白细胞分类分析

肿瘤浸润白细胞( Tumor Infiltrating Leukocytes, TIL) 作为深入实体肿瘤内部的免疫细胞群体，在肿瘤-免疫学研究中占据重要地位。MACS Technology以卓越的技术致力于高质量TIL新发现，并助力肿瘤微环境研究。Agenda：肿瘤微环境与肿瘤浸润白细胞研究肿瘤浸润白细胞的目的肿瘤浸润白细胞研究的困难及挑战美天旎肿瘤浸润白细胞研究解决方案Q&A主讲人简介：田瑜博士，Ph.D., Product Manager, Miltenyi Biotec复旦大学神经生物学国家重点实验室取得博士学位，后就职于Prof. Brian Seed研究室从事单克隆抗体表达系统的研发工作。2016年进入生命科学产品营销领域，现任美天旎中国产品经理。直播时间：2020年3月26日（本周四）下午3：00—4：00报名方式：扫描上方二维码，即可报名参与！

喷雾干燥 & 冷冻干燥技术制备白细胞介素粉体研究趋化因子是一种小的(8-12 kDa)细胞因子，参与许多病理过程，因此是重要的靶点。它们通常由不同类型的细胞(如白细胞)分泌，并通过与同源 G 蛋白偶联受体的细胞表面结合来介导生物学效应。趋化因子配体和受体有 50 多种，根据其初级氨基酸序列的半胱氨酸残基排列进行分类和命名。趋化因子可用于(慢性)炎症性疾病、癌症和感染性疾病的治疗应用。目前，市场上有两种基于白介素的产品，即重组白介素-11预白介素(Neumega)和重组人白细胞介素-2醛白介素(Proleukin)。Neumega 是一种由大肠杆菌重组 DNA 技术产生的血小板生成生长因子，可静脉给药。皮下应用的 Proleukin 是一种淋巴因子，也是通过转基因大肠杆菌的重组 DNA 技术产生的。为了增加储存的稳定性、保持药物的生物活性，Neumega 和 Proleukin 都采用冷冻干燥的工艺，制成冻干粉制剂使用。虽然冷冻干燥（FD）是一种广泛使用的技术，具有多种优点，可以快速、温和干燥，但喷雾干燥(SD)可以缩短工艺周期，并可以在常压下进行加热处理。同时，颗粒的性质，如粒径、固体状态和残余水含量可以通过参数进行调节。这里必须指出的是，蛋白质的变性或/和展开也可能发生在 SD 过程中，SD 过程的放大是复杂和高成本的。SD 的另一个重要挑战是粉体回收率低于 100%，这对于高成本疗法和工艺开发来说是一个问题，特别是放大到最终设备上。对于白细胞介素，已经有了一些成功的冷冻干燥研究案例。然而，据我们所知，SD 作为一种替代方法尚未被研究过。这项工作的目的是开发一种 SD 工艺，使模型白介素以一种保留白介素结合亲和力和生物活性的方式干燥。为此，我们使用了模型白细胞介素，探索喷雾干燥工艺的潜在可行性，并对比分析冷冻干燥和喷雾干燥工艺对白细胞介素活性影响。1材料在磷酸盐缓冲盐水中提供野生型CXCL8（CXCL8，72个氨基酸，8.4kDa）、CXCL8的突变体（dnCXCL8，66个氨基酸，7.7kDa）等各种试剂。将蛋白质溶液用PBS稀释至最终蛋白质浓度为1mg/ml，即1% w/w。冷冻干燥机喷雾干燥仪：BUCHI B-90 HP▲ 步琦纳米喷雾干燥仪 B-90 HP2实验过程配方溶液分别采用如下冻干程序（表1）和喷干程序（表2）进行样品制备。干燥后的样品在 4-8℃ 的氩气干燥器中保存 12 周。并进行粉体的物性表征。表1，适用于所有配方中 FD 程序。箭头表示间隔内的压力或温度增减。间隔冻干工艺时间间隔[hh：mm]温度[℃] 压力[mbar]0速冻，放入小瓶～00:20-196atm.1冻结，平衡02:00-20atm.2初级干燥00:30↑ -15↓ 0.0453_01:00-150.0454_10:00↑ 00.0455_08:0000.0456二级干燥01:30↑ +200.0457_02:30+200.0458结束，封装小瓶_～+25atm.