核酸提取(核酸的分离与纯化)主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开,但在分离核酸时,应保证核酸分子一级结构的完整性,并排除其他分子污染。核酸提取方法一般包括细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤,而每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。操作过程中首先通过物理、化学或酶解作用裂解细胞,使核酸释放出来,并去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂肪类等生物大分子的过程。在此基础上,沉淀核酸、去除盐类和有机试剂等杂质,从而得到纯化的核酸。核酸提取仪是应用配套的核酸提取试剂来自动完成样本核酸的提取工作的仪器。在传统的手工核酸提取过程中通常采用离心澄清的方法,操作时费时费力。近年来,出现了磁珠分离技术,利用磁珠在一定条件下对核酸具有很强亲和力的特点,吸附核酸。当条件改变时,磁珠又可以与其吸附的核酸分离,从而得到纯化的核酸。这种方法简便、高效、易于操作,是目前核酸提取仪采用的主要方法。具体来说,磁珠法提取核酸是通过细胞裂解液裂解细胞,从细胞中游离出来的核酸分子被特异的吸附到磁性颗粒表面,而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。反应一定时间之后,再在磁场作用下,使磁性颗粒与液体分开,回收颗粒(即磁珠-DNA 混合物),再用洗脱液洗脱即可以得到纯净的DNA。磁珠法不需要离心、不需要加入多种试剂,操作简单,符合核酸自动化提取要求,是未来核酸纯化方法发展的一个重要方向。
[img=,257,264]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/06/201706301258_01_3194653_3.png[/img]Aurora全自动核酸提取系统采用专利SCODA( Synchro-nous Coefficient of Drag Alteration)电泳DNA操作技术,从具有挑战性的样品中浓缩和纯化DNA.SCODA根据DNA的物理特性选取长的带电聚合物(而非通过其其化学性质或化合物亲合力分离DNA).因此,系统可提供卓越的污染物排斥.此外,Aurora系统可从单一样本中提取高达100倍浓度,从几百分子到100微克的DNA.可高效稳定地纯化提取核酸和蛋白,尤其适合珍贵样品、低生物质低丰度样品、土壤、环境等各类型难提取样品的提取. 产品特征电泳纯化高分子量DNA的提取低生物量和严重抑制样品处理样品成本为零,适合低通量样品处理宏基因组学/NGS/光学测绘/单分子测序应用应用领域生命科学研究土壤与环境农业生物技术法医学 技术参数样品处理时间:2-4小时,样品盐度60%DNA / RNA片段大小: 500 nt RNA,300 bp - 50 kb DNA,可扩展到1Mb污染物抑制: 10-50,000X2产量: 60 uL 该系统避免了研磨、匀浆等传统方法的费力、耗时、低效等诸多缺点,通过非机械过程直接从环境样品,细胞提取物,或带电泳插头的琼脂糖中回收完整的高纯大片段DNA。DNA提取缓冲液、DNA凝胶柱可用于进行后续的克隆,归档,光学标测,或PCR、测序等遗传分析。系统可从至多5毫升稀释裂解液或洗出液中提取核酸,回收低生物质样品包括沉积物,土壤,苔原,和水样中的微量核酸。系统还可净化商业试剂盒受污染洗脱液,提高样品利用率,并无缝对接到现有的工作流程中.
核酸提取仪有两种分类分类方式,一种是按用途进行分类,另一种是按照应用试剂的不同进行分类。(1)按照用途分类:一类是自动液体工作站,自动液体工作站是功能非常强大的设备,液体分液、吸液等自动完成,甚至可以整合扩展、检测等仪器设备,实现标本提取、扩增、检测全自动化。提取核酸只是其功能的一个应用,不太适合常规实验室提取核酸,一般都应用在单一类标本并且一次提取标本量非常大(至少96个,一般几百个)的实验需求上。自动工作站的平台建立及平台的运作,需要比较大的资金。另一类是小型的自动化仪器,小型的自动化仪器是通过运行结构的特殊设计来达到自动提取核酸的目的,可以在任何实验室得到应用,最近几年有很多机型陆续投放市场。(2)根据应用的试剂不同分类:一类是应用磁珠法试剂的仪器,另一类是应用离心柱法试剂的仪器。应用磁珠法的自动核酸提取仪操作简便,容易自动化,是目前市场上的主流,如QAGEN、Lab-Aid 820等仪器。与传统的手工操作相比核酸提取仪的优势:核酸提取仪一般具有以下的特点:(1) 无交叉污染:仪器部件未接触到生物学样本;(2) 自动化系统:每次提取工作,操作者只需要做好安装工作,布置好孔板(提供提取所需要的试剂).提取整个过程都不需要人为的帮助,仪器自动完成;(3)提取控制:在提取过程中,如果操作者需要,该系统允许您对提取过程进行控制。
你们在对样本中的核酸提取时,都使用的什么仪器去进行的提取?
想买个核酸提取仪,做动植物组织DNA荧光定量PCR检测,有什么好的仪器,国产进口都可以,请用过的推荐下。谢谢
单位计划采购自动核酸提取仪,听几个进口厂家推介了,得出来的观点相悖,特求助高人指点一二。到底是滤膜法好还是磁珠法好?是否为真正的全自动怎样去区分?高通量与否怎样鉴定?
出售赛默飞核酸提取仪kingfisher prime,仪器未使用过。开机正常。有意义私聊。[img=,690,920]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/11/202211120846072310_5286_4092743_3.png[/img]
问题描述:核酸提取方式主要有哪些?有何差异?解答:[align=left][font=宋体][color=black]目前主流的核酸提取方法有煮沸裂解法、苯酚氯仿抽提法、离心柱法、磁珠法,接下来介绍这几个方法的原理、优劣势及适用场景。[/color][/font][/align][align=left][font=宋体][color=black]([/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]1[/color][/font][font=宋体][color=black])煮沸裂解法:原理是通过加热使细胞膜破裂,充分暴露核酸,核酸可溶解于上层水溶液中,通过高速离心沉淀变性蛋白质和细胞碎片,上清液即为核酸粗提液。此方法的操作相对简单,成本低,但由于是粗提,成分比较复杂,有时可能带来一定的体系干扰或者裂解不充分的情况,一般用于细菌定性鉴定时使用。[/color][/font][/align][align=left][font=宋体][color=black]([/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]2[/color][/font][font=宋体][color=black])苯酚氯仿抽提法:原理是苯酚和氯仿抽提除去蛋白和多糖类杂质,获得相对较为纯净的基因组核酸。成本比较低廉。缺点是试剂毒性较大,长时间操作对人员健康有较大影响。试剂需要自行配制,批次间差异显著。提取效率相对较低,不适宜少量或者微量操作。一般用于大量核酸样本的抽提。[/color][/font][/align][align=left][font=宋体][color=black]([/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]3[/color][/font][font=宋体][color=black])离心柱法:原理是利用裂解液促使细胞破碎,使细胞中的核酸释放出来,利用柱子中的载体吸附提纯核酸。它的优点是比传统的酚氯法提取纯度高、毒性低,有利于[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]RNA[/color][/font][font=宋体][color=black]保护,而且能进行微量操作,价格较低。缺点是不便于高通量、自动化操作,对实验室设备和人员的操作技能要求较高。目前应用广泛,常用于细菌、病毒、动物组织等多种样本的核酸提取[/color][/font][sup][font='Times New Roman','serif'][color=black][13][/color][/font][/sup][font=宋体][color=black]。[/color][/font][/align][align=left][font=宋体][color=black]([/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]4[/color][/font][font=宋体][color=black])磁珠法:与离心柱的操作原理基本相同,利用交换吸附材料吸附核酸,从而将核酸和蛋白质等细胞中其他物质分离。优点是能够实现自动化、高通量操作,配合核酸自动提取仪使用,操作简单、用时短,核酸纯度高、浓度大,可广泛用应用于血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中的[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]DNA[/color][/font][font=宋体][color=black]和[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]RNA[/color][/font][font=宋体][color=black]分离,但超高通量样本同时进行时,可能存在一定的污染风险。[/color][/font][/align]以上内容来自仪器信息网《PCR实战宝典》
问题描述:核酸提取中裂解液的使用量为多少合适?解答:[align=left][font=宋体]裂解液的用量原则是确保能彻底裂解样品,同时使裂解体系中核酸的浓度适中。浓度过低,将导致沉淀效率低,影响得率;浓度过高,去除杂质的过程复杂且不彻底,导致纯度下降。另外,裂解液的用量是以样品中蛋白质的含量为基准的,而不是以核酸含量为基准,这一点务必牢记。[/font][/align]以上内容来自仪器信息网《PCR实战宝典》
