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[b]使用声力研究蛋白去折叠[/b]单分子力谱(SMFS)技术是研究蛋白结构与蛋白去折叠中的生物力学性质的有力工具。SMFS能够为研究和药物开发提供有价值的信息。SMFS有助于揭示人类疾病病理的分子机制,而机制往往被认为与错误折叠的蛋白的形成和积聚有关,如阿茲海默症和帕金森氏症。然而现有的SMFS仪器缺少同时并行研究多个蛋白去折叠的功能,使得研究过程耗时很长。使用声波来对数以百计的生物分子施力并操控是非常理想的高通量研究方法。此案例中,声力谱学(AFS)是最新的用于研究蛋白去折叠的单分子操控方法。[img=,500,145]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808021031435408_23_981_3.png!w690x201.jpg[/img]1 AFS检测蛋白去折叠的图解。蛋白一端栓住玻璃表面,另一端拴住聚苯乙烯微球。[img=,400,238]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808021032257008_8827_981_3.png!w421x251.jpg[/img]2 对视野范围内被蛋白分子拴在玻璃表面的4.5 μm聚苯乙烯微球同时成像。物镜放大倍数为20x。AFS设备使用压电元件共振激发平面声阱穿过微流控芯片。共振波对与周围介质密度不同的微球施力,每个生物分子被单独地由微球拉伸(图1)。仪器可以实时并行操控视野范围内数以百计的微球,获得大量的数据以研究每个生物分子的随机与异质行为(图2)。在Yan Jie(NUS)的实验室的这项试点研究中,我们首次展示了AFS如何对蛋白施力并操控。实验对踝蛋白施力引发(去)折叠同时以高精确度记录蛋白的拉伸。踝蛋白属于机械敏感性大分子,在调控蛋白粘附于胞外基质中起作用。踝蛋白是细胞代谢过程和信号通路中的关键,并能够在力的作用下改变构象,在单分子生物物理学中备受关注。[img=,500,156]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808021033524578_3892_981_3.png!w679x212.jpg[/img]3 使用AFS得到的单个踝蛋白分子的去折叠曲线,力变化速率为1 pN/s。轨迹在500 Hz下获得(彩色点),并平衡至50 Hz(黑色线)。3a 单个踝蛋白多次拉伸的力-距离曲线。3b 单个拉伸循环的力-距离曲线。3c 图3b中分子的时间-距离曲线。在这项研究中,连接了DNA的踝蛋白拴在聚苯乙烯微球和玻璃表面。启动声波后形成平面声阱,连接了踝蛋白的微球受到朝向声阱的力。实验中通过调节声波的振幅来改变力的大小。逐渐增加力的大小使得蛋白的结构域按顺序去折叠。实验循环进行拉伸与收缩的过程(力变化速率为1 pN/s)并同时以nm级的分辨率检测每个蛋白的拉伸长度(图3)。通过力-距离曲线(图3a)可以观察到单个踝蛋白的去折叠循环。将单个蛋白的去折叠轨迹叠加即可检测到单个结构域去折叠的发生,研究人员可以得到蛋白结构和蛋白去折叠自由能图谱信息。AFS仪器产生的超声并不会损害生物分子的结构完整性,因此蛋白可以连续去折叠和再折叠长达数小时,并能够得到单个蛋白多次去折叠和再折叠的曲线。相比于其他SMFS方法经过多次拉伸和收缩之后对蛋白造成光学损伤或力学损伤使得实验被迫终止,AFS能够获得更多的信息。图3b: 单个力-距离曲线中截取一小段,表示一个拉伸过程。将力从15 pN增加至19 pN,可以观察到4个去折叠过程,与蛋白的4个结构域相符合,拉伸长度为30 nm至100 nm。AFS的高分辨率检测功能可以很清晰地区分去折叠过程。AFS在x,y方向精度为2 nm,在z方向精度为4 nm(频率为25 Hz),可以大幅提高(去)折叠研究的精密程度。图3c: 图3b中分子的18秒范围内的时间-距离曲线。AFS可以检测短至毫秒级至长达10小时以上的事件,用于研究蛋白的热力学和动力学。通过检测踝蛋白的去折叠步骤并记录连续的高分辨率的去折叠轨迹,可以得出AFS如何用于研究蛋白去折叠。研究蛋白(去)折叠的详细机制能够在生物物理和生物医药领域产生突破性发现。今后的蛋白折叠以及蛋白相互作用的研究中,AFS的多分子并行操控功能将发挥重要作用,用户可以同时并行检测大量的蛋白分子。用户可以获得大量的实验数据,在不影响分辨率的同时对蛋白的机械性质数据作出分析。
