糖谱分析

生物质谱在糖蛋白结构分析中的应用项目完成人：桑志红 蔡 耘项目完成单位：国家生物医学分析中心 随着人们对糖蛋白参与生命活动机理的日益深入了解，对天然糖蛋白及重组糖蛋白类药物的分析越来越受到重视。重组糖蛋白类药物的质量控制更是直接关系到药物的疗效及至人类的健康。九十年代以来，随着带有反射功能的基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和纳升电喷雾串联质谱（nano-ESI-Q-TOF）等具有软电离方式的现代质谱 技术的发展，质谱以其高灵敏度和强有力的分析混合物的能力，提供了生物大分子的分子量、序列、一级结构信息以及结构转换、修饰等方面的信息，使糖基化分析有了重要的进展。 通常研究糖蛋白的方法是把蛋白链上的寡糖切下来，分别研究蛋白部分和寡糖部分的结构，因此无法研究与两部分共同相关的结构问题，也不能区分不同糖基化位点上切下来的寡糖。自90年代初，国外有人开始用质谱法研究糖蛋白的结构，同时描述了各个位点的不均一性。我们用建立的现代生物质谱技术研究糖蛋白一级结构的方法，将其应用与基因重组糖蛋白的结构分析。为糖蛋白结构分析及基因重组糖蛋白类药物的质量控制提供新的手段。一、 生物质谱研究糖蛋白结构方法的建立实验所用仪器为：1.德国BRUKER 公司的REFLEXIII型基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱仪，N2激光器，波长337nm，线性飞行距离150cm，加速电压2kv。2.英国Micromass 公司Q-TOF型电喷雾串联质谱仪。源温80°C，气体流速40L/h，枪头电压650V，检测频率2.4S，氩气碰撞池压力6*10-5mbar。1. 基质的选择，在MALDI-TOF-MS分析中，基质起着相当重要的作用。不同的基质对不同类的物质响应不同，a-氰基-4-羟基肉桂酸用于测定糖蛋白核糖核酸酶B效果相对较好。2. 糖蛋白分子量的测定，糖蛋白核糖核酸酶B由124个氨基酸组成，在34位Asn处连有一个高甘露糖型N-糖链。由于糖链的微不均一性，与普通蛋白质及核酸不同，其分子离子峰在MALDI-TOF-MS 质谱图上表现为一簇峰，各峰之间约相差一个糖基。正是由于这种微不均一性，使得其分子离子峰变宽，灵敏度降低。糖链分子量越大，峰越宽，灵敏度越低，所以一般只有糖链较短，蛋白的质量不太大的糖蛋白才能测定其平均分子量。用MALDI-TOF可直接测定糖蛋白核糖核酸酶B的平均分子量为 15208.6Da。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/03/201103211511_284179_1604317_3.jpg3. 糖含量的测定，采用O聚糖酶及内糖苷键酶F分别作用于核糖核酸酶 B，只有内糖苷键酶F能够是其分子量发生变化，表明核糖核酸酶B分子中不存在O-连接糖链存在着N-连接糖链。内糖苷键酶F切断N-糖链五糖核心最内侧的GlcNAc-GlcNAc糖苷键，得到含一个GlcNAc的肽链，减去GlcNAc，可以计算出准确的肽链分子量T=13695.6，与糖蛋白平均分子量之差为糖链的平均分子量G=1513.4，平均糖含量为：(糖链大小/糖蛋白分子量)×100%=9.95%。4. 糖基化位点的确定，研究糖基化类型及糖基化位点的策略：采用蛋白酶酶解与糖苷内切酶酶解相结合的方法，通过酶切前后含糖肽片的位移，结合网上数据库检索，可以确定糖基化类型和糖基化位点。以不同类型的糖苷内切酶作用于糖蛋白（N-糖苷键酶或O-糖苷键酶），在MALDITOF-MS 上观察其质量的变化，可以直接确定糖蛋白中是否含有响应类型的糖链，这是我们确定糖蛋白中糖苷键类型的基础。我们采用先将核糖核酸酶B还原烷基化，加Glu-C酶切，产物再用内糖苷肩酶F酶切，可观察到含糖肽段出现位移，将核糖核酸酶B的肽质量指纹图进行数据库检索，证实发生位移的肽段中含有N-糖链特异连接位点，由此确定34位Asn为糖基化位点。另外我们采用内糖苷键酶F及肽-N-聚糖酶F两种酶进行差位酶切法对含糖肽段进行验证，两种酶酶切后分子离子峰的差值除以GlcNAc的质量，结果就是N-糖基化位点的个数5. 质谱测定氨基酸序列， 我们对核糖核酸酶B肽质量指纹谱中的含糖肽段进行了串联质谱测定，首先在一级质谱图中选择离子4972.23，在串联质谱的碰撞活化室以氩气与其碰撞产生碎片，从碎片的质荷比推算出此肽片中的一段氨基酸序列，检索结果为核糖核酸酶B，从而判断其理论序列是否一致。6. 糖链结构的研究，凝集素对糖肽的亲和提取，进一步分析糖肽序列及糖链结构的关键是含糖肽段的提取。核糖核酸酶B中糖链为高甘露糖型，我们选用对其有特异性吸附的伴刀豆球蛋白对其进行提取利用这种简捷的亲和质谱的方法，对糖肽段进行了分析。建立了亲和质谱分析糖肽类物质的方法，为今后糖肽序列分析及糖链结构分析奠定了基础。二、基因重组糖蛋白人促红细胞生成素（rhEPO）的结构分析。 利用以上建立的方法，我们对样品重组人促红细胞生成素进行了分析，断定此样品为非完全糖基化，样品中只存在N-连接的糖链，无O-糖链。应用酶切法用肽-N-聚糖酶处理后，得到两个含糖肽段，进行数据库检索，测得38位及83位为N-糖基化位点，与文献报道相符，结果可靠。因此，该项课

