶细胞的增殖和分化，增强抗感染和细胞杀伤效应，促进或抑制其它细胞因子和膜表面分子的表达，促进炎症过程，影响细胞代谢 等。二、细胞因子的命名细胞因子按其来源可分为：由单个核吞噬细胞产生的细胞因子称为单核因子(monokine)；由淋巴细胞产生的细胞因子称为淋巴因子 (lymphokine)等。按其作用可分为干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、生长因子和趋化因子等。部分由不同细胞分泌的细胞因子，其基因及编码蛋 白与结构清楚者，在免疫调节、造血和炎症中发挥重要作用，又称为白细胞介素(interleukin，IL)。也可以依据结构或者其受体结构分类，我们的 趋化因子目前没有受体产品。三、细胞因子的特征1、低分子量；一般为＜60kD的多肽或糖蛋白。多以单体形式存在，少数为二聚体，三聚体。2、天然细胞因子由抗原、丝裂原或其他刺激物活化的细胞所分泌，通过旁分泌(paracrine)、自分泌(autocrine)或内分泌(endocrine)方式在局部发挥短暂作用。3、一种细胞因子可由多种细胞产生，同一种细胞可产生多种细胞因子。4、需通过与靶细胞表面相应受体结合后发挥其生物学效应。5、具有高效性、多效性、叠性、拮抗性、协同性和网络性。四、细胞因子的分类1、白细胞介素(interleukin，IL-s)最初是指由白细胞产生又在白细胞间发挥作用的细胞因子。2、干扰素（interferon,IFN)最早发现的细胞因子，有干扰病毒感染和复制的能力。分α、β和g三种类型。3、肿瘤坏死因子超家族(tumor necrosis factor，TNF)1975年发现的一种能使肿瘤发生出血坏死的物质。4、集落刺激因子(colony-stimulating factor，CSF)指能够刺激多能造血干细胞和不同造血祖细胞增殖分化，在半固体培养基中形成相应细胞集落的细胞因子。包括G-CSF（粒细胞）、M-CSF（巨噬细胞）、 GM-CSF（粒细胞、巨噬细胞）、Multi-CSF（多重）（IL-3）、红细胞生成素(EPO)、干细胞生长因子(SCF)、血小板生成素 (TPO)等。5、趋化因子(chemokine)主要功能是招募血液中的单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等进入特定的淋巴器官和组织以及感染发生的部位。根据趋化因子近N端半胱氨酸(Cys)的位置、排列方式和数量，可分为CC、CXC、C、CX3C四个亚家族。6生长因子(growth factor，GF)生长因子(GF)是具有刺激细胞生长作用的细胞因子。五、细胞因子的生物学活性1.介导自然免疫、参与抗肿瘤和抗感染2.调节T、B细胞活化、生长和分化，介导细胞免疫和体液免疫3.刺激造血生成、刺激骨髓祖细胞生长和分化为各种成熟血细胞4.在炎症、感染和内毒素血症中的作用5.在超敏反应和自身免疫病中的作用6.细胞因子通过激活其相应受体（CKR），导致细胞的增殖与分化或分泌某种蛋白质。六、四种蛋白表达体系比较表达细胞优点缺点原核E. coli繁殖快、成本低、产量高遗传背景及基因表达调控机制清楚易于大规模培养，成本低廉蛋白常为包涵体，纯化困难无糖基化（分泌蛋白，细胞膜上蛋白不可用），生物活性不定无翻译后修饰，内毒素含量高酵母Pichia使用简单，表达量高，His-tag便于纯化，一定的翻译后加工可进行糖基化修饰，操作简单，适合大规模生产可诱导表达，也可分泌表达，产物便于纯化有时会出现蛋白切割问题糖基化不能满足要求昆虫High-5产量高 ，翻译后加工与哺乳动物相似对于部分有毒性或较难表达蛋白有优势无内毒素污染蛋白活性不如哺乳动物适合表达激酶等定位于细胞内的真核蛋白哺乳CHO HEK293完善的翻译后加工，活性接近天然蛋白周期长、技术要求高表达产量低

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