混渗透系定仪

大家好，本周为大家分享一篇发表在Angew. Chem. Int. Ed.上的文章，A Membrane-Permeable and Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) - Enrichable Cross-Linking Reagent to Advance In Vivo Cross-Linking Mass Spectrometry，该文章的通讯作者是德国莱布尼茨分子药理学研究所的Fan Liu教授。交联质谱 (XL-MS) 已被用于在全蛋白质组范围内表征蛋白质的结构和蛋白间相互作用。目前，由于能够穿透完整细胞的交联试剂和富集交联肽的策略的缺乏，体内交联质谱研究的深度远远落后于细胞裂解液的现有应用。为了解决以上限制，本文开发了一种含膦酸盐的交联剂-tBu PhoX，它能够有效地渗透各种生物膜，并且可以通过常规的固定化金属离子亲和色谱 (IMAC) 进行稳定富集。 文章建立了一个基于 tBu-PhoX 的体内 XL-MS 分析流程，在完整的人类细胞中实现了较高的交联识别数目，并大大缩短了分析时间。总的来说，本文开发的交联剂和 XL-MS 分析流程为生命系统的全面交联质谱表征铺平了道路。细胞蛋白质组通过广泛的非共价相互作用网络进行组织，表征蛋白质-蛋白质相互作用 (PPIs) 对于了解细胞的调节机制至关重要。交联质谱 (XL-MS) 是系统研究细胞 PPIs 的一种强有力的方法，在 XL-MS 中，天然蛋白质接触通过交联剂共价捕获，交联剂是一种由间隔臂和两个对特定氨基酸侧链具有反应性的官能团组成的有机小分子，交联样品经过蛋白酶水解后，可以通过基于质谱的肽测序来定位氨基酸之间的交联。由于交联剂具有确定的最大长度，检测到的交联揭示了蛋白质内部或蛋白质之间的氨基酸的最大距离。以上这些信息提供了对蛋白质构象、结构和相互作用网络的见解。虽然最初仅限于纯化的蛋白质组装，但如今 XL-MS 已经可以应用于复杂的生物系统——这是通过开发先进的交联搜索引擎、样品制备策略和交联剂设计而实现的。特别是，已进行的几项全蛋白质组范围的 XL-MS 研究表明，可以通过使用可富集的交联剂来改进交联产物的鉴定，例如，通过添加生物素或叠氮化物/炔烃标记，使得消化混合物中的交联肽段能够基于亲和纯化或点击化学富集。最近，一种基于膦酸的交联剂 PhoX 被引入作为现有生物素或叠氮化物/炔烃标记试剂的高效和特异性替代品。PhoX 可通过固定化金属离子亲和色谱 (IMAC) 实现交联富集，这是一种非常快速和稳健的富集策略。 然而，尽管 PhoX 已被证明可用于从细胞裂解液中进行交联鉴定，但它无法渗透细胞膜，因此不适合体内的 XL-MS检测。基于以上讨论，本文开发了交联剂 tBu-PhoX ，其中，膦酸羟基被叔丁基保护以掩盖负电荷（图 1）。为了检测 tBu-PhoX 的膜通透性，文章交联了各种膜封闭的生物系统，包括人 HEK293T 细胞、从小鼠心脏分离的线粒体和革兰氏阳性枯草芽孢杆菌，并在 SDS-PAGE 上监测了蛋白质条带的变化（图 2）。在SDS-PAGE中，观察到在交联剂浓度为0.5和1.0mM时，蛋白质向更高分子量的浓度依赖性迁移，这表明了有效的膜渗透和交联。相比之下，将 PhoX 应用于完整的 HEK293T 细胞将产生与非交联对照相同的条带模式。图1 tBu-PhoX交联剂图2 PhoX或tBu-PhoX交联HEK293T细胞的SDS-PAGE在证明了 tBu-PhoX 可渗透各种生物膜系统后，文章接下来开发了一种基于 tBu-PhoX 的体内 XL-MS 工作流程，相比于之前的全蛋白质组 XL-MS 策略，该工作流程提高了样品处理和交联富集的速度和效率（图 3）。