细胞凋亡分析

摘要：细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。一、细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。1. 光学显微镜和倒置显微镜(1) 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。(2) 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。2. 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与 DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1）。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1376376278_small.jpg3 透射电子显微镜观察结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1376376295_small.jpg二、磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法)磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1376376296_small.jpg方法1. 悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞(0.5~1×106)用PBS洗2次，加入100 ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V(20ug/ml)10 ul，室温避光30 min，再加入PI(50 ug/ml)5 ul，避光反应5 min后，加入400 ul Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测(一般不超过1 h)， 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。2. 贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。3. 爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。结果 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1376376298_small.jpg http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1376376300_small.jpg

一、实验目的1、掌屋凋亡细胞的形态特征 　　2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的特征。相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正常细胞。细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA中，使坏死细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。Hoechst33342是一种活性荧光染料且毒性较弱，它是双苯并咪唑的一种衍生物。与DNA特异结合（主要结合于A-T）碱基区），显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。三、实验用品1、试剂：三尖杉酯碱（HT），300μg/ml，100mmol/L Tris-HCl（pH7.5），5mol/L EDTA缓冲液、碱性裂解液：0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸钠：3mol/L KAc（pH4.8）；异丙醇；70%乙醇；溴酚蓝，蔗糖指示剂。TBE电泳缓冲液，1%琼脂糖，溴乙锭。PI母液：500μg/ml；Ho33342母液：2mmol/L。 　　2、仪器设备：荧光显微镜，电泳仪，电泳槽，微量加样器（1ml，100μl）0.5、1.5ml离心管，载玻片，盖玻片。四、实验材料人早幼粒白血病HL-60细胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培养基在37℃，5%CO2条件下培养。五、方法步骤 1、三尖杉酯碱诱发HL-60细胞凋亡 　　（1）实验前约24小时，接种两瓶HL-60细胞，标记①、②，每瓶含约6ml培养液，置37℃，5%CO2培养箱培养。 　　（2）实验前约2.5小时，当细胞密度达到70%，①号瓶加入三尖杉酯碱200μl，使终浓度为1μg/ml，②号瓶中加入同等量PBS（pH7.4）作对照。共同放入培养箱中继续培养2.5小时。2、Ho33342和PI双重染色鉴别三种细胞 　　（1）染色：将瓶中的细胞摇匀取200μl于1.5ml的离心管中，加入Ho33342母液2μl，PI 20μl，染色15分钟。 　　（2）滴片：取一载玻片用双面胶围成一小室，从离心管中各取以上染色后的细胞悬液10μl，加入小室内盖上盖玻片，荧光镜下用紫外激发光，高倍镜下观察，区别三种细胞，并注意三者比例。六、注意事项1、诱导培养HL-60细胞时间要准确；　　2、荧光显微镜下观察细胞时，由于荧光易碎灭，观察时要尽量快。

西达本胺通过信号通路调节促进癌细胞凋亡在我国，西达本胺已获批作为PTCL临床用药。西达本胺属于苯酰胺类化合物，是我国自主研发的首个亚型选择性口服HDACI，国家食品药品监督管理局已批准其用于临床试验，其选择性抑制I类HDAC1、2、3亚型和II类HDAC10亚型，可抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡，阻滞周期、引发DNA损伤，还可以增强抗肿瘤免疫反应。与其他抗肿瘤药物相比，西达本胺疗效好、选择性高、不良反应少。西达本胺可激活死亡受体途径和线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡，其中最为主要的是线粒体凋亡途径，该途径受Bcl-2家族介导的细胞色素C释放通路调控。抗凋亡蛋白Bcl-2表达受到抑制，促凋亡蛋白Bax表达上调，使线粒体膜电位降低，细胞色素C释放到细胞质中，Caspase途径被激活，细胞发生凋亡。例如：西达本胺增强B淋巴瘤细胞组蛋白H3、H4 乙酰化水平，使线粒体膜电位降低随后激活Caspase 3，促进细胞凋亡；在肾癌中，它可以下调Bcl-2表达，上调Bax表达，随着药物浓度增加引起786-O 细胞凋亡。西达本胺可以调控ROS水平。HDACI可以上调ROS水平，导致DNA双链损伤。研究证明，西达本胺作用于白血病细胞后，诱导细胞内ROS产生，细胞凋亡增加[17]。此外，在胰腺癌细胞系中，西达本胺明显增强细胞内ROS的产生，上调γH2AX（DNA双链断裂的标志物）表达水平，诱发细胞DNA损伤。西达本胺通过调控细胞周期蛋白（Cyclin）、细胞周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-dependent kinases，CDKs）以及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（Cyclin-dependent kinases inhibition，CDKI）的表达阻滞细胞周期。例如，西达本胺使MM细胞系P21、P27的表达量增高，CDK4、CDK6、Cyclin D2表达量下降，阻滞MM细胞系于G1期[19]。在NK/T细胞淋巴瘤中，西达本胺上调P21表达，下调Cyclin E表达，诱导细胞发生G0/G1期阻滞，从而抑制细胞的增殖。

http://gene.bjmu.edu.cn/news/ap1.gif 　　细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。 一、细胞凋亡的形态学检测 　　根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 　　1 光学显微镜和倒置显微镜 　　（1） 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。 贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 　　（2） 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割 成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 　　2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 　　一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 　　常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与　DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 　　Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。 　　DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。　　结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。 　　3 透射电子显微镜观察 　　结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