核酸纯化柱(微/小提)http://www.biocomma.cn/images/2mlxiaoti.jpg核酸纯化小提柱产品组成外管医疗级PP,2ml,耐受酸碱和大部分的有机溶剂,收集离心试剂。内管医疗级PP,耐受酸碱和大部分的有机溶剂,底部鲁尔接口设计,方便试剂流出。筛板特殊纤维材料,在高速离心过程中,支撑硅胶膜,保证硅胶膜的完整性,耐受酸碱和大部分的有机溶剂,厚度仅为0.3mm,孔径50um,致孔,孔隙率只有不到百分之二十,相比市场上同类产品,比面积小,静电小,DNA吸附极大降低。硅胶膜孔径1um,高盐低pH值选择性吸附DNA、RNA,低盐高pH值释放DNA、RNA压圈医疗级PP,固定筛板与硅胶膜。核酸纯化微提柱http://www.biocomma.cn/images/2mlweiti.jpg产品组成外管医疗级PP,2ml,耐受酸碱和大部分的有机溶剂,用来收集离心液。内管医疗级PP,耐受酸碱和大部分的有机溶剂,底部鲁尔接口设计,方便离心液收集。装配位(这里指装配硅胶膜、筛板和压圈处)1直径为7.4mm,与市场上核酸小量提取同等规格。装配位2,直径为5.4mm,此处为微量核酸提取装配位,面积为小量提取装配位的一半。筛板特殊纤维材料,在高速离心过程中,支撑硅胶膜,保证硅胶膜的完整性,耐受酸碱和大部分的有机溶剂,厚度仅为0.3-0.5mm,孔径50um,孔隙率只有不到百分之二十,相比市场上同类产品,比面积小,静电小,DNA吸附极低。硅胶膜孔径1um,高盐低pH值选择性吸附DNA、RNA,低盐高pH值释放DNA、RNA压圈医疗级PP,固定筛板与硅胶膜。CommaPrep™核酸微提/小提柱可用在核酸提取过程(见图1)中过柱结合、洗涤、洗脱步骤中http://www.biocomma.cn/images/nucleic-2.jpg 图1 核酸提取过程核酸吸附量:核酸纯化小提柱:0-20ug核酸纯化微提柱:0-10ug规格:2ml离心管+吸附柱 适用范围:核酸提取原理是在特定溶液环境下(高盐、低pH)使核酸吸附在固相介质(硅胶膜)上,洗涤去除杂质后,再改 变溶液环境使DN A溶解到纯水或TE中。DNA提取:核酸提取柱用于基因组DNA抽提,不需要使用平衡液。抽提缓冲液,或者结合液中需要胍盐(如硫氰酸胍等) 辅助DNA吸附到膜上。RNA提取:裂解液建议使用含有硫氰酸胍(异硫氰酸胍)可以抑制RNA酶活性,保证RNA酶完整性;可以配合Trizol使用,样品经Trizo裂解后,氯仿分相去除蛋白等杂质,取上层过柱,然后70%乙醇洗涤,即可得到纯净的RNA。【注意事项】 1.上柱前溶液的PH值应小于7;2.洗涤液中的乙醇浓度不得低于50%,一般55%--80%之间。3.最后洗脱,可以用去离子水或者TE(10 mmol/LTris-Cl,1 mmol/L EDTA (pH8.0))。如果长期保存DNA,建议使用TE。定购信息Cat#品名离心柱规格提取量包装DNAK1001CommaPrep™质粒小提纯化柱2ml0-20μg100套/包DNAK1004CommaPrep™琼脂糖凝胶回收纯化柱2ml0-10μg100套/包DNAK1007CommaPrep™ 核酸纯化柱(微小提)2ml0-10μg100套/包DNAK1008CommaPrep™基因组小提纯化柱2ml0-20μg100套/包DNAK1009CommaPrep™RNA小提纯化柱2ml0-20μg100套/包DNAK1002CommaPrep™质粒中提纯化柱15ml0-100μg20套/包DNAK1003CommaPrep™质粒大提纯化柱50ml0-500μg10套/包定制
核酸蛋白检测仪是层析分析的主要装置,核酸蛋白检测仪配上层析柱、恒流泵、部分收集器、层析谱分析系统(根据需要选配)和电脑打印设备即构成一套完整的核酸蛋白检测仪分离层析系统。它是当今从事生命科学研究、药物测定、化工、食品科学及医学研究等行业的现代分析实验仪器。核酸蛋白检测仪分析系统广泛用于工业、农业、科研和大专院校的科学研究和教学实验。其原理是根据物质(样品)对紫外光有明显吸收的特征,实现对样品成份含量比对分析,以便进行样品蛋白、核酸物质识别检测和含量测定。在生化分析、环保科学、食品研究、毒理研究、新药开发等领域中对核酸、蛋白检测、纯化和提取提供了一种独特的分析手段。
[size=16px][color=#ff0000][b][url=https://www.instrument.com.cn/job/position-88822.html]立即投递该职位[/url][/b][/color][/size][b]职位名称:[/b]核酸提取试剂盒研发员-苏州市[b]职位描述/要求:[/b]岗位职责:负责针对各种临床样本的核酸提取试剂的开发和优化;配合磁珠进行核酸提取试剂盒的开发和优化;如游离DNA提取试剂盒、RNA提取试剂盒、[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]纯化试剂盒、DNA片段筛选试剂盒等。岗位要求:拥有相关学科的大专/硕士或博士学位,如生物技术、分子生物学等。至少1年以上核酸提取的开发经验,熟悉相关实验操作和技术原理。[b]公司介绍:[/b] 未名环诊是国内成立最早的环境分子诊断企业,以北京大学研究成果和团队基础,研发基于污水流行病学的大数据监测评估技术,开创了污水毒情监测业务,为各级政府提供毒情监测和溯源服务。为全国行业龙头,细分领域市场占有率超60%。与公安部、18个省级公安厅、200多个地市级公安局合作,为我国公安禁毒事业做出了巨大贡献和技术突破。 企业的发展目标为以城市生活污水为载体,不断挖掘污水中蕴含的城市大...[url=https://www.instrument.com.cn/job/position-88822.html]查看全部[/url][align=center][img=,178,176]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/08/202108160948175602_3528_5026484_3.png!w178x176.jpg[/img][/align][align=center]扫描二维码,关注[b][color=#ff0000]“仪职派”[/color][/b]公众号[/align][align=center][b]即可获取高薪职位[/b][/align]
问题描述:核酸洗涤过程中应注意什么?解答:[font=宋体]洗涤对于整个提取过程来说,也是非常重要的。洗涤,首先一定要将沉淀悬浮起来;第二就是要控制一定的时间,尤其是当核酸沉淀比较大时[/font][font='Times New Roman','serif'] ([/font][font=宋体]使核酸沉淀最终蓬松[/font][font='Times New Roman','serif'])[/font][font=宋体];第三是少量多次;第四则是去上清要彻底。大部分资料中的操作基本上都是[/font][font='Times New Roman','serif']“[/font][font=宋体]倒掉上清后倒置在吸水纸上片刻[/font][font='Times New Roman','serif']”[/font][font=宋体],这一说法,对于质量好的离心管,如果离心管是经过硅化的,因为液体几乎不挂壁,所以上清可以去除得非常彻底;好的离心管,即使没有经过硅化,残留量也非常少,也没有什么问题;差的离心管,液体挂壁非常可观,其残留量多到会影响后续的实验。避免液体残余的一个好方法,就是倒掉液体后再短暂离心,将残液用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url]吸出。还有需大家牢记的是,残液中都含有上一步操作中的杂质,其残留量与混匀程度、核酸沉淀的大小都有关。挥发时去掉的是乙醇,杂质是不会被挥发去除的。这步,切忌不要用手甩,这样容易将核酸甩掉。另外,核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也决定了洗涤的强度。沉淀越大,裂解液的裂解能力越强,洗涤越要彻底:放置时间相对要长一点,洗涤次数也要考虑增加。[/font]以上内容来自仪器信息网《PCR实战宝典》
问题描述:为了保证分离核酸的完整性和纯度,在实验过程中应注意哪些?解答:[align=left][font=宋体][color=black]尽量简化操作步骤,缩短提取过程,以减少各种有害因素对核酸的破坏;减少化学因素(酶、[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]PH[/color][/font][font=宋体][color=black])对核酸的降解,提取核酸过程中所用枪头、容器等与核酸直接接触的实验用具应保证无酶,避免核酸被酶解。为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏,操作多在[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]pH[/color][/font][font=宋体][color=black]为[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]4.0-10.0[/color][/font][font=宋体][color=black]的条件下进行;减少物理因素对核酸的降解,物理降解因素主要是机械剪切力,其次是高温。[/color][/font][/align]以上内容来自仪器信息网《PCR实战宝典》