首先，按照标准蛋白质消化方案将交联蛋白质消化成肽；其次，使用 IMAC 珠对消化混合物进行预清除步骤以去除内源性修饰（特别是磷酸化）；第三，预清除的消化混合物（从 IMAC 流出）在稀释三氟乙酸 (TFA) 溶液中孵育以去除叔丁基并暴露膦酸基团以进行二次 IMAC 富集。第四，使用标准 IMAC 程序丰富交联产物，最后通过 LC-MS 分析以进行交联产物鉴定。图3 与tBu-PhoX进行体内交联和后续样品处理的工作流程接下来，文章优化了体内 XL-MS 工作流程的几个分析参数，以最大限度地提高交联检测的效率。首先，通过使用 IMAC 珠预清除评估了去除磷酸肽的效率；之后，使用 tBu-PhoX 交联完整的 HEK293T 细胞，经酶切成肽后，并应用预清除 IMAC 步骤去除内源性磷酸肽。在去保护步骤之后，利用 IMAC 富集交联，并通过单次 120 min LC-MS 运行测量富集的样品。通过测量 IMAC 洗脱液中磷酸肽和交联产物的数量，发现第二个 IMAC 中只有数百条磷酸肽，而预清除 IMAC 中有 4,128 条磷酸肽，这突出了通过预清除 IMAC 步骤去除磷酸肽的效率。此外，与单阶段 IMAC 结果相比，使用预清除 IMAC 的工作流程鉴定了 22% 以上的交联（1165 对 952 交联），证明了该两阶段工作流程去除干扰修饰肽的好处（图 4A）。其次，文章在肽水平上研究了膦酸盐去保护的功效。使用 tBu-PhoX 制备了体内交联的 HEK293T 样品，并分析了在不同的酸度（TFA 浓度）和孵育时间下，去保护后交联的数量如何变化。结果显示，不同浓度的 TFA 下获得了相似数量的交联。为简化处理（即在接下来的IMAC富集步骤中保持相对较低的样品体积），选择 0.5% TFA 的去保护条件，持续两个小时（图 4B，C）。第三，文章测试了 Orbitrap Tribrid 质谱仪的不同采集参数如何影响交联识别，即在高场非对称波形离子迁移率质谱法 (FAIMS) 中应用的电荷态选择和补偿电压 (CVs)。当考虑电荷状态 +3 和更高时，确定了最多数量的 tBu-PhoX 交联肽（图 4D）。图4 样品处理和LC-MS参数的优化文章将优化参数后的体内 XL-MS 工作流程应用于完整的 HEK293T 细胞。使用 180 min的 LC 梯度和优化后的分析参数，文章从体内 tBu-PhoX 交联的 HEK293T 细胞中获得了 9,547 个交联（图 5A）。基因本体分析表明，交联蛋白参与了广泛的分子功能、生物过程和细胞成分，表明 tBu-PhoX 可以揭示所有细胞区域的 PPIs（图 5A）。另外，文章还考察了完整细胞的体内 XL-MS 是否捕获了与细胞裂解液的 XL-MS 不同的 PPIs。为了验证这一点，从 HEK293T 细胞中制备 tBu-PhoX 交联裂解液，并使用与体内 XL-MS 实验相同的工作流程处理样品。 结果显示，从五个 SEC 部分中确定了 9,393 个交联。这表明 tBu-PhoX 允许以类似的效率进行裂解和体内 XL-MS。比较本文的体内和裂解数据表明，在体内 XL-MS 实验中，蛋白质间交联的数量更高，从而产生了更加相互关联的 PPI 网络（图 5B，C）。这种效应可以通过细胞环境的拥挤来解释，其中蛋白质紧密堆积并参与多种相互作用，这些相互作用被细胞裂解和稀释部分破坏。