酶抑制剂

作者：倪晨;陈汀波;梁远园;王倩;（广东广州中医药大学;）摘要：目的建立快速、准确的检测中药保健品中非法添加磷酸二酯酶5(PDE5)抑制剂的方法。方法采用高效液相色谱法(HPLC)检测,DiamonsilC18色谱柱;流动相:乙腈-0.05mol·L-1三乙胺(用磷酸调PH至6.0)=40:60,流速1.0mL·min-1,检测波长290nm。结果该保健酒中未检出PDE5抑制剂:枸橼酸西地那非、盐酸伐地那非、他达拉非。结论该方法灵敏度高,重复性好,可用于PDE5抑制剂的定性检查。谱图：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/08/201208131450_383525_1606903_3.jpg

[align=center][b][font=Arial][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]MS[font=宋体]法同时分析血液中五种免疫抑制剂浓度[/font][/font][/b][/align][b][font=Arial]1[font=宋体]、项目背景：[/font][/font][/b][font=Arial][font=宋体]免疫抑制剂通过抑制淋巴细胞的功能，减少移植物排斥反应的发生，延长移植物存活时间。但由于不良反应较多，常常需要在低剂量发生移植物排斥和高剂量产生毒性之间取得平衡。临床常用的免疫抑制剂如环孢素Ａ（[/font]Cyclosporin A[font=宋体]）、霉酚酸酯（[/font][font=Arial]Mycophenolate mofetil[/font][font=宋体]）、他克莫司（[/font][font=Arial]Tacrolimus[/font][font=宋体]）、西罗莫司（[/font][font=Arial]Sirolimus[/font][font=宋体]）、依维莫司（[/font][font=Arial]Everolimus[/font][font=宋体]）等，由于其治疗窗窄，其药动学存在明显的个体间差异，因此需要密切监测药物浓度，以确保处于安全有效的治疗范围。[/font][/font][font=Arial] [/font][b][font=Arial]2[font=宋体]、实验部分[/font][/font][font=Arial]2.1 [font=宋体]实验仪器[/font][/font][/b][font=Arial][font=宋体][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]质谱检测系统：[/font]AB SCIEX Triple Quad[/font][sup][font=Arial]TM [/font][/sup][font=Arial]4500MD[/font][font=Arial][font=宋体]高速冷冻离心机：[/font]D1524R[/font][b][font=Arial]2.2[font=宋体]样本制备[/font][/font][/b][font=Arial][font=宋体]取[/font]100 μL[font=宋体]全血样本，加入[/font][font=Arial]100 μL[/font][font=宋体]硫酸锌水溶液，再加入[/font][font=Arial]300 μL[/font][font=宋体]含内标工作液，涡旋混匀[/font][font=Arial]1 min[/font][font=宋体]，将样品于[/font][font=Arial]4 [/font][/font][font=宋体]℃[/font][font=Arial][font=宋体]条件下[/font]14000 rmp [font=宋体]离心[/font][font=Arial]10 min[/font][font=宋体]，取[/font][font=Arial]200 μL[/font][font=宋体]上清于进样小瓶中，进行[/font][font=Arial][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]MS[/font][font=宋体]分析。[/font][/font][b][font=Arial]2.3[font=宋体]分析方法[/font][/font][/b][font=Arial]Column: [/font][font=Arial]ChromCore BR C18[/font][font=宋体] [/font][font=Arial]3μm[/font][font=宋体]，[/font][font=Arial]2.1×50mm[font=宋体]（[/font][font=Arial]Part No.A301-030018-02105S[/font][font=宋体]）[/font][/font][font=Arial]Mobile Phase:[/font][font=Arial]A[/font][font=宋体][font=Arial])[/font][/font][font=Arial] 0.1%[font=宋体]甲酸[/font][font=Arial]-2 mM[/font][font=宋体]乙酸铵[/font][font=Arial]-[/font][font=宋体]水[/font][/font][font=Arial]B[/font][font=宋体][font=Arial])[/font][/font][font=Arial] [font=宋体]甲醇[/font][/font][font=Arial]Gradient:[/font][font=Arial]2 min 40% B[/font][font=Arial]Flow Rate:[/font][font=Arial]0.7 mL/min [/font][font=Arial]Temperature:[/font][font=Arial]45 [/font][font=宋体]℃[/font][font=Arial]Injection:[/font][font=Arial]5 