利用硅胶膜法提取纯化质粒DNA摘要:系统的阐述了质粒核酸提取过程中针对裂解和核酸纯化两大关键步骤的研究,重点介绍了利用硅胶膜法提取纯化核酸,以及在实验过程中的一些经验。关键词:硅胶膜法;纯化;质粒DNA一、前言随着分子生物学技术的发展,核酸的分子生物学技术成为了药物研发、遗传病和感染性疾病的诊断、基因研究及物种鉴定等的常用研究手段之一。然而,核酸提取质量是进行下游一系列研究的关键,因此提取的方法会直接影响后续实验。细菌质粒是一类双链闭合环状的DNA,大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份。质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子,重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。硅胶膜法是一种应用最为广泛的提取纯化质粒DNA的方法,因硅基质材料可特异吸附核酸DNA,使用方便、快捷,不需要使用有毒溶剂如酚、氯仿等,使得提取质粒核酸像过滤一样简单。二、实验部分2.1 原理硅基质材料吸附核酸的原理主要利用DNA在高盐低pH值环境下与硅基质材料相结合,在低盐高pH值环境下与硅基质材料脱离的特征。其机理是带负电荷的DNA和带正电的二氧化硅粒子之间有很强的亲和力。在高浓度盐离子的作用下,盐离子打破水中的氢和二氧化硅上带负电荷的氧离子间的氢键,DNA与硅基质紧密结合,洗涤除去其他杂质;再用低离子强度的TE缓冲液或蒸馏水洗脱结合的DNA分子,机理是当盐被清除后,再水化的硅基质破坏了基质和DNA之间的吸引力,因而DNA从硅基质上被洗脱下来。2.2 主要试剂溶液Ⅰ:50mM葡萄糖,25mM Tris-HCl(pH 8.0),10mM EDTA(pH 8.0)。溶液Ⅱ:0.2NNaOH,1% SDS。溶液Ⅲ:醋酸钾(KAc)缓冲液,pH 4.8。漂洗液:60mM 乙酸钾、10mM Tris-HCl (pH 7.5) 、60% 乙醇TE:10mMTris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA(pH 8.0)。2.3 主要步骤该步骤采用CommaPrePTM的质粒小提纯化柱。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507171513_556042_3310_3.jpgCommaPrep™核酸小提柱可用在核酸提取过程中过柱结合、洗涤、洗脱步骤中http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507171516_556043_3310_3.jpg1. 取1.5ml过夜培养的菌液,加入离心管中,使用常规台式离心机,12,000 rpm 离心1 min, 尽量吸除上清。 (注意:应根据所培养菌体的浓度与质粒的拷贝数,确定收集的菌液量。菌量过大可能导致溶菌不充分,纯化时会影响质粒纯度菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。2. 将细菌沉淀重悬于100uL溶液Ⅰ中,移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀,使菌体分 散混匀。 (注意:如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。并且溶液Ⅰ中 要加入适量的RNA酶)3. 向离心管中加入200uL溶液Ⅱ,温和地上下翻转数次,并将离心管放置于冰上2-3min,使细胞膜裂解。(注意:温和地混合,不要剧烈震荡,以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮,如果未变得清亮,可能由于菌体过多,裂解不彻底,应减少菌体量。)4. 加入150uL溶液Ⅲ,立即将管温和颠倒数次混匀,见白色絮状沉淀。12000rpm, 离心2分钟。 (注意:加入溶液Ⅲ后,要立即将管温和颠倒,避免产生局部沉淀。如果上清液中存在沉淀,可再一次离心。溶液Ⅲ为中和溶液,此时质粒DNA复性,染色体和蛋白质不可逆变性,形成不可溶复合物。)5. 吸取上清至吸附柱(内管)中(吸附柱在离心管中),尽量不要吸出沉淀,12000rpm,离心30秒。弃去废液,将吸附柱重新放入一个新的离心管中。6. 加入750uL的漂洗液(漂洗液要在实验前加入无水乙醇)12000rpm离心,1min。取出 DNA结合柱,弃废液,重新插入DNA结合柱到离心管中。7. 用500uL漂洗液重复冲洗过程。12000rpm离心,1min。(注意:重复一次可以增加质粒的回收效率。)8. 转移DNA结合柱到1个新的1.5mL离心管中,加入60uL的无核酸酶的水到DNA结合柱中,洗脱质粒DNA,室温条件下,12000rpm离心,1min。 (注意:不要转入DNA结合柱中的漂洗液,如果混有,就需要12000rpm离心,1min。洗脱缓冲液体积不少于50uL,体积小会影响回收效率。 洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大的影响,若用水洗脱应保证pH值在7.0-8.5范围内, pH小于7会降低洗脱效率。如果长期保存DNA,洗脱液建议使用TE。)9. 加入100uL的无核酸酶水到结合柱中,洗脱质粒DNA,离心12000rpm,1min。(注意:重复一次,增加洗脱效率。)10.洗脱DNA后,从1.5mL离心管中取出DNA结合柱并废弃。11.取2uLDNA进行电泳,检测DNA质量。12.将纯化的DNA溶液于-20℃中。三、实验结果图为质粒DNA(10kb)的凝胶电泳图,说明提取效果较好。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507171525_556044_3310_3.jpg
2022年新冠疫情来势汹汹,做核酸成为许多人的日常,核酸检测实验也成为许多生物实验人的日常。核酸检测实验过程复杂,病毒灭活是非常重要的一步,其中,水浴锅作为常见的恒温仪器,在病毒灭活中发挥着重要作用。[img=,630,]https://pic1.zhimg.com/80/v2-e8a3063325978b82ec93ba0bb143a178_720w.jpg[/img][b][i]一、哪个实验步骤能用到水浴锅?[/i][/b]核酸检测过程复杂,包括信息录入、核酸提取、[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增[/color][/url]、结果分析等环节。核酸样本收集之后,首先要做的就是将样本中的病毒进行灭活,灭活之后才能开启信息录入、核酸提取等一系列的环节。经研究人员测试发现,新冠病毒对紫外线和热敏感,只需高温就可以把新型冠状病毒灭活。目前,国家卫健委相关指南就要求,在提取样本核酸前需将样本置于56℃以上以灭活病毒。因此,将病毒样品放入56℃的恒温水槽或是水浴锅中,高温消毒30分钟以上,成为新冠病毒灭活的常用方法。[img=,623,]https://pic2.zhimg.com/80/v2-5cb88675f34cdc6a354f242c10bb2679_720w.jpg[/img][b][i]二、力辰水浴锅的优势有哪些?[/i][/b]疫情反复突增,核酸检测任务量大且紧急,缩短实验时间,提升检测效率成为各生物实验室的亟需解决的痛点之一。力辰数显恒温水浴锅,控温精准、升温迅速、性能稳定,可以有效缩短预热时间,精准控制加热温度,适用于实验室[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]核酸检测的病毒灭菌环节。[img=,625,]https://pic1.zhimg.com/80/v2-4746ea8d3c01f1bf78f7097bd45b94a0_720w.jpg[/img][b]1、微电脑控温仪表、PT100温度传感器,控温准确[/b]力辰数显恒温水浴锅采用抗振动、稳定性好、准确度高、耐高压的PT100温度传感器,同时使用数显控温仪表,按键控制,能做到准确控温。从控温精度来看,力辰水浴锅的温度范围在室温+5℃-100℃之间,控温精度≤±1℃,部分机型可做到≤±0.5℃的控温精度,充分满足用户精准控温需求。[img=,588,]https://pic4.zhimg.com/80/v2-fa2d2ed62ded9533223366a99f5c7ccb_720w.jpg[/img][b]2、大功率变压器,升温快、受热均匀[/b]机身内部设有大功率变压配套电路板,可控硅控制,配套不锈钢加热管,升温速度快。容积3-38L的水浴锅,由室温升至沸点(100℃)均小于70分钟。同时部分型号配备磁力搅拌功能,边加热边搅拌,使受热更均匀,能有效缩短实验时间,提升实验效率。[img=,602,]https://pic2.zhimg.com/80/v2-e2358e4366ba4e4495eb331b077ec195_720w.jpg[/img][b]3、可拆卸式锅盖,适配多种规格容器、保温性能高[/b]锅盖采用可拆卸式,能适配多种规格容器,保温性能好,有效保证温度精准性,确保样本处在稳定的恒温环境中;同时采用耐高温塑料,使用寿命长,节约实验室成本。[img=,619,]https://pic2.zhimg.com/80/v2-4e01da7de94c634a57134b428b0e845d_720w.jpg[/img][b]4、冷轧钢外壳、304不锈钢内胆,耐腐蚀性强、易清洗[/b]外壳采用冷轧钢,防生锈、防静电;内胆使用优质304不锈钢,一次性冲压成型,耐腐蚀,易清理消毒,杜绝病毒的残留。[img=,616,]https://pic3.zhimg.com/80/v2-d1b917968d59035122412f8b341f8162_720w.jpg[/img]在生物和制药行业,水浴锅是必备的实验仪器。核酸检测、疫苗研制等需要灭活病毒的实验,其他需要培养微生物的实验等等,都需要水浴锅提供恒温环境;除此之外,水浴锅可以结合旋转蒸发器、真空冷冻干燥箱等仪器,进行多功能化学反应作业及药物储存,用途十分广泛。【参考文献】张沁欣,赵庆顺.(2020).病毒核酸提取前的高温灭活过程显著降低可检出病毒核酸模板量.[ChinaXiv:202002.00034]