摘要激光扫描共聚焦显微镜作为80年代发展起来的一种高精度分子细胞生物学分析仪器，具有组织细胞断层扫描、活细胞动态荧光监测、三维图像重建、共聚焦图像定量分析等先进功能，在近年的细胞凋亡这一研究热点中得到了大量创造性的应用。本文拟就对激光扫描共聚焦显微镜在凋亡的形态学、分子水平变化及重要生理过程三方面研究中的应用及其成果做一综述。细胞凋亡(apoptosis)是不同于细胞坏死的一种细胞主动死亡方式，并由特定的基因控制。凋亡细胞在形态上出现变圆皱缩、染色质浓缩边集、核碎裂、凋亡小体形成等变化，并最终由非炎症过程清除。由于细胞凋亡独特地影响着机体的细胞发育和代谢，在监测和清除肿瘤细胞与突变细胞等方面也可能发挥重要的作用，近年来受到了细胞生物学、分子生物学、免疫学等多学科的广泛关注。激光扫描共聚焦显微镜(laser scaing confocal microscopy, LSCM)是80年代发展起来的一种高精度分子细胞生物学分析仪器，辅以各类免疫荧光探针或荧光染料与被测物质特异性结合，不仅可观察固定的细胞组织切片，还可对活细胞的结构、分子和离子进行实时动态地观察和检测。在细胞凋亡的研究中，激光扫描共聚焦显微镜已被广泛地应用于形态学、分子水平监测及重要生理改变等各方面，其中不乏新颖之处，并获得了大量成果，以下将就此做一简单的介绍。激光扫描共聚焦显微镜与凋亡的形态学激光扫描共聚焦显微镜用点光源扫描标本的光学横断面，以代替普通光学显微镜所使用的场光源，并用探测针孔滤去离焦光线，所以消除了来自焦平面以外的衍射或散射光的干扰，可实现高清晰、高分辨率的组织细胞断层扫描。并且由于激光扫描共聚焦显微镜采用数字化成像，因而辅以一定的软件就能对图像进行定量分析及三维重建等操作。过去对细胞凋亡的形态学研究方法局限于活性细胞和组织切片染色、荧光镜观察，或者石蜡切片原位末端标记法。由于普通光镜的分辨率和清晰度有限，而电镜又显然不适合对凋亡这一复杂动态过程的监测，激光扫描共聚焦显微镜的应用使人们对细胞凋亡的形态学观察分析提高到了一个前所未有的新水平。细胞核核膜的破坏对于染色质聚集并形成凋亡小体起重要作用。lamin是构成核片层的蛋白质，位于核膜的内表面，由caase-6介导的lamin裂解可影响核膜的完整性。在McCall等的研究中，对果蝇卵子发生晚期的细胞凋亡现象进行了动态观察。以单抗mAb101标记其哺育细胞核内膜的laminDm0（哺乳类laminB的同源体），用激光扫描共聚焦显微镜加以观察。正常哺育细胞到11期时，染色的lamin呈弥散的雾状分布并围绕核周，而dcp-1GLC哺育细胞即使到了较晚的14期时，仍然显示界线明确的染色。可见dcp-1突变体在核lamin蛋白的酶切或解聚方面存在缺陷。细胞器Li 等在对C(6)-酰基鞘氨醇诱导胞内囊泡产生的研究中，在不产生中毒效应的情况下，加入10microM C(6)-酰基鞘氨醇以诱导鼠纤维母细胞(3T3-L1和3T3-F442A)凋亡。观察到囊泡的形成与C(6)-酰基鞘氨醇的诱导呈时间依从和剂量依从关系。大量小泡在其加入后8小时内出现，并且随时间而增大；大泡最终分布在核周，而小泡分布在细胞边缘。用抗-溶酶体膜蛋白抗体和共聚焦免疫荧光显微分析，证明增大的囊泡为晚期内吞体/溶酶体。另外，胞内的细胞器都有其适用的荧光探针，如高尔基复合体常用的探针有Dceramide、BODIPY ceramide等，内质网常用的有Dil、DiOC6等，经标记均可进行精细的观察。当然，激光扫描共聚焦显微镜在形态学中的优势更在于其对图像的三维重建功能，从而揭示过去只能在平面上显现的凋亡细胞在三维空间中的结构；而对细胞凋亡的动态过程，它可以用三维加时间的四维方式进行观察，来获取最逼真的形态学资料。凋亡过程中一些特征性的三维形态变化正期待着进一步具体的工作去发现。激光扫描共聚焦显微镜对凋亡细胞的分子水平监测随着分子生物学突飞猛进的发展，关于细胞凋亡分子机制的研究已有了很大的突破。细胞凋亡的信号传递途径及其调控涉及到大量的酶级联反应、生物大分子的空间转移等。而激光扫描共聚焦显微镜以其定性、定量、定时的优点，结合众多荧光探针的应用，成为了研究细胞凋亡分子水平变化的有力手段。