μL[/font][font=Arial] [/font][font=Arial]3、[/font][b][font=Arial][font=宋体]实验结果[/font][/font][font=Arial]3.1[font=宋体]色谱图[/font][/font][/b][img=,461,]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/02/202302081606114692_9457_3237657_3.jpg!w577x317.jpg[/img][img=,482,]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/02/202302081606269328_9094_3237657_3.jpg!w603x336.jpg[/img][font=Arial] [/font][img=,482,]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/02/202302081606409213_8305_3237657_3.jpg!w603x336.jpg[/img][font=Arial] [/font][img=,484,]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/02/202302081606522770_8442_3237657_3.jpg!w605x337.jpg[/img][img=,507,]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/02/202302081607038290_6320_3237657_3.jpg!w634x353.jpg[/img][img=,507,]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/02/202302081607189938_5889_3237657_3.jpg!w634x353.jpg[/img][b][font=Arial]3.2[font=宋体]标准曲线[/font][/font][/b][img=,690,377]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/02/202302081608314281_2289_3237657_3.png!w690x377.jpg[/img][font=Arial][font=宋体]霉酚酸（线性范围[/font]50~5000 ng/mL[font=宋体]）、环孢素[/font][font=Arial]A[/font][font=宋体]（线性范围[/font][font=Arial]10~1000 ng/mL[/font][font=宋体]）、他克莫司（线性范围[/font][font=Arial]1~100 ng/mL[/font][font=宋体]）、依维莫司（线性范围[/font][font=Arial]1~100 ng/mL[/font][font=宋体]）、西罗莫司（线性范围[/font][font=Arial]1~100 ng/mL[/font][font=宋体]）在其线性范围内呈现良好的[/font][/font][font=Arial][font=宋体]线性关系，[/font]r[font=宋体]值均在[/font][font=Arial]0.99[/font][font=宋体]以上。[/font][/font][b][font=Arial]4[font=宋体]、结论[/font][/font][/b][font=Arial][font=宋体]本文建立了全血样本中霉酚酸、他克莫司、依维莫司、西罗莫司、环孢素[/font]A[font=宋体]五种免疫抑制剂的[/font][font=Arial][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]MS[/font][font=宋体]测定方法。采用色谱柱[/font][/font][font=Arial]ChromCore BR C18[/font][font=Arial][font=宋体]分析霉酚酸、他克莫司、依维莫司、西罗莫司、环孢素[/font]A[font=宋体]，结果显示，目标物保留强，峰形良好，分析时间短，满足日常检测需求。[/font][/font][font=Arial][font=宋体]色谱柱信息：纳谱分析[/font]ChromCore BR C18[/font][font=宋体] [/font][font=Arial]3μm[/font][font=宋体][font=Arial],[/font][/font][font=Arial] 2.1×50mm[/font]

[align=center][b]使用酶标仪测定α-淀粉酶抑制率方法的研究[/b][/align][align=left][b]1.实验原理[/b][/align][align=left] 淀粉的消化主要有α-淀粉酶与α-葡萄糖苷酶的参与，α-淀粉酶水解α-1,4-连接键，消化的产物主要有麦芽糖、麦芽三糖、α-糊精，这些物质的进一步消化要在小肠上靠α-葡萄糖苷酶进行，α-葡萄糖苷酶主要包含麦芽-葡糖淀粉酶与蔗糖-异麦芽糖酶，α-葡萄糖苷酶水解的产物是葡萄糖。因此，通过抑制淀粉酶或葡萄糖苷酶的活性，阻碍食物中碳水化合物的水解与消化，减少糖分的吸收，以达到控制体内血糖浓度水平。[/align][align=left] 本实验是针对淀粉酶水解淀粉溶液而导致溶液中浑浊度的变化，测定溶液吸光度值的变化，以抑制剂阿卡波糖作为参照标准，抑制淀粉酶的能力以阿卡波糖当量来表达。[/align][align=left][b]2.实验方法与数据处理[/b] 将空白、样品或标准抑制剂Acarbose(阿卡波糖)与α-淀粉酶溶液混合均匀，37℃保温孵育15min，然后再加入淀粉溶液，快速振荡后在660nm迅速开始测定，利用酶标仪配备软件记录吸光度OD，初始吸光度值记为f1，以后每隔一段时间测定一个点，吸光度分别记为f1, f2 …，抑制剂作用下衰减曲线下的积分面积，扣除无抑制剂的空白曲线下面积，得出抑制剂的曲线下净面积(Net AUC)。