文章在 8 种选定蛋白质复合物的已知 3D 结构上可视化了 145 个体内检测到的交联（图 5C），另外，还观察到 96.6% 的交联在 35 Å 的最大距离限制内（图 5D），表明此 XL-MS 工作流程对内源性蛋白质复合物的体内结构分析的适用性。最后，文章比较了 tBu-PhoX 与 PhoX 在表征细胞裂解液的 PPI 网络方面的性能。使用与上述 tBu-PhoX 裂解液交联实验相同的交联条件从 HEK293T 细胞制备 PhoX 交联裂解液。为了去除内源性磷酸肽，在单阶段 IMAC 富集之前，用碱性磷酸酶处理消化的肽两小时。使用与 tBu-PhoX 相同的 LC-MS 方法进行 LC-MS 分析。该实验产生了 2,117 个交联，与使用 tBu-PhoX 识别的交联数量（1,942 个交联）相比略高。然而，基于 PhoX 的 XL-MS 流程需要更长的样品制备时间，因为需要进行碱性磷酸酶再处理和之后的额外脱盐步骤。行体内交联综上所述，本文开发并应用了一种新型的、可富集的、用于体内 XL-MS 的膜渗透交联剂 tBu-PhoX。在广泛使用的交联条件下（交联剂浓度为 1-5 mM），tBu-PhoX能够有效地穿透各种生物膜，为完整的细胞器和活细胞提供交联的机会。tBu-PhoX上的叔丁基基团使得高效的两阶段IMAC样品制备方案成为可能；首先，使交联剂对 IMAC 呈惰性，以促进基于 IMAC 快速而彻底地提取不需要的磷酸化肽，然后，通过去除叔丁基暴露膦酸基团，从而有效地二次 IMAC 富集交联剂修饰的肽。通过随后的 SEC 分馏，可以进一步富集交联肽段以进行 LC-MS 分析。XL-MS 在表征生命系统中的蛋白质结构和相互作用方面发挥着越来越重要的作用。为了促进这一发展，迫切需要有效的体内 XL-MS 方法。文章报告的体内 XL-MS 工作流程满足了这一需求，提供了与之前基于裂解液的 XL-MS 研究类似的交联识别能力，但需要的测量时间不到之前报告的十分之一。这一结果突出表明，本文开发并应用的 tBu-PhoX 交联剂和集成样品制备流程为推进体内相互作用组学和结构生物学提供了一种非常有前景的化学方法。

德国ART 是全球唯一能采用定转子技术达到纳米级别的品牌，极大满足制药，化妆品，精细化工等行业的高精需求。那么德国ART 是如何利用本创新技术来改善化妆品活性剂的皮肢渗透性的呢？背景：常规渗透促进剂会损坏皮肤，不能满足FDA要求皮肤是身体的最外层，它保护身体免受病原体等外界因素的影响，及避免身体过多水份流失，等等。 因此， 健康的皮肤是化学品渗透的有效屏障。 而化妆品的活性剂化学性质不稳定，难溶，低渗透，低生物活性。所以现代化妆品配方的目的，是研究如何将活性剂送至皮肤内。改善活性剂输送的一个方法是使用渗透促进剂，如：乙醇。这些渗透改善剂的原理是：他们与皮肤屏障相互作用，进而改变皮肤的结构。 这种方法是有效的，但是会损坏皮肤，因此对化妆护理产品我们应该尽量避免这种方法。按照FDA的要求，现代化妆品要在不改变人的身体结构的情况下为我们清洁皮肤，美化个人形象。能改善活性剂的皮肤渗透性，而不损坏皮肤， 如何实现？ -- 使用纳米载体！能改善活性剂的皮肤渗透性，而不损坏皮肤，甚至有护理皮肤的特性， 如何实现？纳米载体是最好的选择！由上二图可以看出，纳米颗粒的载体形式，更容易实现皮肤渗透，纳米载体指亚微米级，及纳米级颗粒。纳米载体的特征为：1）体积小；2）目标直接针对皮肤毛囊。这是化妆品乃至药品领域的最新概念。 例如：脂质体，纳米乳剂，脂质纳米颗粒(SLN and NLC)，及纳米结晶体(smartCrystals, ARTcrystals)。