病毒基因分析仪

据路透社报道，近日国际流感专家表示，H7N9病毒仍然可能在同其他病毒株交换基因，寻找令它变得更加强大的基因。如果基因交换成功，世界可能将面临致死性禽流感大流行的威胁，但是它也可能失败，然后不了了之。　　据报道，这种病毒的不稳定性也引发有关是否H7N9可能对罗氏公司的达菲变得具有抗药性的疑问，对该病毒基因数据的分析已经表明这种可能性。　　英国伦敦帝国学院流感病毒学家温迪.巴克莱(Wendy Barclay)说，即使我们手上只有三个基因序列，有证据显示，其中一个序列跟其他两个不太吻合。所以我们可能认为，这种病毒仍然在四处寻觅它喜欢的基因类型。　　据报道，迄今为止来自于三名H7N9死亡感染者的样本的基因序列数据显示，H7N9病毒是所谓的"三重重组"病毒，混合了来自亚洲鸟类中发现的三种流感病毒基因。　　研究人员在上周出版的《新英格兰医学杂志》中对该病毒的来源进行了仔细分析。　　研究人员称，迄今为止，这种病毒重组似乎发生在鸟类身上，而不是在人类或其他哺乳动物身上，这是一个稍微令人安心的迹象。这个过程可能将继续，并可能意味着距离病毒发现一种可以令它在鸟类迅速传播的形式还有一段距离。　　据报道，最近的大流行病毒包括2009年爆发的H1N1"猪流感"病毒，是哺乳动物和鸟类流感的混合物。专家说这些杂种更可能症状轻微，因为哺乳动物流感倾向于让人类患病不如禽流感那么严重。　　而纯粹的禽流感病毒，比如新的H7N9和自从2003年以来杀死622个患者当中371人的H5N1病毒，通常对人类更加致命。　　据外媒报道，荷兰和中国的研究人员分析H7N9禽流感病毒后发现，病毒基因正在大范围传播，并出现基因变异。而且这种变异在未来可能继续，使得人传人的风险变大。　　据报道，研究人员就基因数据进行分析，称该病毒的基因多样性程度，已与之前在禽类中大范围爆发的其它H7病毒株相仿。　　荷兰国立公共卫生和环境研究所(RIVM)的病毒专家吉柏曼斯(MarionKoopmans)表示，我们采样研究来自中国的病毒，发现其基因多样性堪比数年前在荷兰大爆发的病毒，以及在意大利爆发过的病毒。　　他说，这意味着H7N9将能传播更广，现在的重点是搞清楚如何传播。　　从病毒的基因多样性看，该病毒有能力实现重复变异，因此在人与人之间传播的机率升高。　　吉柏曼斯说，这种病毒传播也许是在鸟类之间、也许是在哺乳动物之间完成的，但现在还不清楚它跟哪些动物有关。　　吉柏曼斯领导的团队将H7N9病毒数据与2003年在荷兰禽类和人类大规模爆发的H7N7病毒、以及1999和2000年在意大利禽类中大规模爆发的H7N1病毒作了比较。　　研究报告指出，H7N9病毒肯定已经广泛传播，并达成了基因多样化。病毒已经完成了一些演变，且未来可能继续变异，升高大规模人际感染的风险。　　中国流感专家和世界卫生组织则称，目前还没有证据表明该病毒容易在人与人之间传播。

高通量测序之于病毒基因组，在检测和研究中的意义和价值已得到广泛验证。但在开展具体的高通量测序工作时，可能会面临很多实际的操作问题，譬如：方法上选择宏基因组测序还是靶向测序？测序策略上选择多少数据量、何种读长？哪些测序平台的通量和数据量更能满足实验室检测要求？以新冠病毒为例，本文对高通量测序在检测和研究中可能面临的问题与选择进行一一剖析。图1 在检测和研究中可能面临的问题与选择测序目的：快速检测or序列组装？高通量测序技术应用于新型冠状病毒的检测和研究，可以实现快速检测以及病毒序列组装。测序目的不同，需要选择合适的方法和策略：如需对qPCR检测呈阴性的疑似病例进行确诊，或对复合性感染、继发性感染等进行鉴别诊断，或对大量待测样本进行大规模筛查，可以利用高通量测序技术进行快速检测；如果需要实现病毒序列组装，以进行未知病原的检测、分析和研究，可以利用高通量测序技术进行更高深度更高覆盖度的测序，获得完整的病毒基因组序列。测序方法：宏基因组测序or靶向测序？对病毒基因组进行高通量测序，可以采取宏基因组测序或靶向测序（包括探针捕获测序和多重PCR扩增子测序）。不同的方法各有优势，可根据实际应用进行选择。图2 不同高通量测序方法的比较可供参考的建议如下：1. 