[align=center][b]计量在核酸检测中的作用[/b][/align][size=14px] 德尔塔变异株目前是全球新冠肺炎疫情流行的主要毒株。国内外相关科学研究和疫情防控实践表明,德尔塔变异株并没有导致新冠病毒生物学特性发生颠覆性改变,传染源、传播途径基本清楚,现有的疫情防控措施对德尔塔变异株仍然有效。[/size][size=14px] 在国内外相关科学研究和疫情防控实践中,计量发挥着[color=#366092]“金钥匙”[/color]的作用。[/size][size=14px]下面,由国家生物技术药物产业计量测试中心的[back=transparent]计量专家带领大家了解:[/back][/size][size=14px][color=#1f497d][back=transparent]什么是生物计量?[/back][/color][/size][size=14px][color=#1f497d][back=transparent]什么是标准物质?[/back][/color][/size][size=14px][color=#1f497d][back=transparent]标准物质在新冠病毒检测中的作用;[/back][/color][/size][size=14px][color=#1f497d][back=transparent]标准物质如何保证医院在检验检测中的结果准确。[/back][/color][/size][size=14px] 近年来,“精准医疗计划”被提出,其核心是“精准”,基础则为准确的测量。计量则为各类测量提供了满足各种量值及精度的“尺子”和“砝码”。[/size][size=14px] 药物研发生产过程中的工艺参数是否被准确执行、产品性能是否被准确测量,这些生物制药全产业链中“测不出、测不全、测不准”的困难和难题,需要以先进的计量测试技术来解决。[/size][b]1、什么是标准物质?[/b][font=-apple-system, BlinkMacSystemFont, &][color=#181716] 标准物质(RM)reference material:是一种已经确定了具有一个或多个足够均匀的特性值的物质或材料,作为分析测量行业中的“量具",简单理解就是生物、化学分析测量领域的“砝码”。[/color][/font][color=#181716][b]2、生物特性标准物质有哪些?[/b][/color][color=#181716][font=-apple-system, BlinkMacSystemFont, &][color=#181716] 有单克隆抗体标准物质、微生物定性定量标准物质、重组蛋白类药物有效成分标准物质、核酸定量标准物质等等。[/color][/font][/color][b]3、核酸定量类标准物质如何在新冠核酸检测中发挥作用?[/b][font=-apple-system, BlinkMacSystemFont, &][color=#181716] 新冠病毒假病毒核酸标准物质具有拟病毒的物理结构和新冠病毒的特异性核酸序列,并且通过基因改造技术保证了假病毒标物可靠的生物安全性、稳定性,使标物可以最大限度地重现新冠病毒核酸检测的过程,实现从病毒核酸提取到核酸定量的全过程的质量控制,为新冠病毒核酸诊断的结果提供精确的“生物标尺”,从而有效降低“假阴性”的出现概率。[/color][/font][font=-apple-system, BlinkMacSystemFont, &][color=#181716][img=,690,411]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/09/202109011024432736_818_1626275_3.png!w690x411.jpg[/img][/color][/font][font=-apple-system, BlinkMacSystemFont, &][color=#181716][font=-apple-system, BlinkMacSystemFont, &] 所以,测量是贯穿全产业链的。无论是设计、制造还是使用,都需要精确地测量各种属性、参数和运行状态,以实现精准的分析和优化。可以说,计量技术将国家计量基准(标准)的准确量值传递到生产车间里面,[/font][b]贯穿到制造过程的每一道工序的工程测量中,发挥提升质效的作用,是打造精准医疗“金标准”。[/b][/color][/font]
[font=&][color=#ff0000][font=&]【活动形式】根据题目及选项,回帖参与竞答[/font][font=&]【开奖时间】每日上午揭晓昨日答案、发放奖励,并发布当日题目[/font][/color][/font][font=&][color=#ff0000][font=&]【活动奖励】凡答对者可获得20积分奖励[/font][/color][/font][font=&][color=#ff0000][font=&] 疫情结束后统计答题正确数量前10名用户发放“抗击新冠能手”勋章一枚![/font][/color][/font][align=center]=======================================================================[/align][align=left][size=18px]请将新冠病毒核酸检测步骤安先后顺序排序:[/size][/align][align=left][size=18px]A、样品接收[/size][/align][align=left][size=18px]B、核酸提取[/size][/align][align=left][size=18px]C、出具报告[/size][/align][align=left][size=18px]D、PCR扩增[/size][/align][align=left][size=18px]E、病毒灭活[/size][/align][align=center]=======================================================================[/align]正确答案:AEBDC
2020年4月18日,《[url=https://www.zhihu.com/search?q=%E5%8D%8E%E7%9B%9B%E9%A1%BF%E9%82%AE%E6%8A%A5&search_source=Entity&hybrid_search_source=Entity&hybrid_search_extra=%7B%22sourceType%22%3A%22article%22%2C%22sourceId%22%3A%22387158915%22%7D]华盛顿邮报[/url]》(WashingtonPost)爆出一则重磅新闻,美国CDC在实验室生产的新冠病毒检验试剂出现了污染问题(图1),导致全美的核酸检测推迟最少一个月。2020年1月21日,美国CDC开发了新冠病毒检测方法,1月下旬,美国CDC对26个公共卫生实验室发放新冠病毒试剂盒,有24个实验室出现了假阳性,美国CDC紧急召回诊断试剂,直到3月2日,IDT公司生产新冠试剂重新投入使用。由于实验室污染,美国错过了黄金的疫情防控窗口。[img=,919,]https://pic3.zhimg.com/80/v2-cd8d1d3aca2679ba712ee37665d3f292_720w.jpg[/img][img=,979,]https://pic3.zhimg.com/80/v2-b0ffe581305755a0db617c2b5e98eaf6_720w.jpg[/img]二、核酸污染与分类2.1 核酸污染,[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]实验室绕不开的“疼”[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url](聚合酶链式反应简称)检测因其灵敏度高、快速、操作方便等优势被广泛应用,不过正是由于它灵敏度极高,极微量的污染源都有可能导致检测结果的假阳性。因此,如何避免以及处理实验室污染,对[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测人来说是一种挑战。2.2 [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]污染分类(1)样本间交叉污染:主要是在采(取)样的过程中,由于取样工具之间的交叉造成污染;或者在核酸提取的过程中,由于[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url]、离心管等使用不当导致的样本间污染。(2)[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]试剂的污染:主要是在[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]试剂配制过程中,由于[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url]、容器、阴性对照及其它试剂被核酸模板或阳性对照污染。(3)克隆质粒的污染:在实验室操作中经常会用到阳性参考品,这些阳性参考品大多数是由某些克隆质粒制作而成,克隆质粒在单位容积内浓度高,使用不当极易造成污染。(4)CR扩增产物污染:这是[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]反应中最主要、最常见,也是最令人头疼的污染问题。因为[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]产物拷贝量大,远远高于[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测数个拷贝的极限,所以极微量的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]产物污染,就可造成假阳性结果。[img=,966,]https://pic2.zhimg.com/80/v2-ef39f2836cc5d3c8b081f0916a887635_720w.jpg[/img]图2 [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]产物拷贝量示意三、扩增产物[url=https://www.zhihu.com/search?q=%E6%B0%94%E6%BA%B6%E8%83%B6&search_source=Entity&hybrid_search_source=Entity&hybrid_search_extra=%7B%22sourceType%22%3A%22article%22%2C%22sourceId%22%3A%22387158915%22%7D]气溶胶[/url]污染—核酸污染中的“牛皮藓”[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]实验室核酸污染中最难消除的是气溶胶污染,尤其是扩增产物的气溶胶污染。污染主要发生在[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]的扩增和产物分析阶段。