蜂蜜中糖含量分析方法的确定及问题分析1 前言 实验室来了一批蜂蜜样品，需要测定其中的果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖，该项目不常做，接到样品先去找实验方法，适用于该项目的国标有GB/T 22221-2008和GB/T18932.22-2003, 实验室没有GB/T18932.22-2003标准中规定的色谱柱，而GB/T 22221-2008标准中规定的条件都能满足，就先按照GB/T 22221-2008标准的方法进行样品前处理和仪器分析。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/09/201609031717_608202_1669358_3.jpg2 实验部分2.1仪器及试剂 Waters e2695高效液相色谱仪、2414示差折光检测器；果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖均为分析纯；乙腈，色谱纯；实验用水为Millpore超纯水系统制得，18MΩ•cm，25 ℃2.2仪器分析条件—参照GB/T 22221-2008标准方法设定 色谱柱：CNW Athena NH2 (250mm×4.6mm, 5μm)；流动相：乙腈：水=85：15；流速：1.0mL/min；进样体积：20μL；色谱柱温度：40℃；检测器温度：40℃2.3 标准溶液的配制 分别准确称取一定质量的果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖用水溶解并定容至100mL，配成浓度为5g/100mL的标准储备溶液。 由于是条件摸索阶段，因此不急于配制系列标准溶液，先配制一个较高浓度的混合标准溶液（1g/100mL）用于确定仪器分析条件和标准曲线范围。3 遇到的问题与分析3.1 仪器分析条件的优化及单标确认 按照上述仪器分析方法对浓度为1g/100mL的混合标准溶液进行测定，测定结果见图1。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/09/201609031723_608210_1669358_3.jpg 从图中可以看出，虽然4种糖的混合标准溶液色谱图中对应出现4个色谱峰，但是却存在以下几个问题： （1） 该色谱条件下4种组分的分离时间较长，4种组分完全分离需要近35min，各组分之间的分离度较大，可以尝试进行条件优化，缩短检测时间； （2） 相同浓度下4种组分的出峰响应值相差较大，配制混合标准溶液时可以依据样品中的含量适当降低组分1或者增加其它组分的浓度； （3） 基线噪音较大，不利于微量组分的分析，对样品的定性和定量都会产生影响 针对上述问题，决定先尝试优化仪器分析条件，缩短样品测试时间。混合标准溶液的浓度在色谱柱和仪器的耐受范围内，由于是条件摸索阶段，因此暂时先不调整，仍然采用该浓度的混合标准溶液进行分析。分析条件中采用的是示差检测器，该检测器不允许进行梯度洗脱，要改善分离条件缩短测试时间只能从流动相上做文章，于是尝试通过改变流动相比例进行优化。氨基色谱柱既可以用于正相模式反相模式，又可以用于反相模式，在正相模式下，可以代替硅胶柱使用；在反相模式下可用于碳水化合物的分析，尤其适用于糖类分析，本实验即是采用氨基色谱柱的反相模式进行糖类分析。实验中发现微调流动相中有机相的含量，各组分间的分离度有很大的变化。增加乙腈的比例能够提高各组分间的分离度，但测试时间延长；降低乙腈的比例会降低各组分的分离度，但却很大程度上缩短了测试时间。当流动相为乙腈：水=75：25时，4种糖的测定时间缩短至15 min，同时4种糖具有较好的分离度。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/09/201609031725_608216_1669358_3.jpg 上述测试过程中使用的是4种糖的混合标准溶液，每个峰对应的待测组分还是未知的，因此在该仪器分析条件下先对各组分进行单标确认。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/09/201609031731_608223_1669358_3.jpg 在单标确认的过程中又发现以下几个问题： （1） 虽然混合标准溶液色谱图中出现了4个完全分离的色谱峰，但是对比单标色谱图发现，每个单标色谱图中都出现了两个峰， 而4min附近色谱峰的峰面积和峰高几乎 一致，很有可能是溶剂峰； （2） 如果4min附近的色谱峰是溶剂峰，那么4种混合标准溶液色谱图中实际上只分离出了3种组分，有一种组分没有出峰或者与其他组分的保留时间接近； （3） 对比葡萄糖和麦芽糖的单标色谱图发现，两者的保留时间完全一致，可能是操作有误，两者组分在配制或在进样时弄错了。 