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蛋白质纯化及复性 重组蛋白在大肠杆菌(E. coli)高效表达时,往往以不溶的、无活性的蛋白聚集体,即包涵体(inclusion body)的形式存在于细胞内。必须从细胞内分离出包涵体,采用高浓度变性剂(如7.0mol/L盐酸胍、8.0mol/L脲)溶解包涵体,然后除去变性剂或降低变性剂的浓度,使包涵体蛋白得以复性,最后再用色谱法使目标蛋白质得到纯化。其中包涵体蛋白的复性和纯化是整个过程中的核心。 目前重组蛋白生产中普遍存在的问题是:(1)复性效率低。传统的复性方法稀释法和透析法。稀释复性法对样品几十倍,甚至上百倍的稀释会使样品的体积急剧增大,给后续的分离纯化带来很大的困难,而且复性过程中需要较大的复性容器。透析法耗时较长,而且要多次更换透析溶液。这两种方法的共同缺点是蛋白质在复性过程中会发生聚集而产生大量沉淀,复性效率低,通常蛋白质的活性回收率只有5~20%,而且复性后的蛋白质溶液中含有大量的杂蛋白,需要进行进一步的分离纯化。(2)工艺路线烦琐,生产周期长。在传统的重组蛋白质分离纯化工艺中,大多采用经典的软凝胶分离介质,由于这种介质的颗粒较大,分离效率较差,因此常常需要采用多种不同模式的色谱操作联用对目标蛋白质进行纯化,才能得到纯度符合一定标准的目标蛋白质。另外,这种色谱介质的耐压性很差,只能在流速较低的情况下进行操作,分离纯化时间较长。分离纯化步骤多和分离时间长使得蛋白质的质量回收率和活性回收率很低。而且在传统的重组蛋白质生产工艺中,蛋白质的复性和纯化是生产过程中两个独立的单元操作,也在很大程度上制约着生产效率。(3)生产成本高,设备投资大。由于复性和分离纯化分别单独进行,而且分离纯化步骤多,每一步都需要有与之配套的设备,致使设备投资大,生产成本高。随着生产规模的增加,这种弊端会愈来愈严重。 1991年耿信笃教授首先将高效疏水相互作用色谱(HPHIC)用于变性蛋白的复性,很好的解决了上述问题,现已成功用于重组人干扰素-g(rhIFN-g)、重组人干扰素-a(rhIFN-a)、人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)、重组人胰岛素原(proinsulin)、重组牛朊病毒(prion)等重组蛋白以及溶菌酶和核搪核酸酶等标准模型蛋白的复性与同时纯化中。目前,排阻色谱法、离子交换色谱法和亲合色谱法也已用于蛋白质的复性和同时纯化中。与传统的稀释法及透析法比较,用色谱法进行蛋白复性的优点是:①在进样后可很快除去变性剂;②由于色谱固定相对变性蛋白质的吸附,可明显地减少、甚至完全消除复性过程中蛋白质聚集体和沉淀的产生,从而提高蛋白质复性的质量和活性回收率;③在蛋白质复性的同时可使目标蛋白质与杂蛋白分离以达到纯化的目的,使复性和纯化同时进行;④便于回收变性剂,以降低废水处理成本。简言之,色谱法复性可以提高蛋白质的活性和质量回收率,将蛋白复性和纯化集成在一步操作完成,缩短了操作步骤和生产时间,减少了设备投资,使生产成本大大降低,已经引起了全世界范围内许多生化研究者和重组蛋白药物生产厂家的关注。由于高效液相色谱(HPLC)分离效率高,往往在一步操作中便可得到纯度符合要求的蛋白质,而且分离速度快,在应用方面具有更大的优势。
蛋白质折叠病 ▲许多疾病,如阿兹海默症(Alzheimer's),疯牛病(Mad Cow, BSE),可传播性海绵状脑病(CJD),肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS),还有帕金森氏症(Parkinson's)等正是由于一些细胞内的重要蛋白发生突变,导致蛋白质聚沉或错误折叠而造成的。因此,深入了解蛋白质折叠与错误折叠的关系对于这些疾病的致病机制的阐明以及治疗方法的寻找将大有帮助。 ▲基因组序列的发展使我们得到了大量的蛋白质序列,结构信息的获得对于揭示它们的生物学功能是十分重要的。依靠现有手段(X-ray晶体衍射、NMR及电镜)测定蛋白质的结构需要较长的时间,因此结构解析的步伐已落后于发现新蛋白的步伐。而结构预测的方法虽然速度较快,但可靠性并不高,只有当我们对于维持蛋白质结构,驱动蛋白质折叠的理化因素更为了解,这一方法才可能有根本的改进。另外,我们对于蛋白质相互作用、配体与蛋白质的作用等结构与功能关系的研究也有赖于蛋白质折叠机制的阐明。