因为,[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]产物拷贝量大(一般为1013拷贝/mL)(图2),扩增产物液面与空气摩擦时会形成气溶胶。所以,比较剧烈地摇动反应管、开盖时吸样,以及反复吸样都可形成气溶胶污染。飞溅的扩增产物会形成气溶胶漂浮在空气中,粘附到物体表面及检测人员身体上,随着人员及物料流动而污染整个实验室。如果这种污染能及时发现,实验室空置几天,采取积极有效的处理措施,情况会好转。四、[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]实验室核酸污染传统处理方法4.1 物理方法使用紫外灯照射是目前[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]实验室预防污染最常规的方法。由于DNA链上相邻的嘧啶在254nm紫外诱导下发生交联,[url=https://www.zhihu.com/search?q=%E5%98%A7%E5%95%B6%E4%BA%8C%E8%81%9A%E4%BD%93&search_source=Entity&hybrid_search_source=Entity&hybrid_search_extra=%7B%22sourceType%22%3A%22article%22%2C%22sourceId%22%3A%22387158915%22%7D]嘧啶二聚体[/url]不能被切除,导致DNA聚合酶在空间上被阻碍或者DNA不能被完全变性,从而使扩增反应终止。由于小的扩增子只有较少的临近嘧啶,所以该方法对小的扩增子效果不明显,对富含G+C的和短的(300bp)的扩增产物污染效果不大。4.2 化学方法包括使用商品化的DNA去除剂、次氯酸钠、1mol/L的盐酸等各种化学物质去降解DNA。化学方法主要通过氧化损伤核酸的作用,从而使留在实验室的扩增产物被破坏掉。4.3 顺其自然法停下所有实验,靠通风和时间抹掉核酸的痕迹。4.4 绝地求生法换一种试剂盒,只要两种试剂的扩增产物不一致,没有交叉反应,可以继续做实验。五、[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]实验室核酸污染的整体解决方案根据《[url=https://www.zhihu.com/search?q=%E5%8C%BB%E7%96%97%E6%9C%BA%E6%9E%84%E6%96%B0%E5%9E%8B%E5%86%A0%E7%8A%B6%E7%97%85%E6%AF%92&search_source=Entity&hybrid_search_source=Entity&hybrid_search_extra=%7B%22sourceType%22%3A%22article%22%2C%22sourceId%22%3A%22387158915%22%7D]医疗机构新型冠状病毒[/url]核酸检测手册(试行第二版)》(联防联控机制医疗法〔2020〕313号)中提到:实验室结束后空气清洁要求。必要时可采用核酸清除剂等试剂清除实验室残留核酸(图3)。[img=,795,]https://pic4.zhimg.com/80/v2-86e6a5ba788dad4f3b9aae8016e0ce0f_720w.jpg[/img]图3《医疗机构新型冠状病毒核酸检测手册(试行第二版)》的要求5.1 全自动核酸气溶胶污染清除仪—预防、清除气溶胶污染的得力助手[img=,829,]https://pic4.zhimg.com/80/v2-232699116e0e539fab32efb00bd91db3_720w.jpg[/img]Ares Y2000 / Ares Y1000图4 熠创鼎惠全自动核酸气溶胶污染清除仪Ares Y2000 / Ares Y1000熠创鼎惠(上海)生物科技有限公司推出的全新全自动核酸气溶胶污染清除仪(图4),清除仪采用独特配方的配套核酸清除剂(片剂溶解),经Ares系统顶尖的Dry Fog剪断作用,雾化的清除剂被超音速空气再次微粒化,与另一喷口同样被雾化的水滴在中央撞击,相互反复剪断的同时,发生3.3万-4万赫兹的超声波,使清除剂更加微粒化,均等化,形成真正的Dry Fog。超级雾化的清除剂通过无规则的布朗扩散运动,充分捕捉空气中[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]气溶胶,高效破坏DNA的嘌呤和嘧啶碱的共轭双键,从而实现清除的目的。Ares在氧化处理[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]气溶胶后,通过空气置换,由气溶胶吸附屏吸附DNA气溶胶,在设备内部LED紫外灯光照下,二氧化钛发生光触媒反应,产生数以亿计具有超强氧化能力的羟基自由基,进一步降解[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]气溶胶,从多维度协同清除气溶胶。Ares还能起到分解细菌和病毒,净化空气,保证实验室生物安全性的多重作用。另外可以一机多用,还具有雾化过氧化氢消毒消毒功能,更加全面保障实验室的安全。可广泛使用于[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]实验室样本处理区、核酸提取区、试剂配制区、[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]扩增或检测区,适用于医院检验科、疾控、海关、食药监、血站、科研院校等[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]实验室。图5为RCR气溶胶清除仪使用效果验证示意。为配合气溶胶清除仪对物表核酸污染的高效清除,配套的核酸气溶胶清除剂采用接触催化协同作用,非酶性高效降解[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]产物或DNA/RNA,高效防止[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]假性的扩增。该型清除剂使用简单,不影响实验结果,无腐蚀性和[url=https://www.zhihu.com/search?q=%E8%87%B4%E7%99%8C%E6%80%A7&search_source=Entity&hybrid_search_source=Entity&hybrid_search_extra=%7B%22sourceType%22%3A%22article%22%2C%22sourceId%22%3A%22387158915%22%7D]致癌性[/url],对皮肤无刺激性,无毒性,是可安全使用的产品。对不锈钢和铜、铝等材料也基本无腐蚀。且其作用有效,可以全面解决困扰实验室的气溶胶污染问题。[img=,970,]https://pic3.zhimg.com/80/v2-e051cd9b0d92ab8423b60f253f39f3b2_720w.jpg[/img]结语[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]实验室污染引起的检测结果假阳性风险极大,因此需要采取积极有效的预防措施。进行[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]操作时,操作人员应该严格遵守一些操作规程,最大程度地降低可能出现的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]污染或杜绝污染的出现。实验结束后,对实验室环境进行清洁,必要时采用核酸清除剂等试剂清除实验室残留核酸。熠创鼎惠气溶胶污染清除仪可有效预防和清除气溶胶核酸污染,保障实验室安全。熠创鼎惠厂家13728031910
质粒提取柱(大中/硅胶膜)CommaAffin™质粒中提柱http://www.biocomma.cn/images/nucleic-11.jpg产品组成外管医疗级PP,15ml,耐受酸碱和大部分的 有机溶剂 ,用来收集离心液。内管医疗级PP,耐受酸碱和大部分的 有机溶剂 ,底部鲁尔接口设计,方便离心液收集。直径11.0mm筛板特殊 纤维材料 ,在高速离心过程中,支撑硅胶膜,保证硅胶膜的完整性,耐受酸碱和大部分的 有机溶剂 ,厚度仅为0.3-0.5mm,孔径50um,孔隙率只有不到百分之二十,相比市场上同类产品,比面积小,静电小,DNA吸附极低。硅胶膜孔径1um,高盐低pH值选择性吸附DNA、RNA,低盐高pH值释放DNA、RNA压圈医疗级PP,固定筛板与硅胶膜。CommaAffin™质粒大提柱http://www.biocomma.cn/images/nucleic-3.jpg产品组成外管医疗级PP,50ml,耐受酸碱和大部分的 有机溶剂 ,用来收集离心液。内管医疗级PP,耐受酸碱和大部分的 有机溶剂 ,底部鲁尔接口设计,方便离心液收集。直径24.0mm筛板特殊 纤维材料 ,在高速离心过程中,支撑硅胶膜,保证硅胶膜的完整性,耐受酸碱和大部分的 有机溶剂 ,厚度仅为0.3-0.5mm,孔径50um,孔隙率只有不到百分之二十,相比市场上同类产品,比面积小,静电小,DNA吸附极低。硅胶膜孔径1um,高盐低pH值选择性吸附DNA、RNA,低盐高pH值释放DNA、RNA压圈医疗级PP,固定筛板与硅胶膜。CommaAffin™核酸中/大提柱可用在核酸提取过程(见图1)中过柱结合、洗涤、洗脱步骤中核酸吸附量:CommaAffin™质粒中提柱:0-100ug 规格:15ml离心管+吸附柱CommaAffin™质粒大提柱:0-500ug 规格:50ml离心管+吸附柱 http://www.biocomma.cn/images/nucleic-7.jpg 图1 质粒提取过程适用范围:核酸提取原理是在特定溶液环境下(高盐、低pH)使核酸吸附在固相介质(硅胶膜)上,洗涤去除杂质后,再改 变溶液环境使DN A溶解到纯水或TE中。质粒DNA提取:抽提缓冲液,或者结合液中需要胍盐(如硫氰酸胍等) 辅助DNA吸附到膜上。【注意事项】 1.上柱前溶液的PH值应小于7;2.洗涤液中的乙醇浓度不得低于50%,一般55%--80%之间。3.最后洗脱,可以用去离子水或者TE(10 mmol/LTris-Cl,1 mmol/L EDTA (pH8.0))。如果长期保存DNA,建议使用TE。订购信息Cat#品名柱管规格包装004407质粒中提过滤管20ml50套/包004410质粒中提过滤管30ml50套/包004416质粒大提过滤管60ml20套/包