DNA大分子DNA断裂以及染色质的异常凝聚，是细胞凋亡的关键，同时也是细胞核在细胞凋亡中具有标志性的变化。Columbara等报道将激光扫描共聚焦显微镜与原位TdT和Poll免疫荧光技术相结合，进而确定双链和单链DNA的断裂点。而在对细胞凋亡和细胞坏死区别的研究中，Kreel等在培养的K562细胞中加入放线菌素D以诱导凋亡，并对细胞的DNA片段进行了3’-末端标记。经激光扫描共聚焦显微镜观察发现K562细胞凋亡早期有大量DNA片段出现，且DNA片段弥散分布于除核仁外的细胞核区。伴随着凋亡的进展，细胞核内出现大量高标记密度的圆形小体。而采用NaN3或快速冻融法使细胞坏死，经激光扫描共聚焦显微镜观察证实，在坏死开始阶段并无DNA片段的出现，至少在坏死发生24小时后才有DNA片段产生。Caase家族Caases是一组高度保守的半胱氨酸蛋白酶，目前发现有11个成员。多数细胞凋亡是以Caase家族蛋白的激活并作用于其关键底物而实现的，而caases激活的关键又在于该家族蛋白间的级联反应，因此caases被认为是细胞凋亡的中心环节和执行者，成为研究的热点。Mandal等用激光扫描共聚焦显微镜对细胞凋亡中激活的caase-3的重分布进行了研究。用丁酸处理细胞后，观察到DNA-PKcs的裂解与caase-3的激活成正相关，而Bcl-2的过度表达则可抑制上述两个过程。同时还证明（1）激活后的caase-3重分布到核区，（2）裂解局部的DNA-PKcs和PARP（polyADP-ribosepolymerase，聚腺苷二磷酸核糖多聚酶），（3）裂解产物又被释放到核外的细胞液。caase-3的抑制物四肽DEVD-CHO又可抑制上述的三个连续的步骤。该研究提示：激活的caase-3在核内的重分布构成了丁酸所诱导的细胞凋亡中的一个重要凋亡信号。另外，在用激光扫描共聚焦显微镜对Q79诱导大鼠神经元凋亡的研究中，Sanchez等发现了Q79对caase-8的聚集和激活，而对caase-8的抑制则阻止了被诱导的细胞凋亡；加以Westernblot分析，还建立了caase-8的激活和某些神经退行性疾病（如舞蹈病）的联系。Grazyme丝氨酸蛋白酶grazyme为另一种重要的凋亡信号分子，对某些caase家族蛋白也有激活作用。Trapani等就证明了杀伤淋巴细胞利用穿孔素和grazymeB的协同作用来诱导靶细胞的凋亡，在其研究中通过激光扫描共聚焦显微镜观察到（1）50%细胞的胞核内快速聚集了以FITC荧光标记的grazymeB（最长7分钟，t1/2为2分钟），然后发生凋亡；（2）其它的细胞只有细胞液内有FITC-grazyme B的摄取，避免了凋亡。此间至少在13分钟后才有DNA碎片的出现，说明核内的grazyme B聚集出现在凋亡的执行阶段之前。并且通过对核内液的处理（加入70KDa FITC-dextran），间接观察到grazyme B的转移并非是因为核膜受caases的作用而破损，而是由于穿孔素的协同。其它以上的介绍显示，激光扫描共聚焦显微镜在检测活细胞酶活性动态变化方面有着突出的优势。实际上，对于细胞凋亡的分子机制这样一个极其复杂的课题，激光扫描共聚焦显微镜的应用远不只限于上述的几种离子和大分子，而是渗透到了大量的分枝课题中去。如在对重要的凋亡负调控蛋白Bcl-2的研究中，Beham等利用基因毒性损害（genotoxic damage）诱导细胞凋亡，并以Bcl-2蛋白抑制其凋亡过程。用激光扫描共聚焦显微镜和Immunoblotting观察显示，Bcl-2的作用在于阻止了诱导产生的p53蛋白向核内的转运。而Ohsawa等对独立于caase家族的另一种重要蛋白酶—组织蛋白酶进行了研究，用血清剥夺法诱导PC12细胞凋亡，并用激光扫描共聚焦显微镜监测了其精细超微结构改变过程和细胞内组织蛋白酶B和D的免疫活度的对比变化。又如，在人胰岛淀粉样多肽（hIA）的研究中，Hiddinga等用表达hIA的质粒转染COS-1细胞诱导凋亡，辅以免疫组化染色，用激光扫描共聚焦显微镜证明了hIA在细胞的内质网和高尔基复合体内呈簇状沉积，并与细胞