表2，SD 工艺参数及由此产生的过程变量。通过使用纯缓冲液进行测量来确定以 ml/min 为单位的喷射速率。实验过程中喷嘴温度升高，喷嘴温度是在 SD 过程结束时观察到的温度 。进口温度[℃]喷雾速率[%]空气流量[l/min] 粒度[μm]6030（～0.51ml/min）100±27.0过程变量出口温度[℃]压力[mbar]喷头温度[℃]29±131±152±23实验结果1、 通过激光衍射分析测定粒径SD 蛋白粉通过 HELOS 系统的激光衍射分析进行筛选。在 SD 后和第4周、第8周和第12周将粉末直接湿分散在甲苯中进行分析。通过对同一批次 SD 粉的三个样品进行测量，确定了 PSD 分析的标准误差。不分析 FD 粉末的粒度，因为冻干物通常是最终的药物剂型，没有对饼状进行研磨或破碎，只分析了 SD 粉。图1 通过激光衍射分析测定粉体粒径，在 10 次超声脉冲后进行测量，SD 粉末的 PSD 随储存时间的变化不大。除了在第0周分析的 SD dnCXCL8 喷雾粉末和在第8周分析的 SD HSA-dnCXCL8 外，所有干粉的跨度都小于 2.8。在测量这两个 PSD 时，一些较大的团块将分布分别向 517μm 和 129μm 的 x90 方向移动(图1b、图1c)，导致 PSD 变宽。2、 圆二色光谱测定结构利用圆二色谱(CD)对 SD 和 FD 后的蛋白质二级结构的变化进行评价，并将其与未处理蛋白质的光谱进行比较。CD 光谱在设备上记录，波长为 190-250nm，使用 1mm 石英比色皿，响应时间 4s。5 次扫描取平均值，并用 PBS 校正背景，计算平均残基椭圆率，并绘制不同曲线。由 图4 显示，经过 SD 和 FD 后的 CD 光谱显示只有轻微的结构变化。液体白细胞介素制剂在 90℃ 温度下热处理5分钟，SD 温度在 60℃ 温度下热处理 5 分钟，会产生轻微的沉淀，但结构保持完整 (图4A)。dnCXCL8 也出现类似的结果。SD 和 FD 均未引起二级结构的改变。即使加热蛋白质也未引起二级结构的变化(图4B)。虽然 HSA-dnCXCL8 具有更明确的α-螺旋结构，但 SD 和 FD 后没有变化。在 90℃ 热处理 5min 后二级结构发生了完全损失 (图4C)。3、 离液展开测定稳定性采用荧光光谱检测gdmhcl在0-6M范围内诱导展开，并在SD和FD后和储存3个月后测定蛋白质稳定性。将样品稀释至0.7μM，并在室温下平衡5min。CXCL8 和dnCXCL8 的激发波长为 280nm, HSA-dnCXCL8 的激发波长为 290nm。在 300-400nm 范围内测量所有3种蛋白的发射光谱，并将狭缝宽度设置为 5nm。蛋白质展开的特征是波长移位，并使用 Origin 2019b 的玻尔兹曼进行计算得到如下图谱。图5 显示，展开的过渡中点和 CXCL8 的相对协同性在很大程度上没有变化。对于 dnCXCL8，无法建立明确的过渡点。对于 FD HSA-dnCXCL8 也观察到了同样的情况。对于参考光谱和 FD 光谱（HSA-dnCXCL8 除外），显示了标准偏差，如图中的误差条所示。4、 趋化性测试：博伊登室测定为了检测 SD 和 FD 后以及储存三个月后的白细胞介素的活性，进行了趋化试验测定中性粒细胞的活化和迁移，预计 CXCL8 具有促迁移作用，而 dnCXCL8 和HSA-dnCXCL8 不应表现出任何中性粒细胞迁移激活。使用 NIS-Elements BR 3.2 软件进行细胞计数，计算每种情况下的平均值和标准偏差。上图显示储存 12 周后 SD CXCL8 的 CI 较对照显著增加 (图6a, p = 0.05)。SD 和 FD CXCL8 在中性粒细胞活化和迁移方面没有变化。对于 dnCXCL8, SD 和 FD 样本的 CI 与各自的参考 CI 相当。