提取植物DNA时遇到多糖成分的干扰, DNA质量一直不高,如何消除多糖的影响?参考见解:一般来说,SDS法提取的DNA会还有较多的多糖,使DNA成胶冻状。而CTAB法提取可基本上除去多糖。如果是植物材料本身含糖量比较高,可用以下方法试一试:1、 在 DNA 未溶出之前,先用一些缓冲液洗去多糖。如可用缓冲液:100 mmol/LTris -HCl(pH=8.0)、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L Sorbitol洗几次。2、 使 DNA 提取液中的多糖先沉淀。在提取液中加入 0.35 倍体积的无水乙醇,迅速混匀,多糖会先沉淀。3、 沉淀 DNA 时,使多糖保留在溶液中。如用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入 1/2 体积的 5 mol/L NaCl,或加 NH4Ac 使终浓度为 10 mmol/L。或 0.5 mL DNA 液中加 0.12 5 mL 4 mol/L NaCl 和 0.625 mL 13% PEG 8000(冰浴 1 h)。4、 多糖和 DNA 的共沉淀物进行再分离。如用 TE缓冲液反复清洗共沉淀 物,将清洗液合并再用醇沉淀 DNA,或将沉淀物溶解后,经琼脂糖电泳,切下 DNA 部分再将胶回收,或者用多糖水解酶将多糖降解。还 有在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积),氯苯可以与多糖的羟基作用而去除多糖 。上述方法还可组合使用,以达到最佳效果。然而这些方法均会在一定程度上减低 DNA 的提取量;如果材料较少或要求较高,则可考虑用柱层析方法,使用对 DNA 具有 特异性吸附的树脂来纯化 DNA。曾有文献提到选用 Wizard Purification Kit,PRC-5 柱 ,Sephacryl S-1000 或 S-500,Qiagen Genomic tip 500/G ,或者 CsCl 梯度离心纯化 DNA。血样4度保存了2月,现在按照酚常规提取方法不能提取出DNA,有什么解决办法?参考见解:按照常规的酚/氯仿法不可能提不出来,下面是参考方法:1、 首先洗出白细胞,最好有1毫升以上血液。2、 加入5ml DNA提取缓冲液,(10m mol/L Tris-cl, 0.1 mol/L EDTA, o.5% SDS),混匀。3、 加入25ul 蛋白酶K ,使终浓度达到100ug/ml, 混匀,50℃水浴过夜。4、 用等体积的(酚,氯仿,异戊醇,25:24:1)混合物抽提一次,5000r/min,10min离心收集水相。5、 取水层,加入3倍体积-20℃预冷无水乙醇5000r/min,10min,75%乙醇5000r/min洗DNA,充分干燥将DNA溶于适量水中。 CTAB法提取水稻基因组DNA, TE 溶解后琼脂糖胶电泳检测,点样孔附近有一条明显的主带。用MBI 公司产的限制性内切酶酶切过夜,鉴定时发现DNA已经被完全切烂,只在溴酚蓝前存在微弱smear状产物。换用NEB 公司产的酶,更换EP管,灭菌水之后重复几次,结果还是如此。拿其他人的DNA 做对照,酶切结果正常。用异丙醇将DNA 重新沉淀,换了TE溶解,检测主带仍旧清晰,可是用酶切之后DNA还是被切烂。为什么? 参考见解:1、 公司的酶不行。2、 如做酶切,DNA最好不用异丙醇(因其不易挥发)而用无水乙醇沉淀。3、 酶量大或作用时间太长了。建议重提DNA,取少许用超纯水溶解(非TE),按照说明书进行酶切。要用新鲜样品或液氮冷冻-70度保存的样品。这样通过降低内切酶的活性减少DNA的降解;要得到全血基因组DNA,可以先用分层液密度梯度离心将淋巴细胞分离吗?这样做,与沉淀全血细胞然后破坏红细胞得到的结果有何差异?参考见解:1、 觉得还是先分离细胞好,因为DNA和RNA大都是在细胞核内,有红细胞反而不太好。从血里面提RNA,用淋巴细胞分离液先分离有核细胞的,效果还是不错的。2、 现在提取全血的DNA,也就是提取淋巴细胞中的DNA,用密度梯度离心,只是富积淋巴细胞,能得到更多的DNA而已。一般如果DNA的量的要求不太多的话,没必要。3、 如果对基因组的要求不高,可以试试这个方法。取EDTA-Na2抗凝血100μl加至1.5ml Eppendorf管中,加无菌重蒸水500μl;10 000r/分钟离心3分钟,弃净上清;加20μl 5mol/L KI,旋涡振荡30秒;0.9%NaCl 100μl,150μl氯仿/异戊醇(24∶1),振荡30秒;10 000r/分钟离心5分钟,吸上清100μl于另一Eppendorf管中,加异丙醇60μl,轻轻混匀,10 000r/分钟离心5分钟,弃上清;加冷无水乙醇1000μl,10 000r/分钟离心5分钟;弃去无水乙醇,37℃烤干;50μl无菌重蒸水或TE,混匀溶解备用。从经福尔马林处理后的组织标本中提取DNA可以吗?参考见解:可以的,国外有好多相关试剂盒,qiagen, roche等公司都有的。100ml的大量提取,蛋白酶K是必需的吗?它的作用是什么?用溶菌酶代替可以吗?每次在用酚氯仿异戊醇抽提后,上层里面都是絮状的蛋白质,离心几次都沉淀不下来,请问是哪里出了问题?参考见解:一般来说,蛋白酶的作用是将蛋白质消化成小的片段,促进核酸与蛋白质的分开,同时,也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。而溶菌酶的作用是破坏微生物细胞壁,二者作用各异,不可替代。对于实验中的蛋白问题,建议离心后先用竹签挑出蛋白,小心吸取上层清液,再重复抽提几次试试。一般植物DNA提取的时候都不加蛋白酶K,这样提出来的DNA链上的组蛋白等未被蛋白酶消化,不是很难除去吗?那DNA是不是不纯?可以用来酶切吗?参考见解:蛋白酶k的主要作用并不是消化组蛋白,而是消化细胞,在动物细胞DNA的提取也不加蛋白酶k也是可以的,植物细胞的较易破碎,不需要蛋白酶k的作用。protenase K作用:1、 消化组蛋白,释放出DNA。2、 消化DNAse,提高DNA分子量。建议还是加蛋白酶k为好,这样提出来的 DNA分子量会高一点,且更纯。提白粉孢子的总DNA,白粉孢子比较小,直接在研磨中加液氮研磨可以吗?参考见解:液氮研磨的方法应该可行的,做动物组织,植物组织多采用这种方法,植物纤维一样可以用液氮研磨,要有耐心,边加液氮边研磨,研磨好后再抽提,应该是可以的。在CTAB法提取DNA时,有一些品种没有DNA析出,是什么原因?参考见解:1、 用预冷的异丙醇来沉淀试试,同时研磨的时候要研的非常非常的细。2、 没有看到析出物并不代表没有沉淀,可以继续下一步试验,溶解的时候少加一点儿。3、 高离子强度下DNA与CTAB能形成共沉淀。可能DNA就这样留在沉淀里了。提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时,怎样更好的抑制内源核酸酶的活性?参考见解:在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时,可增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。用试剂盒对农田土壤的的微生物群落DNA进行提取,虽然总DNA提出来了,可是用细菌的通用引物进行PCR的时候却怎么也扩不出来,请有没有什么好的办法可以解决这个问题?参考见解:环境特别是土壤的样品成分
1. 使用正确的细胞或组织储存条件 在样品用液氮瞬间冻结之后,应该储存在-80°C,千万不能解冻。即使是置于含有胍盐的裂解液中作匀浆前的短暂解冻,也会导致RNA的降解和损失。瞬间冻结的组织应该首先在超低温条件下先研磨成粉,然后置于裂解液中进行匀浆。RNAfixer使样品储存更为便利。储存在RNAfixer中的细胞或组织可在室温下稳定保存长达1个星期,在4°C可稳定保存长达1个月,或永久保存在-20°C。2. 消除环境RNase的污染为了得到完整的、高品质RNA,在整个RNA制备过程中,当RNA离开强蛋白变性剂(如离液裂解液或酚)的保护时,避免引入新的RNase污染就非常关键。由于RNase几乎是无所不在,所以必须确保与纯化的RNA接触的每一样东西都是无RNase污染的。所有的表面,包括移液器、工作台、玻璃器皿和制胶设备,都必须用表面去污净化溶液如RNase喷雾清除剂 来处理过,去除各种溶液或者反应缓冲液中可能存在的RNase污染,可以用RNAsafe。必须保证一直使用无RNase的枪头、试管和溶液,手套也应经常更换。3.迅速灭活内源的RNA酶,以防止RNA降解。以下3个方法均可有效使内源RNA酶失活:1)用含离液(如胍盐)的细胞裂解液收获样品,并立即匀浆。2)用液氮瞬间冻结样品。值得特别注意的是:组织块必须保证足够小,在浸入液氮的瞬间就能冻结,以确保瞬间令RNA酶失活。3)立即将样品置于RNAfixer无液氮RNA样品储存液中。它是一种水相、无毒的收集试剂,能立即稳定并保护完整、未冻结的组织和细胞样品中的RNA。关键要点是组织样品切片一定要够薄(0.5 cm),这样RNAfixer才能在RNase破坏RNA之前迅速渗入组织块中。4. 选择合适破壁方法细胞或组织的彻底匀浆对RNA提取来说,是一个很关键的步骤,它能够防止RNA的损失和降解。匀浆的方法应根据细胞或组织的类型来选择。大部分培养的细胞可以置于细胞裂解液中,通过简单的涡旋震荡来匀浆;而动物组织、植物组织、酵母和细菌、真菌则常常需要更加剧烈的方法,通常用液氮研磨。比如说细菌(特别是革兰氏阳性菌)的细胞壁,就需要溶菌酶消化来实现彻底的细胞裂解和RNA的最大回收,酵母提取时加入破壁酶帮助破壁,再用TRIpure或RNApure进行提取。5. RNA提取少走弯路——不同材料如何选择最适RNA提取试剂现有众多的RNA分离方法也许令人难以取舍。目前最简单也是最安全的方法是柱式分离,如RNApure 因为操作简单,时间短,纯度高而受到大家的喜爱,RNApure不需要DNA酶消化DNA,节省了时间,避免RNA的降解,从而提高了产量;相对非柱式分离(如TRIzol),去除蛋白及其他杂质干净,提高了纯度,对于细胞、组织、一般植物均非常适合。植物RNA的提取比较难抉择,植物RNA提取受酚、多糖、蛋白杂质、次生代谢物含量的影响,一般用TRIzol提取纯度不高,而且很多植物用TRIzol提取不出来。