[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=52162]流式细胞仪检测凋亡[/url][em03] [em03] [em04] [em04]

[size=3][font=Times New Roman]1. [/font][font=宋体]附着细胞的凋亡研究：在悬液中的细胞比贴壁细胞更容易发生凋亡，建议在用胰蛋白酶处理前单独收集培养液中悬浮的细胞。[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]2.[/font][font=宋体]固定剂的影响：在做[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]断裂片段分析凋亡细胞时（如[/font][font=Times New Roman]APO-BRDU[/font][font=宋体]、[/font][font=Times New Roman]APO-DIRECT[/font][font=宋体]），要注意使用化学固定剂（如多聚甲醛）固定细胞，使[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]交联。原因是：在洗细胞的步骤中，未固定的细胞可能会丢失小的[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]片段，而使用化学试剂固定后的细胞，小[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]片段就不会丢失。建议做[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]断裂片段分析细胞系时，比较不同的固定剂和破膜剂的效果。[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]3.[/font][font=宋体]为了减少细胞丢失，染色、分析时建议使用[/font][font=Times New Roman]12[/font][font=宋体]′[/font][font=Times New Roman]75mm[/font][font=宋体]聚苯乙烯管。其它类型的试管（如聚丙烯管），会使细胞在管壁堆积，造成细胞丢失，并影响染色效果。洗细胞后，建议轻轻药匀细胞沉淀，避免使用加液枪，以免由于塑料枪头的使用造成细胞损失。[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]4.[/font][font=宋体]洗细胞时应注意应洗到管壁内侧细胞可能附着的位置，使细胞充分悬浮。这样可以避免在随后的染色步骤中，由于细胞贴壁或悬着不充分，造成细胞染色不均一。如果细胞染色不均，在荧光参数分析时，表现为双峰现象，即多出一群着色弱的细胞。[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]5.[/font][font=宋体]做[/font][font=Times New Roman]APO-BRDU[/font][font=宋体]或[/font][font=Times New Roman]APO-DIRECT[/font][font=宋体]分析时，若发现染色荧光弱，可以适当延长[/font][font=Times New Roman]BrdU[/font][font=宋体]掺入反应的时间。一些细胞的反应时间可以到[/font][font=Times New Roman]37[/font][font=宋体]°[/font][font=Times New Roman]C 4[/font][font=宋体]小时。[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]6.[/font][font=宋体]做[/font][font=Times New Roman]APO-BRDU[/font][font=宋体]或[/font][font=Times New Roman]APO-DIRECT[/font][font=宋体]分析时，可以结合[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]染色，研究凋亡与细胞[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]周期的关系。[/font][/size]

[size=3][font=宋体]基本原理[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=宋体]细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]）从细胞膜内转移到细胞膜外，使[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]暴露在细胞膜外表面。[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]暴露在细胞膜外。[/font][font=Times New Roman]Annexin V[/font][font=宋体]是一种[/font][font=Times New Roman]Ca+[/font][font=宋体]依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，[/font][font=Times New Roman]Annexin V[/font][font=宋体]具有易于结合到磷脂类如[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]的特性。对[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]。[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以建立一种用[/font][font=Times New Roman]Annexin V[/font][font=宋体]结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=宋体]试剂与仪器[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]孵育缓冲液：[/font][font=Times New Roman]10mmol/L HEPES/NaOH[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]PH 7.4[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]140mmol/L NaCl[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]5mmol/L CaCl2 [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]标记液：将[/font][font=Times New Roman]FITC- Annexin V[/font][font=宋体]（宝灵曼公司产品）和[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]加入到孵育缓冲液中，终浓度均为[/font][font=Times New Roman]1ug/ml [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]流式细胞仪[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=宋体]实验步骤[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]1. [/font][font=宋体]细胞收集：悬浮细胞直接收集到[/font][font=Times New Roman]10ml[/font][font=宋体]的离心管中，每样本细胞数为（[/font][font=Times New Roman]1~5[/font][font=宋体]）×[/font][font=Times New Roman]106[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]/mL[/font][font=宋体]　[/font][font=Times New Roman]500~1000r/min[/font][font=宋体]离心[/font][font=Times New Roman]5min[/font][font=宋体]，弃去培养液。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]2. [/font][font=宋体]用孵育缓冲液洗涤[/font][font=Times New Roman]1[/font][font=宋体]次，[/font][font=Times New Roman]500~1000r/min[/font][font=宋体]离心[/font][font=Times New Roman]5min[/font][font=宋体]。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]3. [/font][font=宋体]用[/font][font=Times New Roman]100ul[/font][font=宋体]的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育[/font][font=Times New Roman]10~15min[/font][font=宋体]。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]4. 500~1000r/min[/font][font=宋体]离心[/font][font=Times New Roman]5min[/font][font=宋体]沉淀细胞孵育缓冲液洗[/font][font=Times New Roman]1[/font][font=宋体]次。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]5. [/font][font=宋体]加入荧光（[/font][font=Times New Roman]SA-FLOUS[/font][font=宋体]）溶液[/font][font=Times New Roman]4[/font][font=宋体]℃下孵育[/font][font=Times New Roman]20min[/font][font=宋体]，避光并不时振动。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]6. [/font][font=宋体]流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用[/font][font=Times New Roman]488nm[/font][font=宋体]，用一波长为[/font][font=Times New Roman]515nm[/font][font=宋体]的通带滤器检测[/font][font=Times New Roman]FITC[/font][font=宋体]荧光，另一波长大于[/font][font=Times New Roman]560nm[/font][font=宋体]的滤器检测[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]7. [/font][font=宋体]结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]可被[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（[/font][font=Times New Roman]FITC-/PI-[/font][font=宋体]）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（[/font][font=Times New Roman]FITC+/PI+[/font][font=宋体]）；而右下象限为凋亡细胞，显现（[/font][font=Times New Roman]FITC+/PI-[/font][font=宋体]）。[/font][/size]

[em03] [em03] [em04] [em04] [img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=52163]流式细胞仪检测凋亡２[/url]把一　二放在一个文件夹下然后打开就行！！！