对未知病原的发现及确认，首选宏基因组测序；2. 如需检测或研究样本中所有可能感染的微生物，比如诊断不明原因感染、混合感染、继发感染等，可以选择宏基因组测序；3. 如只需针对目的病毒进行检测，希望以较少的数据量获得目的病毒全长序列，可以选择靶向测序。测序数据量关于测序数据量，需结合具体的测序目的、测序方法、样本病毒载量等因素进行综合评估。通常，提高测序数据量,可以提高检测灵敏度，改善临床检测的阳性率。另外，提高测序数据量，可以提高数据覆盖度，病毒序列组装效果更好。以满足病毒基因组覆盖度95%，且单碱基深度10x为条件：如采用宏基因组测序，可根据使用的研究材料（即待检样本）的情况，选择测序数据量。病毒载量在104 copies/ml以上或qPCR定量CT值24.5的样本，推荐数据量为20Gb（PE100，100M reads）；qPCR定量CT值在24.5~28.7范围的样本，推荐数据量为100Gb(PE100,500M reads)。对于病毒载量极低的样本（CT值＞28.7），不建议使用宏基因组测序，可以采用多重PCR扩增子测序。如采用多重PCR扩增子测序，推荐数据量为5-20M。该方法也适用于病毒载量极低（＜102copies/ml）的极端样本检测。注：推荐样本数据量仅供参考图3 基于测序方法及样本病毒载量的测序数据量选择测序读长如进行快速检测，可采用单端测序，推荐SE50/SE100读长，快速、经济；如需要进行病毒全长序列组装，建议使用双端测序，推荐PE100/PE150读长，测序数据质量高、Reads比对更好。图4 测序读长选择测序文库的处理针对病毒RNA测序，在文库制备过程中是否去除核糖体RNA(rRNA)也是一个值得探讨的问题。rRNA占总RNA的80%以上，去除人类rRNA可以提高有效数据利用率。同时也需要考虑样本情况：如果病毒核酸投入量低，以及放置时间久、降解严重的样本，去除rRNA可能会影响建库效果，可以选择不去rRNA，以提高建库成功率。图5 MGIEasy rRNA去除试剂盒测序平台的选择根据实验室样本规模，选择合适的测序平台。每个平台单次运行的样本数与测序方法、测序数据量相关。其中，宏基因组测序方法，一般以单个样本的数据通量100M reads为参考；多重PCR扩增子测序方法，以单个样本的数据通量＞5M reads为参考。注1.以单个样本的数据通量100M reads为例；注2.以单个样本的数据通量＞5M reads为例。图6 测序平台单次运行的样本数估算小贴士基于DNBSEQ平台的已发表文章目前，已有多篇基于DNBSEQ平台的新冠科研文章在Lancet、nature、Cell等顶级期刊获发。基于DNBSEQ平台的高通量测序技术助力新冠病毒科研攻关，得到了越来越多科研学者的认可。参考文献Multiple approaches for massively parallel sequencing of HCoV-19(SARS-CoV-2) genomes directly from clinical samples.

6月10日信息显示，韩国目前中东呼吸综合征（MERS）确诊病例为108人，死亡9人，死亡率在7%左右。韩国病例数仅次于沙特，列世界第二。近期MERS在韩国连续报告多例病例，被隔离人员一天增加百余人，超1300所学校停课，民众如临大敌。而中国广州也确诊了首例韩籍MERS患者，中国赴韩旅行团出现退团潮。　　MERS致死率高于SARS　　在首例MERS确诊病例入境中国的消息披露后，这个在公众眼中显得颇为神秘的病毒引起了诸多关注甚至担忧。　　据悉，引发MERS的是一种冠状病毒，可能来自骆驼。其临床表现和非典（SARS）很相似，都会出现发烧、咳嗽和急性呼吸窘迫综合症，有时还会伴有肾衰竭。令人惊讶的是MERS致死率竟比SARS高，大约为37%，2003年SARS流行时致死率大概是10%，低于禽流感和埃博拉的热出血。幸运的是，目前MERS与SARS相比，流行强度仍然很弱。　　中国疾控中心近日透露，该中心病毒病所与广东省及惠州市疾控中心合作，已完成我国首例MERS病例的病毒全基因组序列测定。　　