衰退曲线下面积AUC可以近似看作各梯形面积之和，可以表达为：AUC=0.5×(f[sub]1[/sub]+f[sub]2[/sub])×ΔT+0.5×(f[sub]2[/sub]+f[sub]3[/sub])×ΔT+...+0.5×(f[sub]x[/sub]+f[sub]x+1[/sub])×ΔT+...+0.5×(f[sub]n-1[/sub] +f[sub]n[/sub])×ΔT=0.5×[2×(f[sub]1[/sub] +f[sub]2[/sub] +...+ f[sub]n-1[/sub] +f[sub]n[/sub])-f[sub]1[/sub] -f[sub]n[/sub]]×ΔT其中f[sub]n[/sub]代表第n个测定点时的吸光度，ΔT为相邻两个测定点之间的时间间隔，因本实验测定方法中ΔT设定为2min，一共有61测定点，因此该公式可以简化为：AUC=2×(f[sub]2[/sub]+f[sub]3[/sub]+...+f[sub]60[/sub])+ f[sub]1[/sub] + f[sub]61[/sub]以Acarbose当量μmol Acarbose equivalent/g (μmol AE/g)表达。[/align][align=left][b]3.试剂溶液的制备3.1 磷酸盐缓冲溶液3.1.1 CaCl[sub]2[/sub]溶液[/b]准确称取CaCl[sub]2[/sub]2H[sub]2[/sub]O粉末0.25g溶于100 mL ddH[sub]2[/sub]O，即为CaCl[sub]2[/sub]溶液2500mg/L。[b]3.1.2缓冲溶液工作液[/b]分别称取8.9g Na[sub]2[/sub]HPO[sub]4[/sub]2H[sub]2[/sub]O与6.9g NaH[sub]2[/sub]PO[sub]4[/sub]H[sub]2[/sub]O于1000 mL容量瓶中，再量取CaCl[sub]2[/sub]溶液20 mL，混合后用ddH[sub]2[/sub]O定容至1000 mL，这样得到0.1M，pH 6.9的缓冲溶液，冰箱下贮存。[b]3.2 玉米淀粉溶液[/b]玉米淀粉储备液：准确称取约1.0000g大米淀粉，加入50mL缓冲液，磁力搅拌数分钟后置于78℃左右水浴10分钟，于磁力搅拌器中搅拌自然冷却至室温，即为2%的淀粉溶液（20mg/mL）；玉米淀粉工作液：将储备液用缓冲溶液依次分别稀释至1.0-10mg/mL的工作液。[b]3.3 α-淀粉酶溶液[/b]准确称取α-淀粉酶固体粉末（23U/mg）40mg，用缓冲溶液定容至10 mL，即为4mg /mL的α-淀粉酶储备液，再依次稀释至0.2、0.1、0.05、0.04、0.025 mg /mL的α-淀粉酶工作液。[b]3.4 Acarbose标准溶液的配制[/b]0.1g acarbose定容到100 mL磷酸缓冲液中，得到1mg /mL贮备液，然后用磷酸缓冲溶液依次稀释成的工作液0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg /mL。[b]4.研究步骤[/b][/align][align=left][b]4.1 淀粉溶液的线性范围[/b] 由于本实验是对样品中浑浊度的变化来进行，而对浑浊度的测量不像紫外-可见分光光度计那样有理想的波长以及会出现明显的特征峰，根据文献大多数浑浊度的测量波长在620-700nm之间。为了确定玉米淀粉溶液的线性，我们选择玉米淀粉溶液的浓度在0-10mg/mL，波长选择660、700、800、900、970nm进行比较。使用玉米淀粉工作液0-10mg/mL，分别在660nm、700nm、800nm、900nm、970nm波长下测定其吸光度,重复测定3次。不同波长下淀粉溶液浓度与其OD值之间的线性关系图如下：[/align][align=left][img=,589,333]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810171420555396_7331_1613776_3.png!w589x333.jpg[/img][/align][align=left][table][tr][td][align=center]波长/nm[/align][/td][td][align=center]线性相关系数R[sup]2[/sup][/align][/td][td][align=center]线性斜率[/align][/td][td][align=center]空白OD值[/align][/td][td][align=center]LOD检测限[/align][/td][td][align=center]LOQ定量限[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]660[/align][/td][td][align=center]0.9910[/align][/td][td][align=center]0.0561[/align][/td][td][align=center]0.038±0.001[/align][/td][td][align=center]0.048[/align][/td][td][align=center]0.159[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]700[/align][/td][td][align=center]0.9917[/align][/td][td][align=center]0.0534[/align][/td][td][align=center]0.038±0.001[/align][/td][td][align=center]0.052[/align][/td][td][align=center]0.174[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]800[/align][/td][td][align=center]0.9