[size=3][font=宋体]基本原理[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=宋体]细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]）从细胞膜内转移到细胞膜外，使[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]暴露在细胞膜外表面。[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]暴露在细胞膜外。[/font][font=Times New Roman]Annexin V[/font][font=宋体]是一种[/font][font=Times New Roman]Ca+[/font][font=宋体]依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，[/font][font=Times New Roman]Annexin V[/font][font=宋体]具有易于结合到磷脂类如[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]的特性。对[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]。[/font][font=Times New Roman]PS[/font][font=宋体]转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以建立一种用[/font][font=Times New Roman]Annexin V[/font][font=宋体]结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=宋体]试剂与仪器[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]孵育缓冲液：[/font][font=Times New Roman]10mmol/L HEPES/NaOH[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]PH 7.4[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]140mmol/L NaCl[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]5mmol/L CaCl2 [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]标记液：将[/font][font=Times New Roman]FITC- Annexin V[/font][font=宋体]（宝灵曼公司产品）和[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]加入到孵育缓冲液中，终浓度均为[/font][font=Times New Roman]1ug/ml [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]流式细胞仪[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=宋体]实验步骤[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]1. [/font][font=宋体]细胞收集：悬浮细胞直接收集到[/font][font=Times New Roman]10ml[/font][font=宋体]的离心管中，每样本细胞数为（[/font][font=Times New Roman]1~5[/font][font=宋体]）×[/font][font=Times New Roman]106[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]/mL[/font][font=宋体]　[/font][font=Times New Roman]500~1000r/min[/font][font=宋体]离心[/font][font=Times New Roman]5min[/font][font=宋体]，弃去培养液。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]2. [/font][font=宋体]用孵育缓冲液洗涤[/font][font=Times New Roman]1[/font][font=宋体]次，[/font][font=Times New Roman]500~1000r/min[/font][font=宋体]离心[/font][font=Times New Roman]5min[/font][font=宋体]。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]3. [/font][font=宋体]用[/font][font=Times New Roman]100ul[/font][font=宋体]的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育[/font][font=Times New Roman]10~15min[/font][font=宋体]。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]4. 500~1000r/min[/font][font=宋体]离心[/font][font=Times New Roman]5min[/font][font=宋体]沉淀细胞孵育缓冲液洗[/font][font=Times New Roman]1[/font][font=宋体]次。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]5. [/font][font=宋体]加入荧光（[/font][font=Times New Roman]SA-FLOUS[/font][font=宋体]）溶液[/font][font=Times New Roman]4[/font][font=宋体]℃下孵育[/font][font=Times New Roman]20min[/font][font=宋体]，避光并不时振动。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]6. [/font][font=宋体]流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用[/font][font=Times New Roman]488nm[/font][font=宋体]，用一波长为[/font][font=Times New Roman]515nm[/font][font=宋体]的通带滤器检测[/font][font=Times New Roman]FITC[/font][font=宋体]荧光，另一波长大于[/font][font=Times New Roman]560nm[/font][font=宋体]的滤器检测[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]。[/font][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]7. [/font][font=宋体]结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]可被[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（[/font][font=Times New Roman]FITC-/PI-[/font][font=宋体]）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（[/font][font=Times New Roman]FITC+/PI+[/font][font=宋体]）；而右下象限为凋亡细胞，显现（[/font][font=Times New Roman]FITC+/PI-[/font][font=宋体]）。[/font][/size]

问题：观察细胞调往用透视电镜还是扫描电镜？回答：应该是用扫描电镜。首先你应该选用24孔板，然后把一个大约边长1厘米的盖玻片（自己用剪刀剪的）保证无菌，放入24孔板的底部，然后把细胞点入培养板，培养过夜，让细胞帖壁于小盖玻片上，然后加药，按照你需要的处置时间，培养48小时，或者是72小时，然后用镊子把小盖玻片拿出来，用固定液固定梯度脱水，染色。最后由电镜专业操作人员在扫描电镜下观察。可以帮你分析是否出现淍亡小体，淍亡小泡等。