HSA-dnCXCL8 在 SD 后 (即W0) 的 CI 显著增加 (图6c, p = 0.04)。4结论本研究针对磷酸盐缓冲盐水配制的白细胞介素（未添加额外添加剂）采用 SD 和 FD 两种干燥方式分别进行深入评估。用纯缓冲液进行的 DoE 确定了一种最佳的 SD 工艺，在 60℃ 的干燥空气温度、100 L/min 的空气流速和 30% 的喷雾速率下具有较高产率，这表明即使是热不稳定的蛋白质也可以喷雾干燥。此外，SD 工艺比 FD 更快、更有效，理论上导致每分钟产量比 FD 高 130 倍（甚至考虑到 SD 的产量仅 63% 和 77% 之间）。FD 粉末呈现饼状结构，而 SD 粉末的粒度为 X5020μm。这为粒子工程提供了定义粒子特性的可能性，允许更广泛的应用。RM 是可比较的，同样二级结构没有改变，结合亲和力和活性保持至少 12 周，这些结果表明白细胞介素的 SD 是可行的。未来，将继续优化本研究中的工艺参数，并将其转移到具有工业型台式喷雾干燥器中，以更大规模地系统考察粉体产量和工艺时间，从而对 SD 进行全面评估，作为 FD 的替代方案，实现经济快捷高效的生产！5文献来源Comparing freeze drying and spray drying of interleukins using model protein CXCL8 and its variants

白细胞介素- 1（interlenkin 1，1L-1）的间接作用，可使内毒素引起机体发热。本篇文章介绍IL-1的受体分泌及调节介绍。IL-1的受体有两种：IL-1RⅠ和IL-1R Ⅱ。三种IL-1都能与受体结合，IL-1Ra与受体结合后不引发信号转导效应，但可抑制IL-1α和IL-1β同受体结合。上述两种受体常常表达在同一细胞中，但不同的细胞仅优势表达某一种受体。IL-1RⅠ是相对分子质量为80000的糖蛋白，人的基因位于2号染色体长臂上。主要表达在内皮细胞、平滑肌细胞、T细胞，肝细胞、成纤维细胞、角质细胞和表皮树突状细胞等。IL-1RⅠ高度糖基化，阻止糖基化会降低其生物学活性。IL-1R Ⅰ的胞质内肽链较长，并参与信号转导，与Toll受体的胞质区显著同源，故称为Toll/白细胞介素同源区域（Toll /in-terleukin-1 homologous region，TIR），缺乏酪氨酸激酶的活性。人IL-1R Ⅰ mRNA约5kb，编码569个氨基酸残基，细胞外320个氨基酸残基构成3个免疫球蛋白样功能域，跨膜区有19个氨基酸残基，其余230个氨基酸残基在胞质内。IL-1受体辅助蛋白（interleukin-1 receptor accessory protein，IL-1RAcP）其胞外和胞质结构域与IL-1RⅠ具有同源性，IL-1与IL-1RⅠ结合亲和力较低，可使构象发生改变，并被IL-1RAcP识别，参与受体复合物的形成，能够增强其亲和力，使之发挥生物学效应。IL-1RⅡ主要表达在B细胞、单核细胞和中性粒细胞中。IL-1R Ⅱ的 mRNA约1803bp，编码386个氨基酸残基，是相对分子质量为68000的糖蛋白。该蛋白质含有5个糖基化位点，经过N-糖苷酶处理使糖链分解后，相对分子质量为55000。IL-1RⅡ细胞外的332个氨基酸残基构成3个免疫球蛋白样功能域，其胞内只有很短的29个氨基酸残基，没有信号转导功能。用抗IL-1RⅡ抗体不能阻止IL-1的信号转导，用抗IL-1RⅡ抗体能够有效地阻止IL-1的信号转导。IL-1RⅡ是一个诱骗分子，可为IL-1的自身负反馈。将IL-1RⅡ的细胞外部分与IL-1RⅠ的胞质内部分嵌合构建的嵌合受体能够与IL-1结合并能转导信、号效应。可溶性IL-1受体：健康人和某些病理组织液中可检查到IL-1R Ⅰ和 IL-1RⅡ的胞外结构部分为可溶的IL-1受体，但其具体的生物学作用不是很清楚。IL-1的信号转导途径用图9-1表示。