922[/align][/td][td][align=center]0.0478[/align][/td][td][align=center]0.041±0.002[/align][/td][td][align=center]0.093[/align][/td][td][align=center]0.310[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]900[/align][/td][td][align=center]0.9923[/align][/td][td][align=center]0.0432[/align][/td][td][align=center]0.051±0.002[/align][/td][td][align=center]0.108[/align][/td][td][align=center]0.361[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]970[/align][/td][td][align=center]0.9923[/align][/td][td][align=center]0.0404[/align][/td][td][align=center]0.145±0.002[/align][/td][td][align=center]0.138[/align][/td][td][align=center]0.458[/align][/td][/tr][/table]从上图及上表中可以知道，玉米淀粉浓度在0-10mg/mL时的线性关系均较好，相关系数均在0.99以上。虽然线性相关系数较低，但在波长660nm下的线性斜率高于其他波长下的线性斜率，且LOD检测限与LOQ定量限均是最小，因此选择波长660nm作为测定波长。[/align][align=left][b]4.2 淀粉酶的活力[/b] 将20μL的缓冲溶液与20μL的不同浓度α-淀粉酶溶液混合均匀，37℃保温孵育15min，然后再加入60μL的2%淀粉溶液，快速振荡后在660nm迅速开始测定其吸光度值。以不同浓度的淀粉酶浓度0.4、0.2、0.1、0.05、0.04、0.025 mg /mL，底物选择20mg/mL的淀粉溶液进行试验，在660nm下测定其吸光度值的变化曲线。660nm下其吸光度值的衰退曲线图：[/align][align=left][img=,672,359]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810171423163167_2471_1613776_3.png!w672x359.jpg[/img][/align][align=left]从上图，在660nm波长下，不同淀粉酶浓度使淀粉溶液的吸光度下降，而且淀粉酶浓度越大，吸光度下降的越快。AUC与淀粉酶浓度成负相关关系，随着酶浓度的增大，曲线下面积AUC逐渐减小。[/align][align=left][b]4.3 抑制剂阿卡波糖活力[/b] 采用不同浓度的阿卡波糖浓度0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg /mL分别进行试验（n=3），淀粉溶液的浓度选择20mg/mL，淀粉酶浓度选择0.2mg /mL。通过试验，各个不同浓度的阿卡波糖抑制曲线图如下：[/align][align=left][img=,687,390]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810171426550249_8100_1613776_3.png!w687x390.jpg[/img][img=,668,320]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810171426580379_7253_1613776_3.png!w668x320.jpg[/img][/align][align=left]从上图看出，阿卡波糖浓度 在0.01-0.05 mg /mL之间与其曲线下净面积Net AUC的线性较好，相关系数R[sup]2[/sup]=0.9972。[/align][align=left][b]4.4 线性研究[/b] 以不同浓度的阿卡波糖0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07mg /mL分别进行试验，淀粉溶液的浓度选择20mg/mL，淀粉酶浓度选择0.2mg /mL。通过试验，各个不同浓度的阿卡波糖抑制曲线图如下：[/align][align=left][img=,690,359]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810171427557847_1976_1613776_3.png!w690x359.jpg[/img][/align][align=left]不同浓度的阿卡波糖与其曲线下净面积Net AUC的线性关系图如下（重复试验7次）：[/align][align=left][img=,690,359]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810171427580179_2403_1613776_3.png!w690x359.jpg[/img][/align][align=left][table][tr][td][align=center]n[/align][/td][td][align=center]1[/align][/td][td][align=center]2[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][td][align=center]4[/align][/td][td][align=center]5[/align][/td][td][align=center]6[/align][/td][td][align=center]7[/align][/td][td][align=center]av[/align][/td