与 MSI1 相关的信号通路及凋亡相关机制研究进展Notch 信号通路Notch 信号通路在调节细胞增殖、干细胞维持、胚胎和成人发育期间的分化以及内环境稳定中起着重要作用。MSI1 可以特异性识别并结合 Numb mRNA 的 3'-UTR 区域，促进 Notch 信号通路的异常激活[33]。在肿瘤微环境中，Notch 信号通路起到了至关重要的作用，MSI1 和 Notch 信号通路是乳腺上皮细胞中干细胞不对称分裂的两个关键调节因子，而乳腺上皮干细胞被认为是乳腺癌病因的主要靶点。另有研究显示MSI1 通过激活 Notch 通路促进胶质瘤细胞的发展[35]，在髓母细胞瘤中通过沉默 MSI1下调了 Notch 通路成员 Hes1、Hey2 和 Notch2 的表达，从而抑制了肿瘤的发生发展。在弥漫型胃癌的相关研究中发现，通过 MSI1 调节 Notch 通路中的 delta-1 配体和 Jagged-2 配体的表达来激活 Notch 信号通路，促进肿瘤细胞的发生发展。综上所述，MSI1 通过调节 Notch 信号通路，影响未分化细胞的分化、细胞周期和凋亡等方向和进程，从而促进肿瘤细胞的异常增殖。 Wnt 信号通路Wnt 信号通路控制发育、体内平衡、愈合和再生等各种生物过程[38]。该信号传导缺陷导会致发育缺陷、骨骼疾病和恶性肿瘤[39，40]。在肠道上皮组织稳态平衡中 MSI1 和APC 之间的负反馈起着关键调节作用，APC 是 Wnt 通路的一个组成部分，当 MSI1 表达下调时会增加 APC 的活性，进而导致而 Wnt 信号活性降低，当这种平衡失去时， 就会增加肠道息肉和肿瘤发生[41，42]。Chen[43]等人在肝细胞癌的研究中发现，MSI1 通过直接下调 APC 和 DKK1 激活 Wnt 通路来调节细胞生长和细胞周期。髓母细胞瘤的相关研究发现，电离辐射诱导的尿激酶纤溶酶原激活物受体（uPAR）在 Wnt/β-catenin 信号传导中起作用，并介导髓母细胞瘤细胞系 UW228 和 D283 中肿瘤干细胞（CSC）样特性的诱导，从而促进癌细胞的侵袭、迁移和转移。肿瘤中 MSI1 与 Wnt 信号通路的关系仍需要我们进一步探索。其他信号通路Akt信号参与调节细胞增殖、细胞周期进程、凋亡以及肿瘤细胞与细胞外基质之间的相互作用[44，45]。MSI1可以激活肺癌和胶质母细胞瘤中的AKT信号，从而促进恶性肿瘤[3，30]。敲除 MSI1 可通过上调胶质瘤细胞中的 PTEN 来降低 PI3 激酶 AKT 信号通路的活性[。Hh 信号通路对无脊椎动物和脊椎动物的正常发育至关重要。在哺乳动物的皮肤、神经、肺中 Hh 参与维持体细胞和多能干细胞的修复，当 Hh 途径被启动后能激活靶基因的转录[。在胃癌耐药性的研究中发现，CD44（+）/MSI1（+）的共表达通过 Hh 通路增强胃癌干细胞的耐药性。TGF-β 通路参与调节细胞分化、生长和增殖，并能激活免疫反应起到抑制肿瘤的作用，该通路直接促进上皮-间充质转化，从而促进肿瘤发展进程[55-57]。哺乳动物的 TGF-β 信号通路同样存在复杂的调控网络， 促进肿瘤细胞增殖、凋亡、血管生成、细胞侵袭[。综上所述，大量研究发现了 MSI1 与 Notch、Wnt、Akt、TGF-β和 Hedgehog（Hh） 等信号通路之间相互作用，这些信号通路在正常胚胎发育中起重要调控作用，并且这些信号通路失调均在肿瘤发生发展过程中发挥着重要作用。