这时候可以选择多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(水仙、辣椒、胡萝卜、玉米、百合、小麦、西红柿、花菜、油菜等)和通用植物RNA提取试剂盒(适合绝大多数植物提取,包括:各种中草药、植物种子、苹果、葡萄、草莓、香蕉、龙眼、荔枝、草坪植物、松树、杉树、白桦、紫松果、彩叶草、一品红、夹竹桃、垂叶榕、紫罗兰、月季、天竺蓝、牵牛花等);非常值得一提的是血液(包括血清、血浆、脑脊液、各种拭子或其他液体含量高的样本)RNA的提取用TRIzol和红细胞裂解的方法效果都不好,因为红细胞裂解液不含有RNA酶的抑制成分,这个过程RNA很容易降解,推荐使用TRIpure LS (RP1101)或者血液总RNA提取试剂盒(RP4001),该方法适用于表达谱芯片实验中RNA的提取,并成为博奥生物芯片北京国家工程研究中心的推荐方法: 著名实验室推荐:全血RNA提取 6. 低浓度RNA的沉淀纯化得到的RNA可能需要通过沉淀来浓缩,以满足一些下游应用的需要。醋酸铵(NH4OAc) 沉淀(加0.1体积的5M 醋酸铵、2-2.5体积的无水乙醇,-20°C放置25分钟以上)可以很好地回收RNA。如果需要定量回收低浓度的RNA(ng/ml),可以采用共沉淀(如linear acrylamide糖原glycogen,、酵母yeast RNA )的方法。核酸助沉剂是linear acrylamide,当RNA用于RT-PCR分析时,线性的丙烯酰胺和DNase处理的糖原都可以作为理想的共沉淀剂,因为它们都不含DNA污染,糖原含量高会抑制PCR反应,应注意控制浓度,核酸助沉剂对PCR无影响,成为病毒核酸提取的首选。酵母RNA和未处理的糖原会给样品带来核酸污染,有可能影响RT-PCR的结果。沉淀后,注意避免RNA沉淀过分干燥,因为这可能导致很难重新溶解。7. 提取好的RNA如何储存如果只是短期储存,重悬的RNA应放置于-20°C;如果是长期储存的话,就应该放置于-80°C。储存RNA时,可以加入少量的RNA酶抑制剂(RP5601),避免RNA的降解,RNA可以直接做下游实验。如果要长期保存RNA,可以加入RNAlong。我们推荐将RNA溶液分装在几支管中。这会避免反复冻融损伤RNA,并预防偶然的RNase污染。
细菌DNA的提取2006-10-24 17:19这里提供的是由Marmur于1961年建立,经Dale等人简化和发展,此方法略加修改后可用于其他细菌种类。主要原理是:采用去垢剂破碎细菌细胞,酚-氯仿萃取蛋白,使用核糖核酸酶和蛋白酶K进行进一步的纯化,所提取的DNA无RNA和蛋白质污染,可用于限制性内切酶消化,分子克隆。⑴材料①20倍SSC缓冲液:3mol/l NaCl; 0.3mol/l 醋酸钠;pH 7.0(高压灭菌后,4摄氏度保存可长期使用)②酚/氯仿(1:1):一般市售的酚需要重蒸处理,市售的酚常含有杂质而呈粉色和淡黄色,需要重蒸二次,收集沸点160℃部分,小瓶分装,瓶内空腔充氮气,-20℃密封保存,以免氧化,用前从冰箱中取出,68℃蒸馏水饱和,加入8—羟基喹啉(100g酚加0.1g),酚变为黄色。8—羟基喹啉是抗氧化剂,并能部分抑制核糖核酸酶,含8—羟基喹啉的酚用等体积1.0mol/L pH 8.0Tris 缓冲液抽提,再用0.1mol/L pH 8.0含0.2%β-巯基乙醇的Tris缓冲液抽提数次,酚溶液的pH应大于7.6。此酚溶液在平衡缓冲液覆盖下4℃可保存一个月,纯化和制备酚溶液都要带手套,以免损伤皮肤。③核糖核酸酶:无DNA酶污染,将胰RNA酶(RNA酶A)溶于10mmol/LTris-Cl(pH 7.5)15mmol/L Nacl 溶液中,浓度为10mg/ml.于100℃加热15分钟,缓慢冷却至室温,分装后于-20℃保存。④蛋白酶K ⑤TES缓冲液:10mmol/L Tris-HCl, pH 8.0; 10mmol/L NaCl;1mmol/l EDTA⑵方法①取单菌落接种于5mlLB培养液中,37℃振荡培养过夜。(使用试管)②将上述菌液接种于200mlLB培养液中,37℃振荡培养过夜。(使用500ml或1000ml三角瓶)③离心,收集沉淀(5000r/m,10分钟)④将沉淀悬浮于20ml 20倍SSC缓冲液中,混匀。⑤加入200mg SDS,室温下振荡过夜,使细菌细胞充分裂解,裂解液呈粘稠状⑥加入等体积的酚/氯仿溶液,温和地混匀,细心地回收上层水相(注意不要触及二相之界面),重复萃取三次⑦加入2倍体积无水乙醇,此时可见到絮状DNA沉淀或用玻璃棒绕取收集⑧将DNA溶于15ml 2倍SSC溶液中,加入核糖核酸酶(最终浓度50ug/ml),37℃保温1小时⑨加入蛋白酶K(50ug/ml),继续保温1小时⑩加入等体积苯酚萃取一次,在回收的水相中加入2.5倍体积的无水乙醇,-20℃静止过夜25000g,4℃,离心15分钟,收集沉淀,用-20℃无水乙醇洗涤一次;将DNA在真空干燥器中抽干,溶于10mlTES缓冲液中,4℃保存备用。⑶说明①本方法可用于其他种类细菌,但是溶菌条件需略加修改,对革兰氏阳性菌(如葡萄球菌),在SDS处理前需要使用溶菌酶裂解细胞壁,对于另外一些细菌(如分枝杆菌),在加入SDS后,将溶液加温至65℃是可取的。②一些种类的细菌含大量核酸酶,去垢剂不能完全抑制其活性,用TES缓冲液代替SSC缓冲液可通过EDTA的作用抑制核酸酶活性,必须注意的是,TES缓冲液离子强度较低,在加入乙醇之前需用醋酸钠调节DNA溶液的离子强度(醋酸钠的最终浓度为0.3mol/L)③DNA溶液中残留少量酚和氯仿,可在乙醇沉淀之前用水饱和乙醚萃取去除④比较纯净的DNA溶液的A260/A280及A260/A235大于1.7
[size=18px]创安盛交通生产核酸亭,核酸站,核酸舱,移动方舱,核酸工作站,[b][url=http://www.gongjiaozhanting.com]核酸检测亭[/url][/b],核酸检测站,核酸采样亭,核酸采样站厂家定制。欢迎来到创安盛www.gongjiaozhanting.com来电咨询,让您更好的了解产品。马卡龙般的清新配色、饱满圆润的憨厚外形、舒适安全的封闭舱体,小小的核酸采样亭,不仅为医务人员提供更好的工作环境,也给前来检测的居民带来更多便利。采样亭在疫情之后,还能转换成其他公服设施,继续为城市服务。近日从西城区了解到,新一代核酸采样亭“西城盒子”正式亮相,该批次共有62座“西城盒子”将陆续投放西城区街头。采样亭别出心裁 “城市家具”品质再提升在金融街购物中心一旁的凉爽树荫下,一座浅绿色的“大盒子”静静伫立。开关启动,遮阳板通过电动液压杆缓缓翻开,形成遮阳挡雨的棚架,遮阳板下的操作台,可以摆放多种用具。[img=,690,517]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/08/202208252043079113_5880_5806756_3.jpg!w690x517.jpg[/img][img=,690,517]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/08/202208252043232695_6623_5806756_3.jpg!w690x517.jpg[/img][img=,690,517]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/08/202208252043382232_7794_5806756_3.jpg!w690x517.jpg[/img][img=,690,517]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/08/202208252043507204_2781_5806756_3.jpg!w690x517.jpg[/img][img=,690,625]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/08/202208252043512515_6258_5806756_3.jpg!w690x625.jpg[/img]采样点通过窗口形式提供服务,采样人员每完成一次采样后随即进行消毒。在排队等候区,工作人员指引市民完成核酸码登记,没有核酸码的市民可用身份证进行现场登记。在公园,人民医院新设的便民核酸采样亭前,一些外卖小哥正在等候采样。“以前是要到医院里才能采样,现在在公园里辟出区域进行核酸采样,就不用和就医人员一起了,方便了不少。”外卖小哥说,以往总要等上个十多分钟,现在只要三五分钟就能完成采样。“我们医院也保留了核酸采样窗口,主要服务就医患者,在公园新设的采样点,也是为了方便复工复产人员、外卖骑手和有需求的居民。[/size]
[font=-apple-system, BlinkMacSystemFont, &][size=18px]23日,北京冬奥会和冬残奥会第二版防疫手册发布,规定闭环内人员每日需进行核酸检测。[/size][/font]
核酸药物又称核苷酸类药物,主要在基因水平上发挥作用。核酸类药物可直接作用于引起疾病的分子,并通过调节身体功能缓解疾病的症状,而无需操纵基因组,目前在抗病毒、抗肿瘤、抗代谢紊乱方面显示了独有的作用。目前,国内外核酸药物产业如火如荼,呈爆发之势,但核酸药物产业仍存在亟待解决的技术壁垒。 为加强核酸药物相关研发及分析检测技术和创新方法的交流,从而推动中国核酸药物产业快速发展,仪器信息网将于2021年7月6日举办“核酸药物研发与分析检测技术”主题网络研讨会,会议将邀请多位业内专家做精彩报告,为广大从事生物制药研发工作的用户搭建一个即时、高效的交流和学习的平台。https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/07/202107020945525287_7888_2507958_3.jpg!w690x151.jpg会议日程:https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/07/202107020947424236_7198_2507958_3.png!w690x320.jpg点击链接,免费参会!!!https://insevent.instrument.com.cn/t/Lh
从前乡愁就是一张张火车票我在这头故乡在那头。现在乡愁是一张张核酸证明我在这头故乡说:你就在那头吧,别回这头!