[b]研究多结构域蛋白阶段性去折叠[/b]很多生物大分子的功能与其构象和构象动力学密切相关,如蛋白质的生物功能需要其正确折叠成自然形态。错误折叠或者未折叠的蛋白会(部分)失活或者产生毒性,如错误折叠的蛋白与神经退行性疾病有关。研究蛋白如何正确折叠并改变构象以实现生物功能对理解其机制与疾病发生至关重要。单分子力谱(SMFS)是研究这些分子现象的理想工具,因为其具有独特的分离个体生物分子和实时观察构象变化及去折叠过程的功能。由于SMFS具有高敏感度和施加机械力的能力,可以直接操纵单个蛋白并通过测量其长度变化(亚nm级)观察构象改变。接下来我们使用LUMICKS开发的高分辨率光镊-荧光显微镜C-Trap演示了对钙调蛋白(CaM)的折叠过程的研究。[img=,500,110]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808021105519876_1986_981_3.png!w690x153.jpg[/img][img=,218,200]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808021106425366_604_981_3.png!w217x199.jpg[/img]1 多结构域蛋白的去折叠实验图解。具有3个结构域的蛋白通过DNA连接至两个被光所捕获的微球。2 通过改变光阱之间的距离可以对蛋白施力并检测断裂的发生。使用层流微流控和自动装载功能,N-端和C-端连接有DNA的单个CaM蛋白可被两个微球捕获(图1)。[img=,227,200]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808021108116955_1942_981_3.png!w220x193.jpg[/img]3 10 mM Ca2+浓度下CaM的力-拉伸距离(蓝色)和力-收缩距离(红色)。拉伸与收缩的速度为100 nm/s。微球直径为1.0 μm,光阱的刚度为0.284 pN/nm。[img=,500,161]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808021108223351_3734_981_3.png!w638x206.jpg[/img]4 10 mM Ca2+浓度下CaM的多个状态下的动态平衡。图为50 kHz(灰色)和200 kHz(红色)下记录的数据。在右侧直方图中可以看到两个清晰的峰即表现为蛋白最常处于的两个状态。第一个实验,在10 mM Ca2+条件下对CaM的机械拉伸与收缩行为进行了记录。首先对100 nm/s的速度下的拉伸与收缩的相关数据进行了记录(图3)。随着施加的力增加,可观察到两个去折叠的阶段,表现为力的突然下降,与两个螺旋-环-螺旋结构域的去折叠相符合。由此可以得出结论,基于C-Trap设备的力和距离的高分辨率(100 Hz时误差在0.2 pN以下和0.5nm以下),去折叠的发生可以用力谱的力-距离曲线来确定。这种测量非常适合用于比较正常蛋白与发生了改变或损伤的蛋白的折叠的相关数据。接下来研究光阱位置固定时CaM的折叠、去折叠的动态平衡,对蛋白长度的变化进行测量并确定中间态的转变(图4)。对CaM分子施加7.5 pN的力,可以观察到三种状态之间的波动,反映了螺旋-环-螺旋亚结构域的折叠和去折叠,波动的数据图像与之前的研究1,2相符(图4)。仪器所获得的稳定的高质量数据为蛋白的折叠和去折叠之间的动态转变的检测提供了大量有效的信息。通过这种方法可以对不同状态的驻留时间和转变动力学进行测量。这些信息使得我们对特定蛋白的折叠、去折叠过程产生进一步的了解。对折叠和去折叠的动力学以及构象改变的研究表现了一种突破性的生物学和生物物理学研究方法。使用C-Trap光镊-荧光技术可以观察到折叠和去折叠现象还有动态平衡,使得科研人员可以研究去折叠的中间态并获得蛋白的结构与功能信息。对蛋白折叠和构象的进一步研究仰仗于C-Trap的高敏感度和多通道荧光单分子FRET功能,通过检测FRET效率信号与力的波动的变化来进一步检测蛋白构象,可以得到蛋白的机械性质与结构之间的关系。[b][/b]