[font='times new roman'][size=14px]MSI1 调节小细胞肺癌增殖凋亡[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]简介[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，也是全球癌症死亡的主要原因[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]。小细胞肺癌[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]（[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]small cell lung cancer, SCLC[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]）[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]发生率占肺癌的[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]10%-15%[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]，[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]5 [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]年生存率仅为[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]7%[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]SCLC [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]具[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]有生长迅速、容易耐药、早期转移等特点，恶性程度在所有肺癌类型中最高，总体预后[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]差，未经治疗的[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]SCLC [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]患者生存期仅[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]2-4[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]个[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]月[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]。大多数[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]SCLC[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]患者在诊断时已处于广泛期，其预后极差，因此[/size][/font][font='times new roman'][size=14px][color=#000007]对于[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=14px][color=#000007] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=14px][color=#000007]SCLC [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=14px][color=#000007]转移侵袭相关的分子机制的研究，有助于识别[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=14px][color=#000007]SCLC[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=14px][color=#000007] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=14px][color=#000007]新的生物标记物和治疗靶点。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=14px]SCLC [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]是一种高度恶性的肺神经内分泌肿瘤。有学者通过对[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]SCLC[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]表观遗传学和[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]基因表达的研究发现，[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]ASCL1 [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]和[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]NEUROD1 [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]揭示了[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]SCLC [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]的异质性[/size][/font][font='times new roman'][size=14px][5][/size][/font][font='times new roman'][size=14px]，而最新研究基[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]于[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]SCLC [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]中四个关键转录因子[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]ASCL1[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]NEUROD1[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]POU2F3[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]和[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]YAP1[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]的差异表达，[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]将其定义为[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]SCLC-A[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]SCLC-N[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]SCLC-P [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]和[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]SCLC-Y [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]四种亚型[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]。尽管在早期发现和[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]治疗方面取得了进展，但[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]SCLC [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]的死亡率仍在上升。因此，了解肿瘤发生发展的分子机制对于更好的诊断和预后是必需的。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]Musashi1(MSI1) [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]是一种保守的[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]RNA [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]结合蛋白[/size][/font][font='times new roman'][size=14px], [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]最初在果蝇中被发现，位于染色体[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]12q24 [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]上，编码一个[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]362-[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]氨基酸多肽；[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]MSI1 [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]与真核转录起始因子[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]4G[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]（[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]eIF4G[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]）[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]竞争[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]多聚[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]A [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]结合蛋白[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]（[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]PABP[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]）[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]，以[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]结合其靶[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]mRNA [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]的[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]3[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]′[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]-[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]非翻译区[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]（[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]UTR[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]）[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]中的特定序列，从而抑制靶基因的翻译[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]。作为一种[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]RNA [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]结合蛋白，[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]MSI1[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]已被证明参与许多与癌症有关的信号通路，其表达与肿瘤的发生发展密切相关[/size][/font][font='times new roman'][size=14px][9-11][/size][/font][font='times new roman'][size=14px]。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]Akt [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]信号通路在肿瘤[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]的发生发展中发挥重要作用，参与调节肿瘤细胞增殖、周期、凋亡以及肿瘤细胞与细胞外基质之间的相互作用[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]；研究发现[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]MSI1 [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]通过调节[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]Akt [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]信号通路的活性来[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]调节非[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]小细胞肺癌的恶性和化疗耐药性[/size][/font][font='times new roman'][size=14px][14][/size][/font][font='times new roman'][size=14px]，[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]MSI1 [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]也可以通过激活[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]Wnt [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]信号通路促进宫颈癌细胞的[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]EMT[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]、侵袭和转移[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]。另有研究发现[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]MSI1 [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]表达增强会导致肿瘤的扩散和复发，[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]MSI1 [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]高表达[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]被认为是生存率低和预后差的指标。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]Moreira[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]等人发现[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]MSI1 [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]在[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]SCLC[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]组织中普遍表达，因此本研究对[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]MSI1 [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]在[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]SCLC[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]中的生物学功能和分子机制研[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]究进行了初步探索，旨在为[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]SCLC[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]诊治提供新思路，为[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]SCLC[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]的治疗以及改善患者预后提供有力的临床前研究依据。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]上皮间充质转化（[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]epithelial-mesenchymal transition[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]，[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]EMT[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]）是肿瘤转移侵袭的主要[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]机制之一，具有促进肿瘤细胞恶性增殖、减少细胞凋亡和衰老、促进免疫抑制等作用[/size][/font][font='times new roman'][size=14px][19][/size][/font][font='times new roman'][size=14px]。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]E-[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]粘连蛋白[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]（[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]E-cadherin[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]）[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]表达下调或缺失、细胞极性的缺失都是[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]EMT [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]的重要标志[/size][/font][font='times new roman'][size=14px][20][/size][/font][font='times new roman'][size=14px]。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]N-[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]钙粘蛋白[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]（[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]N-cadherin[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]）[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]、波形蛋白[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]（[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]Vimentin[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]）[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]属于间质细胞表型标记物，在[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]EMT [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]过程中，[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]E-cadherin[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]的下调会伴随着[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]N-cadherin[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]及[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]Vimentin [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]表达的上调，从而导致肿[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]瘤细胞骨架重排，促进肿瘤的转移[/size][/font][font='times new roman'][size=14px][21[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]，[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]22][/size][/font][font='times new roman'][size=14px]。大量研究表明，在乳腺癌、结直肠癌、肺癌等[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]多种恶性肿瘤中，具有[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]EMT[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]表型的肿瘤细胞可表现出高度的侵袭和转移能力，导致患者的预后极差[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]。大量研究证明，[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]SCLC [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]的[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]EMT [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]过程受到多种通路的调控，进而促进[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]SCLC[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]发生发展以及化疗的耐药性。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]Wnt[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]信号通路调节生物体发育、体内平衡、愈合再生和维持干细胞等各种生物过程[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]，[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]Wnt [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]通路传导缺失会导致发育缺陷、骨骼疾病，甚至参与调控乳腺癌、结直肠等恶性肿瘤的发生发展[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]。尽管其主要通路成分已被确定，但[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]Wnt [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]信号在肿瘤中的功能十分复杂，目前也只是部分了解。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]Wnt [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]信号激活的转录反应是由细胞核内[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]β-catenin [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]结合因子的复杂网络所[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]介[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]导的[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]。大肠腺瘤性息肉病[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]（[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]adenomatous polyposis coli [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]，[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]APC[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]）[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]基因的缺失是大肠癌中[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]Wnt [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]信号传导的主要驱动因素，另外[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]R-spondin/Lgr5/RNF43 [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]模块的突变也被认为是依赖[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]Wnt [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]通路的肿瘤生长的驱动因素[/size][/font][font='times new roman'][size=14px][35[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]，[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]36][/size][/font][font='times new roman'][size=14px]。另有研究发现，在[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]自体非小细胞肺癌模型中，[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]Wnt [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]配体抑制剂和[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]aPD1 [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]联合治疗能减弱双重免疫检查点阻断反应[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]W[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]n[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]t[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]/β-[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]cate[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]n[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]i[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]n[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]信号通路也是结肠癌的一个公认的驱动因素[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]，因此对[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]Wnt[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]信号通路的研究，可以为肿瘤的诊断治疗提供了新的方法和思路。[/size][/font]