这些载体的特性是不同的，如：脂质体最适合亲水的活性剂的输送，纳米乳剂和脂质纳米颗粒最适合作亲脂性的活性剂载体，纳米结晶体最适合难溶性化合物。 如何生产纳米载体和纳米化妆品？ -- 使用ART纳米技术对这一创新理念的应用，最重要的一点是如何使大规模生产该配方成为可能，并能同时节约时间和成本。化妆品的纳米载体可以使用高压分散均质机（HPH）和球磨机（BM）来生产。但是高压均质机和球磨机体积大，能耗高，处理时间长，投资大。而德国ART-MICCRA 的最新的高精度的定转子系统设备对生产化妆品的纳米载体特别有效。D-27是一个可以24小时连续工作的在线分散系统。 最新技术的水冷电机，利用其超高转速（36，000RPM），及强大的电机功率（2，700W），与超高精度的定转子配合，达到全球独一无二的纳米处理效果， 而只有63分贝的低噪音。高效率的处理设备，将使用纳米载体以改善活性剂的皮肤渗透性成为可能。这不仅适用于高价格的奢侈化妆品，同时也适用于一般护理产品。 如果将纳米载体与化妆品霜剂再进行分散乳化， 即可获得纳米化妆品。综上所述， 以前皮肤不能有效使用的难溶性或生物活性剂， 如：黄酮类化合物，现在因为纳米结晶体技术，让化妆品活性剂迈入了新的台阶； 而ART &ndash MICCRA 也让化妆品纳米载体的经济而高效的生产进入了一个新的里程碑。（本文编辑，摘自德国Cornelia Keck博士的文章。Cornelia Keck博士是University of Appplied Sciences Kaiserslautern大学药理学和药剂学教授；德国ART公司终身科学顾问） 关于语特 和 英国Bibby / 德国ART / 德国CAT ( http://bibbyyt.instrument.com.cn. )广州语特仪器科技有限公司专注于搅拌器/分散乳化机等实验室样品制备等通用仪器， 熔点仪/光度计等分析仪器，以及PCR等生命科学仪器。 作为英国比比（Bibby ）在中国南方的首代，广东，广西，四川，重庆，云南，海南，贵州和西藏是我司的服务范围。语特公司也是德国ART， 德国CAT 在中国的首代。英国BIBBY 成立于上个世纪50年代，作为英国最大的实验室科学仪器生产商，世界上拥有最广泛产品系列的实验室仪器制造商之一, 其向全球提供的品牌产品以高品质和高操作性能而著称. 旗下有4个子品牌：Stuart，Techne，Jenway，Electrothermal.l Stuart： 专注于样品前处理等通用实验室仪器，包括: 熔点仪, 菌落计数器, 搅拌器, 混匀器，摇床, 纯水蒸馏器系列；l Techne： 专注于分子生物学研究设备(基因扩增仪和杂交箱), 以及温度控制产品系列(包括水浴和干浴) ；l Jenway： 是紫外/分光光度计, 火焰光度计，色度计等分析仪器的专家；l Electrothermal: 作为有70多年历史的BIBBY的新成员，全球领先的科学仪器提供者，提供电加热套,平行反应设备, 凯氏定氮设备, 电子本生灯系列。其平行反应设备是全球市场领导者。 德国ART 成立于上个世纪，是德国乃至全球最专业的分散乳化专家。 其顶级分散乳化产品从实验室仪器，中试产品到工业设备， 分散头种类极多，可满足客户各类需求；应用领域覆盖了化工，化妆品，制药，食品，环保等各大领域。德国CAT 成立于上个世纪50年代，是德国样品制备仪器方面的专家之一。其搅拌器，从手持式，教学用，到科研通用型，高粘度型，应有尽有，是CAT的代表产品线； 而今又由普通电子马达走向无刷马达， 引领着搅拌器的研发潮流。