【蛋白质折叠与“折叠病” 】 人们对由于基因突变造成蛋白质分子中仅仅一个氨基酸残基的变化就引起疾病的情况已有所了解,即所谓“分子病”,如地中海镰刀状红血球贫血症就是因为血红蛋白分子中第六位的谷氨酸突变成了颉氨酸。现在则发现蛋白质分子的氨基酸序列没有改变,只是其结构或者说构象有所改变也能引起疾病,那就是所谓“构象病”,或称“折叠病”。 大家都知道的疯牛病,它是由一种称为Prion的蛋白质的感染引起的,这种蛋白质也可以感染人而引起神经系统疾病。在正常机体中,Prion是正常神经活动所需要的蛋白质,而致病Prion与正常Prion的一级结构完全相同,只是空间结构不同。这一疾病的研究涉及到许多生物学的基本问题。一级结构完全相同的蛋白质为什么会有不同的空间结构,这与Anfinsen原理是否矛盾?显然这里有蛋白质的能量和稳定性问题。 从来认为蛋白结构的变化来自于序列的变化,而序列的变化来自于基因的变化,生命信息从核酸传递到蛋白。而致病Prion的信息已被诺贝尔奖获得者普鲁辛纳证明不是来自基因的变化,致病蛋白Prion导致正常蛋白Prion转变为致病的折叠状态是通过蛋白分子间的作用而感染!这种相互作用的本质和机制是什么?仅仅改变了折叠状态的分子又如何导致严重的疾病?这些问题都不能用传统的概念给予满意的解释,因此在科学界引起激烈的争论,有关研究的强度和竞争性也随之大大增强。 由于蛋白质折叠异常而造成分子聚集甚至沉淀或不能正常转运到位所引起的疾病还有老年性痴呆症、囊性纤维病变、家族性高胆固醇症、家族性淀粉样蛋白症、某些肿瘤等等。由于分子伴侣在蛋白质折叠中至关重要的作用,分子伴侣本身的突变显然会引起蛋白质折叠异常而引起折叠病。随着蛋白质折叠研究的深入,人们会发现更多疾病的真正病因和更针对性的治疗方法,设计更有效的药物。现在发现有些小分子可以穿越细胞作为配体与突变蛋白结合,从而使原已失去作战能力的突变蛋白逃逸“蛋白质质量控制系统”而“带伤作战”。这种小分子被称为“药物分子伴侣”,有希望成为治疗“折叠病”的新药。 新生肽的折叠问题或蛋白质折叠问题不仅具有重大的科学意义,除了上面提到的在医学上的应用价值外,在生物工程上具有极大的应用价值。基因工程和蛋白工程已经逐渐发展成为产值以数十亿美元计的大产业,进入21世纪后,还将会有更大的发展。但是当前经常遇到的困难,是在简单的微生物细胞内引入异体DNA后所合成的多肽链往往不能正确折叠成为有生物活性的蛋白质而形成不溶解的包含体或被降解。这一“瓶颈”问题的彻底解决有待于对新生肽链折叠更多的认识。
国家蛋白质科学上海设施/国家蛋白质科学中心(上海)(筹)公开招聘机械电气工程师国家蛋白质科学研究上海设施是国家重大科技基础设施,是国家级蛋白质科学研究平台;在设施建设基础上,依托中国科学院上海生命科学研究院,委托生物化学与细胞生物学研究所(简称SIBCB)负责筹建成立并管理国家蛋白质科学中心(上海)(筹), 负责设施的运行管理。中心在筹建期间,办公地点设于生化与细胞所(上海市岳阳路320号);中心在建成运行期间,办公地点设于浦东新区张江高科技园区中区西部(上海市海科路333号)。中心定位于:支撑国家蛋白质上海设施建设的建设,衔接该设施的运行;聚集培养生命科学与生物技术特别 是蛋白质研究的人才,提升国家蛋白质研究能力;进而促进我国蛋白质基础研究的飞跃发展。中心将立足于国家生命科学与生物技术及相关研究领域雄厚的研究基础和创新实力,成为兼具蛋白质科学研究、技术及成果的转化、集成和应用平台的国家级的重要科学研究单元。国家蛋白质科学中心(上海)(筹)现因工作扩展的需要,公开招聘机械电气工程师两名。一、岗位职责:参与蛋白质科学研究中心(上海)(筹)在上海同步辐射光源5线6站的建设;参与5线6站建成后的运行和管理工作,辅助线站管理人员完成线站上机械设备,真空系统以及水,电,气等设备的巡查和维护;参与5线6站相关的科学研究工作。二、任职条件:1、具有机械或电气专业本科以上学历。2、爱好机械设计,动手能力强。具有大型机、电设备安装、维修工作经验者优先;3、有一定的机械制图或电子电路设计经验,至少熟悉autocad,protel或power pcb软件中的一种,能读懂相关的设计图纸。4、具有良好的人际关系和团队协作精神,工作努力,作风踏实,责任心强。5、有同步辐射线站相关工作经验者优先。6、身体健康,能长期稳定工作。 三、招聘方式及程序 1、应聘材料:(1)《[color