[quote][b]项目概况[/b]新冠病毒核酸检测试剂耗材采购项目 招标项目的潜在投标人应在广州市环市东路472号粤海大厦7楼获取招标文件,并于2022年11月16日 09点30分(北京时间)前递交投标文件。[/quote][font=inherit]一、项目基本情况[/font]项目编号:CLF0122GZ13ZC56项目名称:新冠病毒核酸检测试剂耗材采购项目预算金额:120.0000000 万元(人民币)采购需求:1.采购项目一览表[table][tr][td][align=center][font=inherit]包组[/font][/align][/td][td][align=center][font=inherit]采购内容[/font][/align][/td][td][align=center][font=inherit]数量[/font][/align][/td][td][align=center][font=inherit]单价最高限价[/font][/align][align=center][font=inherit](人民币 元)[/font][/align][/td][/tr][tr][td=1,2][align=center]包组一[/align][/td][td][align=center]新冠病毒核酸提取试剂1[/align][/td][td][align=center]65000份[/align][/td][td][align=center]2.00[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]新冠病毒核酸提取试剂2[/align][/td][td][align=center]65000份[/align][/td][td][align=center]2.00[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]包组二[/align][/td][td][align=center]新冠病毒核酸检测试剂3[/align][/td][td][align=center]100000份[/align][/td][td][align=center]5.00[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]包组三[/align][/td][td][align=center]新冠病毒核酸检测试剂4[/align][/td][td][align=center]30000份[/align][/td][td][align=center]5.00[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]包组四[/align][/td][td][align=center]新冠病毒核酸检测试剂5[/align][/td][td][align=center]10000份[/align][/td][td][align=center]5.00[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]包组五[/align][/td][td][align=center]新冠病毒核酸弱阳性质控[/align][/td][td][align=center]60盒[/align][/td][td][align=center]2000.00[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]包组六[/align][/td][td][align=center]新冠病毒核酸检测耗材[/align][/td][td][align=center]1批[/align][/td][td][align=center]120000.00[/align][/td][/tr][/table]2.本项目只允许采购本国产品;3.简要技术要求:本项目为采购人提供新冠病毒核酸检测试剂及耗材。具体详见采购需求。4.政府采购监督管理部门为财政部国库司政府采购监管处合同履行期限:自合同签订之日起1年,按实际供货数量结合实际中标单价进行结算,不排除因新冠疫情结束,终止合同的可能。本项目( 不接受 )联合体投标。
五季智能核酸采样亭的消毒简单方便。室内采用紫外线杀毒,可以在工作前对采样亭进行自助消毒,并确保无菌和卫生。采样人员在核酸采样亭内与外部人员不产生直接接触,医废和垃圾会进行消杀并进行统一回收处理,不会对周边环境造成影响。采样人员通过特制的手套来采集样本,并透过玻璃进行观察。样品采集后,采样人员将样本直接放样本存储区内,大大减少了面对面接触,避免了触摸和呼吸造成的感染。[align=center][img=单人核酸采样工作站,690,460]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/05/202205281424200807_3234_5635765_3.jpg!w690x460.jpg[/img][/align]具体点位选择以室外空旷、手机信号强、通风良好、面积较大为参考标准,可设置在社区卫生服务站、学校操场、体育场、楼宇园区广场、社区空地等。核酸采样场所应划分为等候区、扫码区和采样区,有效分散待检人员密度。每采样点设1-2个工位,每天1-2班,可根据采样人数需求及时增减。与传统核酸采样不同,医护人员在核酸采样亭内与居民无接触即可完成信息登记和采样操作。[align=center][img=移动核酸采样工作站,690,566]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/05/202205281424511064_5867_5635765_3.jpg!w690x566.jpg[/img][/align]如遇正在开展采样的核酸采样亭,建议市民与排队做核酸的人员保持两米以上距离,以避免人员聚集所带来的危险。目前市面上出售的岗亭以单人操作和双人操作两种规格为主,主要配备的设施包括空调、对讲机、紫外消毒设备、离心风机、过滤器等,每台核酸检测亭都配有空调一台。尽管核酸采样亭已在多地铺设,但目前相关的配置规范和标准仍较少,仅有个别地市如无锡市出台了相关管理规范,对采样亭的选址、设施配套、人员配备等作出明确。核酸检测采样亭配置规范需要根据行业标准去制定,比如负压要求、空调设备要求、采样隔离要求等。杭州、广州、无锡等地比上海更早开始布局建设,相关标准也在参考前人经验。核酸采样亭的快速布局落地,势必给全民的工作生活带来极大的方便,助力全国的精准防疫。五季智能核酸采样亭厂家——欢迎咨询17201681858[align=center][img=便民核酸采样小屋,690,690]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/05/202205281425565485_2290_5635765_3.jpg!w690x690.jpg[/img][/align]
试验原理:煮沸法是根据Holmex和Quigley(1985)的方法改进而成的。在基因工程中, DNA 分子的切割是由限制性内切酶 来完成的。限制性内切酶 能识别特定的 DNA 序列,在一定的条件下切断双链 DNA 。限制性内切酶的作用效率是受多方面因素影响的,如反应温度,缓冲体系,离子种类与浓度, DNA 的纯度和甲基化程度等。对 DNA 进行酶切时,首先要选择适合的缓冲液。对于单酶切,应选用该酶的最适缓冲液;对于双酶切或三酶切,应选用一种能使所有酶都充分作用的缓冲液。 DNA 的纯度对于酶切的效果的影响也很大,因为蛋白质、酚、氯仿、 SDS 等杂质都会抑制限制性内切酶的活性。琼脂 糖凝胶电泳是分离,鉴定和纯化 DNA 的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料 - 溴化乙锭进行染色,可确定 DNA 在凝胶中的位置。如有必要,还可以从凝胶中 回收 DNA 条带,用于各种克隆操作。琼脂 糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低,但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为 200bp 至近 50kbp 的 DNA 。长度 100kb 或更大的 DNA ,可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。在基因工程的常规操作中,琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置,在强度和方向恒定的电场下进行电泳。 DNA 分子在凝胶缓冲液(一般为碱性)中带负电荷,在电场中由负极向正极迁移。 DNA 分子迁移的速率受分子大小,构象。电场强度和方向,碱基组成,温度和嵌入染料等因素的影响。实验准备:1、70% 乙醇( -20 ℃)及无水乙醇( -20 ℃)2、STET 缓冲液(pH8.0 )( 8% 蔗糖, 0.5%Triton, 50mmol/L EDTA ,,10mmol/L Tris )3、1.2M 氯化钠4、TE 缓冲液(10mmol/L Tris -HCl, 1mmol/L EDTA )5、STET:0.1mol/L NaCl,10mmol/L TrisCl(pH8.0),1mmol/L EDTA(pH8.0),5%Triton X-10(其他同碱裂解法)试验步骤:1、无菌操作台上取1.5ml培养菌体置于离心管 (Eppendorf管)中,微量离心机 上10000rpm离心1min,或者以4000rpm离心5-10min,弃上清液,倒扣于干净的吸水纸上吸干。2、将菌体沉淀悬浮于350μl STET缓冲溶液中, 涡旋使其混匀。3、加入25μl新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制), 涡旋振荡大概3秒钟。4、将eppendorf管放入沸水浴 中,40秒后立即取出。5、微量离心机 上以4℃,12000rmp离心10min。6、用无菌牙签从eppendorf管中挑去细菌碎片。7、在上清中加入40μl 5mol/L乙酸钠(pH5.2)和420μl异丙醇,振荡混匀,于室温放置5min。8、微量离心机上以4℃,12 000rmp离心5min,回收核酸沉淀。小心吸去上清液,将离心管 倒置于一张纸巾上,以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。(可参考裂解法中的做法)。9、加入1ml70%乙醇,以4℃,12 000rmp离心2min。轻轻地吸去上清,这一步操作要格外小心,有时沉淀块贴壁不紧,去除管壁上形成的所有乙醇液滴,室温下放置,直至乙醇挥发完全,管内无可见的液体为止(大概需要2-5min)。10、用50μl无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE(pH8.0)溶解核酸,稍加振荡即可,贮存于-20℃。注意事项:1、大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。2、添加溶菌酶一定要有限度,浓度过高细菌裂解效果反而不好,有时不同溶菌酶也能溶菌。3、提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚克隆及连接反应等。4、试验步骤中的细菌沉淀和核酸沉淀中去除上清液时,一定要除尽。5、用 70% 的乙醇溶液洗涤核酸沉淀时一定要十分谨慎,防止将核酸同洗液一起倒掉。6、实验过程中所用的器皿和吸头 都要进行高压灭菌。7、当从表达内切核酸酶 A的大肠杆菌株(endA+株,如HB101 )中小量制粒DNA时,建议不用煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶 A,在Mg2+存在下温育(V中用限制酶时)质粒DNA可被降解。若要避免这一问题可以在用70%乙醇洗涤一步前增加一步用酚/氯仿进行抽提。8、如果要通过限酶切割反应来分析DNA,可取1μlDNA溶液加到另一个含8μl水的微量离心管内,加1μl 10x限制酶缓冲液和1单位所需限制酶,在适宜温度温育1-2h。将剩余的DNA贮存于-20℃。通过凝胶电泳分析经限制酸消化的DNA段。如果小量制备的DNA不被限制酶切开,很有可能在收获细菌的步骤中未能很好地去除所有上清液体。这种情况下,可用酚:氯仿抽提DNA终产物,然后用乙醇重新沉淀 DNA,通常,用5-10倍过量的酶(特别是并不昂贵的酶)在100-200μl 体积中进行消化,可以克服限制酶切割反应遇到切割反应遇到的困难。消化后, 加0. 1 体积3mol/L乙酸钠(pH5.2)和2倍体积乙醇沉淀DNA。