导读：北京明尼克分析仪器设备中心在2020年度品牌直播活动中播出了对公司技术总监李高沪先生的特别专访，节目中李工为广大观众深入解读了明尼克近年来引入的国际高端产品，回答了行业普遍关心的热点问题，也对相关分析和应用的宝贵经验作了分享，受到业界的广泛关注和积极评价。在首期钝化产品访谈实录中，我们已经领略到节目内容的精彩、专业，本期让我们共同回顾渗透管产品直播的精彩实录。 访谈地点：明尼克海淀云中心办公区 北京明尼克分析仪器设备中心技术总监：李高沪 各位朋友大家好，我是北京明尼克分析仪器设备中心市场部的代洪军，时间过得真快，上月底我们的钝化产品访谈直播还历历在目，此刻在明尼克海淀云中心办公区色谱应用中心里仪表网专场直播又一次如约而至。今天和大家共同分享一种国际上流行的渗透管产品，明尼克引进的VICI渗透管技术产品同样在分析界广泛应用并得到众多客户的高度肯定和信赖。我们知道，国家越来越重视实验室环境及人员安全，大家对实验室仪器安全与设备的准确性、经济性、快捷性越来越重视，如何提高安全、降低运输时间和各项成本并能解决一些气体不能配置的困扰，如何使您的实验室高大上并能解决问题，本期直播给您优质的解决方案。VICI渗透管及附属装置可谓一次性投入、受益终生，核算起来非常经济又确保实验室的人员、财产安全，请您千万不要错过本期节目。今天非常荣幸我们再次邀请到色谱界专业人士、北京明尼克公司技术总监李高沪先生，请李工就气体分析中可替代传统气瓶的渗透管类产品相关问题进行解答，首先请李工对明尼克渗透管产品总体情况作一下介绍---李工：好的，观众朋友们，大家好，有幸再次来到中国仪表网与大家见面，北京明尼克渗透管产品来自于美国VICI品牌，明尼克是VICI中国区首席代理，我们知道VICI阀类产品世界驰名，用于渗透管的动态标准气体发生器、气体纯化器、色谱检测器等产品同样在业界表现不俗，这些产品作为明尼克的高端仪器同步服务于全国分析行业客户。 明尼克公司总经理薛海玲女士及技术总监李高沪先生与VICI公司总经理Franco Cozzio先生在美国PITTCON展会合影 代洪军：谢谢李工，一些观众可能还不了解渗透管这类产品，您能给大家简单介绍一下原理和应用吗？ 明尼克 VICI Dynacal 渗透管 李工：渗透管是在一个小尺寸惰性可渗透的容器中装有两相间平衡的纯化学物质，可以是气液相，也可以是气固相，在一个恒定温度下渗透管内的物质以一定的速率通过渗透部位向外渗透。渗透管插入载气流中，产生试验所需的浓度，用来标定气体分析器系统，也用于危险气体报警测试、材料和生物系统的长期研究，以及任何需要稳定痕量浓度的应用场合。代洪军：好的，那么渗透管都有哪些物质成分呢？李工：目前VICI能作的渗透管有大概有五百种成分可以用作渗透管的材料，比如常用的有汞、甲醛、氨、硫化物、磷化氢、一氧化碳、一氧化氮和甲烷及苯系物等等，涵盖了实验室分析用的众多无机和有机组分，具体可关注明尼克官网及各合作网站的相关产品信息。 明尼克 VICI 渗透管常用组分 代洪军：有观众咨询渗透管的渗透速率有什么标准吗，请您介绍一下。李工：渗透管和动态标准气体发生器联用，通过测定已知温度下已知时段内重量的减少值来计算渗透速率建立一个分析的基准点，VICI渗透管的渗透速率可以溯源NIST，也就是美国国家标准技术研究院，相当于国内的中国计量院的方法来确定，量值来源权威可靠、可溯源。代洪军：好的，上面说到动态标准气体发生器，VICI有相关产品吗？