序列分析结果表明，该病毒与当前中东地区MERS&mdash CoV（引起MERS的新型冠状病毒）流行株高度同源，根据遗传学相关分析初步推测，该毒株最终可能来源于中东地区的沙特阿拉伯。目前尚未发现与病毒传染性增强相关的明显证据，对于病毒基因组上少量基因变异和重组的生物学意义正在进一步分析。　　专家介绍，通过检测、对比细菌或病毒的基因序列，可以追寻疫情发展的踪迹，破解细菌或病毒的性质、来源、传播力和毒力，从而找到有效的防控和治疗措施。　　世卫在韩成立联合调查组　　世卫组织总干事陈冯富珍近日表示，虽然韩国MERS疫情在医疗机构内扩散，导致确诊病例增多，但韩国可以采取有效措施防止疫情进一步蔓延。　　陈冯富珍指出，韩国拥有先进的医疗设备，医务工作者水平较高，因此能迅速掌握MERS疫情动态。她说，世卫组织和韩国政府携手成立的调查组，从6月9日起对韩国政府的MERS防控措施进行评估，还将研究新的防控措施。　　对于有效应对MERS疫情的方法，陈冯富珍指出，民众不要轻信谣言，要正确认识疫情和防控信息。韩政府需要减少收治MERS患者的医院数，减少民众与MERS患者的接触几率，降低疫情扩散风险。　　陈冯富珍表示，韩国病人在医院住院治疗时，其家属时常到病房探望。她认为，这可能是MERS疫情在韩国医院内迅速扩散的主要原因之一。　　对于世卫组织认为，韩国不必因MERS疫情作为限制旅行或封锁边境，陈冯富珍指出，目前没有证据表明MERS疫情已经在韩国社区内迅速或广泛扩散。　　就针对MERS病毒的疫苗研发情况，她表示，世卫组织没有直接参与传染病疫苗的研发工作，但部分疫苗已处于临床试验阶段，世卫组织将积极鼓励研发机构开发针对MERS病毒的疫苗。　　如何做好个人防护　　目前尚无特效药和疫苗可以应对这种新型冠状病毒，不过，世卫组织呼吁大家不要恐慌，因为该病毒目前尚不具备持续人际传播能力。在个人防护方面，要注意以下几点：　　首先，赴中东旅行时尽量避免与患病骆驼接触；进入骆驼棚、相关农场或市场的人，切记要在事后洗手；骆驼奶要加热饮用，骆驼肉也要烹熟再吃。　　其次，勤洗手，避免用手直接触摸眼睛、鼻、口；外出时戴口罩，尽量避免密切接触有呼吸道感染症的人；老人及病人尤其要注意自身健康状况。　　第三，旅行期间应注意保持均衡饮食，充足休息，不要过度劳累。尽量避免前往动物饲养、屠宰场所及野生动物栖息地。　　第四，出现呼吸道异常症状要及时就医，打喷嚏、咳嗽或清洁鼻子后应彻底洗手。　　第五，入境时有发热、咳嗽、呼吸急促等症状者，应主动说明并配合开展调查及相应医学检查。回国14天内，如果出现急性呼吸道感染症状应当及时就医，就诊时应戴口罩并避免乘坐公共交通工具前往医院。同时，主动告知近期旅行史，以便及时得到诊断和治疗。　　我国首例韩籍病患情况渐稳　　据广东省卫生计生委6月9日通报，在广东境内的75名中东呼吸综合征密切接触者无人出现不适，近日可全部结束隔离观察。同时，广东5月29日发布的确诊患者已连续4天无发热，血液及咽拭子标本检测中东呼吸综合征病毒核酸为阴性，病情逐渐稳定好转。　　专家表示，目前，病人间中咳嗽，无明显咳痰，吸氧情况下无明显气促，胸片显示双肺仍然有炎症，渗出较前减少。病情整体趋于稳定，但仍需警惕合并感染及出现变化。治疗上根据中国工程院院士、呼吸道疾病专家钟南山等专家组意见适时调整治疗方案。　　赴惠州指导救治的广州市第八人民医院传染病专科主任邓西龙表示，如果目前的情况能够持续好转，大约两周病人可以出院。　　针对韩国近期以来疫情有扩散趋势，钟南山说，从已有病例看，中东呼吸综合征致死率较高。韩国首例病患的传染性很强，目前多数确诊病例都是被其传染的，后续如果再出现更多传染病例，那就值得高度警惕。　　钟南山表示，从现阶段所掌握的情况看，MERS主要通过呼吸道传染，传染途径类似非典的喷嚏、飞沫传播，但通过空气传染的证据仍不充分。为此，做好输入性病例疫情防控，需要口岸部门和旅客两方面的共同努力。他说：&ldquo 各国来华人员应本着诚实负责的态度，入境时主动申报健康状况，不应该隐瞒任何信息，只有这样才能真正减少疫情在全球扩散传播的风险。&rdquo （MERS）