][td][align=center]SD[/align][/td][td][align=center]%RSD[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]R[sup]2[/sup][/align][/td][td][align=center]0.9909[/align][/td][td][align=center]0.9806[/align][/td][td][align=center]0.9788[/align][/td][td][align=center]0.9942[/align][/td][td][align=center]0.9934[/align][/td][td][align=center]0.991[/align][/td][td][align=center]0.9932[/align][/td][td][align=center]0.9889[/align][/td][td][align=center]0.0064[/align][/td][td][align=center]0.6477[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]SLOPE[/align][/td][td][align=center]4433.9[/align][/td][td][align=center]4850.1[/align][/td][td][align=center]4500[/align][/td][td][align=center]4219.3[/align][/td][td][align=center]5675.1[/align][/td][td][align=center]4468[/align][/td][td][align=center]5110.9[/align][/td][td][align=center]4751[/align][/td][td][align=center]503.27[/align][/td][td][align=center]10.593[/align][/td][/tr][/table]从上表看出，不同浓度的阿卡波糖与其曲线下净面积Net AUC之间的线性相关系数R[sup]2[/sup]在0.9889±0.0064之间，相对标准偏差0.65%；斜率在4751±503.3之间，相对标准偏差10.6%。[/align][align=left][b]4.5 提取溶剂的影响[/b]对提取溶剂（丙酮：乙醇：水的混合溶剂）进行研究，即以提取溶剂代替缓冲溶液进行试验，并与缓冲溶液进行比较。[/align][align=left][img=,609,340]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810171437196510_7149_1613776_3.png!w609x340.jpg[/img][/align][align=left]其中：BLK——20μL缓冲溶液+20μL淀粉酶+60μL淀粉；BLK1——20μL提取溶剂+20μL淀粉酶+60μL淀粉；Emp——40μL缓冲溶液+60μL淀粉；Emp1——40μL提取溶剂+60μL淀粉。[/align][align=left]通过对提取溶剂稀释10、100、1000、10000倍后再进行同样试验（如下图）：[/align][align=left][img=,657,362]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810171438035079_1244_1613776_3.png!w657x362.jpg[/img][/align][align=left]从图上看出，通过对提取溶剂稀释10、100、1000、10000倍后试验，基本对测定无影响。[/align][align=left][b][b]4.6 样品检测[/b][/b][/align][align=left][b] 将[/b]样品提取液代替阿卡波糖加入到淀粉酶溶液中，37℃保温孵育15min，然后再加入淀粉溶液，快速振荡后在660nm迅速开始测定。通过计算得出样品中的AE（阿卡波糖当量）。也可以通过比较抑制率IC50，来判断样品中的淀粉酶抑制率强弱。[/align][align=left][b]5.小结[/b] 通过以上对α-淀粉酶抑制率试验方法进行研究，实验表明，该方法适用于样品中α-淀粉酶抑制率的筛选。[/align][align=left]注意事项：[/align][align=left]1. 标准溶液或者样品与淀粉酶溶液混合后需在37℃保温孵育15min，再加入淀粉溶液；[/align][align=left]2. 加入淀粉溶液让后需要快速振荡后在660nm迅速开始测定；[/align][align=left][b]6.参考文献[/b]1. LEE WAH KOH, LIN LING WONG, YING YAN LOO, STEFAN KASAPIS, AND DEJIAN HUANG. J. Agric. Food Chem. 2010, 58, 148-1542. ALVIN ENG KIAT LOO AND DEJIAN HUANG. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 9805-98103. Elena Lo Piparo, Holger Scheib,Nathalie Frei, Gary Williamson, Martin Grigorov, and Chieh Jason Chou. J. Med. Chem. 2008, 51, 3555-35614. TOSHIRO MATSUI, TAKASHI TANAKA, SATOMI TAMURA, ASAMI TOSHIMA,KEI TAMAYA,YUJI MIYATA,KAZUNARI TANAKA, AND KIYOSHI MATSUMOTO. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 99-105[/align]