针对上述问题逐一进行排查，由于所用的混合标准溶液是用水配制和稀释的，4min附近的色谱峰是否是溶剂峰只需进一针水样即可，因此首先以纯水为样品进行进样测试，并且重新配制葡萄糖和麦芽糖的标准溶液并测试，配制和进样过程及其仔细防止中间环节出错。实验结果表明，4min附近的色谱峰为溶剂峰（见图4），同时重新测定后葡萄糖和麦芽糖的保留时间仍然完全一致。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/09/201609031732_608226_1669358_3.jpg 葡萄糖和麦芽糖的保留时间一致，考虑是否是仪器分析方法不合适导致这两种组份没有分离？在前面的实验中发现，微调流动相比例4种糖的保留时间会有很明显的变化，于是尝试通过改变流动相的方式进行分离，然而实验中发现改变流动相两者的保留时间是同步变化的。实验遇阻，就去查资料。百度一下葡萄糖和麦芽糖基本信息和结构（见图5），两者的分子式和结构都有很大的差别。然后去查阅文献，发现采用氨基柱分离葡萄糖和麦芽糖的文献并不少见。看来是人品与技术的问题了。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/09/201609031735_608231_1669358_3.jpg 难道是色谱柱的原因？色谱柱柱效下降导致两者不能分离？于是更换新的色谱柱再次分离，结果还是没有能够将两者分离。如果葡萄糖和麦芽糖无法分离，实验便无法进行下去，在经过上述尝试之后将问题的矛头指向了所用的试剂。查试剂台账，发现实验室里还有其他品牌分析纯的葡萄糖，而麦芽糖仅此一瓶，但是幸运的是发现了葡萄糖和麦芽糖的标准品，决定使用麦芽糖和葡萄糖的标准品试一下。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/09/201609031739_608238_1669358_3.jpg 实验结果表明，采用分析纯和标准品配制的葡萄糖标准溶液的出峰时间保持一致，而采用分析纯和标准品配制的麦芽糖标准溶液的出峰时间出现了差异。总算是苦尽甘来找到了问题的症结，看来这次是 “李逵”遇到了“李鬼”。重新配制4种糖的混合标准溶液，采用上述仪器分析条件进行测定时4种糖得到了较好的分离，因此继续延用上述的仪器分析条件进行后续测定。3.2 溶剂效应的消除 4种糖的分离和确认过程基本完成，接下来解决溶剂效应的问题。溶剂效应在液相分析中是一种很常见有时也是很让人头疼的现象，严重的溶剂效应可能会影响到分析结果。溶剂效应产生的原因和处理方法论坛中早有前辈进行过细致的讲解（想了解更多可以参看帖子http://bbs.instrument.com.cn/topic/6108594； http://bbs.instrument.com.cn/topic/6111353），这里也不过多的赘述。虽然此次的溶剂效应不会影响定性和定量，但是那“高高再上”的溶剂峰看着很难受，于是想尝试解决或者减轻溶剂效应，降低溶剂峰的峰响应。为了减少分析时间，同时减少标准品的消耗（麦芽糖的标准品只有0.25g/瓶）决定直接用流动相中的两相（乙腈和水）进行尝试。通过改变乙腈和水的体积比考察溶剂峰的出峰情况。实验发现，在上述色谱条件下以乙腈为样品进行测试时溶剂峰为响应值很大的倒峰；以水为样品进行测试时溶剂峰为响应值很大的正峰；调节两者的比例可以改变溶剂峰的出峰情况，如图7。[align=lef

安谱推出的CNW Athena NH2-RP液相色谱柱是一款专用于反相条件的氨基柱，相比传统的氨基柱，此款柱子的键合相流失低，寿命长，柱稳定性高。采用反相方法质控，确保每根柱子反相使用效果，纯乙腈保存，反相使用时无需切换流动相。特别适用于糖类的分析，符合15版药典和现行国标的检测要求。[img=,690,936]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/11/201711061112_01_2733737_3.jpg!w690x936.jpg[/img]

[color=#444444]利用水浴提取不同处理组样品中可溶性糖。利用高效液相色谱仪对可溶性糖进行分析（如图）。[/color][color=#444444] 发现不同处理组之间的差异主要体现在7.57 min，但现在只知道10.74 min为纤维二糖，后面的峰为各种单糖，只能初步推测7.57 min的为低聚糖，那么问题来了，怎么通过分析技术确定这种低聚糖的种类呢（比如是四糖还是五糖等），请求各位指导下，谢谢。[/color][color=#444444][img=,646,515]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909020939208855_8023_1646718_3.png!w646x515.jpg[/img][/color]