李工：VICI是有相关产品的，我们知道渗透管和动态标准气体发生器联合使用产生标准气体的，VICI同样提供各种型号的气体发生器，从最基本的Model 150型230、340、345型到Model 505型都可以精确提供ppb到ppm浓度范围气体，产品一如VICI阀类产品具有可靠的精确度和数据的重复性。 VICI Model 505型动态标准气体发生器 代洪军：谢谢李工，如开场所说，非常多的观众关心使用渗透管和动态标准气体发生器与使用气瓶相比有哪些优势，您能再给大家系统介绍一下吗？李工：渗透管的优点主要有，在惰性介质中使用的是纯物质，所以浓度精度高，建立的标准易于溯源NIST，能得到EPA和ASTM认可，改变和增加单个成分，十分方便，浓度范围宽，改变温度和稀释流量可以方便改变浓度范围。瓶装气的缺点大概有这几点，在另一种介质中达到平衡，多组分和浓度范围宽需要大量的气瓶，会占用珍惜的实验室面积，气瓶用的时间长的话还可以使标准或浓度下降，很多活性物质不能使用气瓶。总之，VICI提供的渗透管和渗透装置无论从安全性、精确性、经济性、便捷度方面与传统钢瓶相比都大占先机。代洪军：那么请您再介绍一下VICI渗透管的主要类型？李工：VICI渗透管主要分为两大类，主要分为Dynacal和G-Cal两大系列，Dynacal主要用在恒温控制的环境下工作，分为管状渗透管、长寿命渗透管、薄膜渗透膜渗透管三种型号，渗透速率可在5ng/min到50000ng/min范围内变动；G-Cal渗透管是美国专利产品，具有极低的温度敏感性，在室外用温度变化影响不大，特别适用于现场条件下的分析，同样可以得到一定浓度的ppm或ppb级的混合气体。 明尼克 VICI G-Cal 渗透管 代洪军：好的，谢谢李工的介绍，那么渗透管内填充液减少后会影响渗透速率吗？李工：不会的，只要渗透管中哪怕还有一点液体就存在着气液平衡，渗透腔中就会保持恒定的蒸气压。代洪军：渗透速率会随着外部压力的变化而变化吗？李工：我们说不会，海拔高度和大气压力的变化不会使渗透速率发生变化，挥发性化学成分在渗透管或渗透膜表面的分压力被认为是0，当渗透时有尾气吹扫时这个假设是成立的，渗透率是化学填料从渗透管内腔扩散至外壁时压力梯度的函数，在压力梯度变化到可发现渗透明显改变之前渗透管附近会产生相对高浓度的气体。代洪军：还有观众非常关心渗透管的安装方向会对渗透速率产生影响吗？李工：渗透管的安装方向不会对渗透率产生影响，温度是影响化学物质在渗透膜内的蒸气压和溶解性的全部因素，和液体与管内壁接触面的大小无关。代洪军：谢谢李工，还有观众咨询，动态标准气体发生器与渗透管是如何配合的，请您再给大家介绍一下。李工：渗透管在使用时放在动态标准气体发生器的渗透腔内，载气以一个恒定流量经由渗透腔，渗透腔的温度控制了标准气体从渗透管向外渗透的渗透率，保证了仪器的精度，VICI同样提供相应的动态标准气体发生器产品，Model 505型有两个独立温控的渗透腔，每个腔体放置一至多支渗透管可产生多种组分的混合标气，温度控制精度可达0.01摄氏度，渗透出的气体随着载气稀释可以通过质量流量计来控制，精度可以达到±1%，从而得到不同浓度的标准气体。 VICI Model 500型动态标准气体发生器 代洪军：刚刚看到还有客户比较关心产品的货期情况，您给介绍一下？李工：常用的渗透管，如汞、甲醛、硫化物、苯系物都属于常用产品，一般货期4-6周，不太常用渗透管货期略长，VICI原装动态标准发生器货期一般8周以上。代洪军：非常感谢李工的精彩解答，今天可谓干货满满，由于时间关系，本次采访就到这里，感谢直播平台的大力支持，谢谢大家的关注和分享，也请您关注明尼克同期其他的直播节目，谢谢大家，再见！ 附注：视频回放二维码： （直播时间：2020年8月18日）