现在大多数实验室采取的培训方式估计都是一带一吧?&&&&&&&&&&&&&&&&&&&这样的模式是否会导致技术员水平停滞不前或者进展很慢呢?&&&&&&&&&&&&&&&&&&&技术员如果外出培训,参加什么样的培训比较合适呢?&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&你们的实验室有是怎么来培养技术员的呢?========精彩回复:1、想要提高检测人员的技术水平,要从“教”和“学”两方面入手。楼主只提到内部培训和外部培训,属于“教”,是外因。要提高检测人没的技术水平,“学”是内因,是更重要的影响因素。功夫花在“教”上,往往达不到预期效果,要想办法让检测人员主动去“学”。检测人员有了“学”的动力,即使“教”得不好,他会自己想办法提高。现在信息传递如此方便快捷,想学习什么东西很快就能找到资料,还有很多的专业论坛可以交流,“教”的问题基本上不用操心,楼主应该在“学”的问题上多下功夫。2、我从事这个玩具化学检测行业快三年了,当初也是同事带着我,那时候什么都不懂,师傅长师傅短的,还请师傅吃过饭,做为一个新手,你要很勤快啊,洗烧杯,干脏活,哈哈,现在想起来那时候就是个菜鸟,随着实验室人事走动频繁,慢慢我又从前处理调到仪器分析,我很勤奋,很好学,现在想起来我就觉得真得碰到问题很多,有时候自己找资料,上网找,自己找原因,我一直做的是无机,经历过审核,也参加过能力比对,包括LGC关于EN71-3的能力比对的和CNAS的能力比对,结果也是满意的。现在我也带徒弟了,我只想在这里给同行说。不管新手怎么样,你一定要有耐心,刚出来的大学生没什么社会经验,我们也经历过懵懂时期,可是每个人都有自己的梦想,我们不能刻薄的对待一个刚出来的学生,我们要给予他们的帮助。因为我们要宽容理性对待他们。不要把我们曾经遭受的强加给新手。不知道大家最近有没有看过《蚁族的奋斗》,我很欣赏剧中虎一帆和一个老总关于自己开发的游戏软件,老总出300万,他说不卖,他希望老总与他合作,做一个帮助支持大学生梦想创意的公司,因为每个人都有自己施展才华的天地。话讲的太多,可能感觉太强烈了!见外了!3、应该说检测技术对本机构起的作用如何,才能从体制上保证检测人员去学习技术的动力我所在实验室,中层以上的(包括部分中层人员)基本上是从事抽样工作上去的(完全没有从事过检测工作),负责人关心的是不出问题,提不提高也只是口头上说的多,无实际行动,具体检测人员水平在怎么样,也就和办公辅助人员,文员什么(包括新进人员)的待遇一样看到过本地的环保、疾控、农业实验室,基本也是这样,相对疾控好些我一好的医院朋友(业务水平很好),院长(正的)经过楼下时,故意大声骂院长,估计其他单位,早下岗回家去了4、人的能力和兴趣是存在区别的,企图使每个操作人员都达到同样的高水平难度不小。所以,应因材施教,根据不同类型操作人员的特点,提出一定的要求,例如,对于从事重复性操作的人员可以要求掌握基本操作和原理,能够胜任普通操作即可;而对于方法探索的人员,可以提供进修的机会,必要时还可以请仪器厂商到单位来施教或者合作。当然,人员的考察是管理者必须完成的功课,要让大家明白机会都是均等的,你能够从“初级”变成为“高级”,是你自身努力的结果,只有这样才能形成一种良好的氛围,这其中自然要与奖励制度相结合。5、技术水平的提高不是靠师傅带就带的出来的。你能教的只能是基础和规定的东西。这些东西如果只是用来做实验,足够了。但是如果想培养一个技术能独当一面,并且能有发展前景的人员,主要还是要看这个人是不是想学,是不是会学。当然这也需要带的人能给其一定的空间和传授一种比较好的学习方法。外部培训一般企业不选择的原因主要是钱的问题。其实外部交流有很多形式,论坛,网络资料,网络讲座都可以视为外部培训。想学东西主要是要看自己的。