iCELLigence全自动细胞分析仪让您远离MTT实验不断重复还无法得到统一结果的烦恼，让您不再因只看到其中的一个点而损失了其它的细胞生物学信息而无计可施，因为它可以清楚的记录下细胞完整的一生！ 一：全自动细胞分析仪仪器原理 iCELLigence实时无标记全自动细胞分析仪是一款新型的细胞分析平台，具有实时监测、高信息量、无需标记、全自动化、高灵敏度和高准确性等独特优点。该细胞分析仪通过嵌在E-plate板上孔底的微电子感应器阻抗变化去感受细胞的有无以及贴壁、黏附和生长程度的改变。在细胞毒性检测中，可实时、直观的反应细胞增殖、存活、凋亡、形态变化等细胞生物学变化。 二：全自动细胞分析仪仪器优势 iCELLigence全自动细胞分析仪的传感器阻抗技术在细胞分析中具有其独特的优势：它为整个的细胞毒性检测分析过程中提供了全程无损伤的监控，实时、连续显示的数据让您可以更加自信更加清楚的进行细胞毒性检测操作和其它的细胞分析，而不是假定细胞处于合适的处理阶段。一连串实时获取和显示的数据让您处理每一步结果都可以通过机理来预测，同时也可以结合全自动细胞分析仪实时的读数来决定传统终点细胞毒性检测分析的最佳时间点。只需几个简单的操作步骤您就可以获得高信息量的、直观的、准确的结果，就可以让您的细胞实验变得更加省时高效。 三：全自动细胞分析仪的应用领域基于iCELLigence全自动细胞分析仪的技术优势，该系统在基础生命科学领域具有广泛的应用，如细胞质量控制、细胞毒性检测、细胞粘附和细胞伸展等。

最近我养细胞发现小黑点现象很严重，原来对“黑胶虫”一说嗤之以鼻，认为那不过是自欺欺人的借口，觉得怎么也不会发生在自己身上。但是真的就碰上了：要来的细胞传代以后就出现细胞间黑点，细胞空泡化，很多类似凋亡、坏死的细胞，最终细胞漂浮，完全死亡。上述现象很像所谓的“黑胶虫”。我感觉实际是支原体感染以后细胞生长不好造成的碎片和感染原虫的混合体。这种现象的直接原因是支原体等原虫感染，间接表象是小黑点，被以讹传讹成为了“黑胶虫”。光镜下看不到支原体，但是可以看到支原体感染的终末现象——细胞凋亡坏死，释放出大量碎片，看起来就像小黑虫子。查找类似的帖子——很多人是更换血清后出现这种问题；说空气传播的可能是一个培养箱的人都用了同一种血清，而不是可以通过培养箱空气传播；感染最可能是牛源性的支原体，通过产道或血行感染，所以兽用的泰乐菌素比较有效。用plasmocin等抗支原体的药物有效;用巨噬细胞共培养有效（吞噬支原体）；很多人更换进口血清就好了。感染也有个疾病谱，在质和量上从低烈度到高烈度，所谓“细胞生长不受影响”，其实是感染的烈度不高而已；烈度高的感染就出现细胞大量空泡形成，细胞间空旷地带出现大量黑点，细胞最终凋亡、坏死，漂起来。有些国产血清写着建议灭活，其实是挂羊头卖狗肉，那个56度30分钟更多的是为了杀杀支原体的。实际上也有杀不死的。但可以降低产品的风险。我用阿奇霉素（有针对支原体衣原体功效）75-100ug/ml的浓度洗了细胞和加入培养基中，小黑点确实明显抑制。不过我想根治就很难了。据说invivogen公司的plasmocin可以根治，不过就成本来说不如直接更换血清。以上是自己个人总结的一点看法。建议不要总拿子虚乌有的“黑胶虫”来说事。多考虑看不到的支原体，不要还停留在培根时代——只相信自己眼睛看见的。

[size=16px]西达本胺对[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]细胞系在体外水平的作用及机制[/size][size=16px]西达本[/size][size=16px]胺属于苯[/size][size=16px]酰胺类化合物，是我国自主研发的首个亚型选择性口服[/size][size=16px]HDAC[/size][size=16px]I[/size][size=16px]，国家食品药品监督管理局已批准其用于临床试验[/size][font='times new roman'][size=16px]，[/size][/font][size=16px]其选择性抑制[/size][size=16px]I[/size][size=16px]类[/size][size=16px]H[/size][size=16px]DAC1[/size][size=16px]、[/size][size=16px]2[/size][size=16px]、[/size][size=16px]3[/size][size=16px]亚型和[/size][size=16px]I[/size][size=16px]I[/size][size=16px]类[/size][size=16px]H[/size][size=16px]DAC10[/size][size=16px]亚型，可抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡，阻滞周期、引发[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]损伤，还可以增强抗肿瘤免疫反应。与其他抗肿瘤药物相比，西达本胺疗效好、选择性高、不良反应少。[/size][size=16px]西达本胺可激活死亡受体途径和线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡，其中最为主要的是线粒体凋亡途径，[/size][size=16px]该途径[/size][size=16px]受[/size][size=16px]B[/size][size=16px]cl-2[/size][size=16px]家族[/size][size=16px]介[/size][size=16px]导的细胞色素[/size][size=16px]C[/size][size=16px]释放通路调控。抗凋亡蛋白[/size][size=16px]B[/size][size=16px]cl-2[/size][size=16px]表达受到抑制，促凋亡蛋白[/size][size=16px]Bax[/size][size=16px]表达上调，使线粒体膜电位降低，细胞色素[/size][size=16px]C[/size][size=16px]释放到细胞质中，[/size][size=16px]C[/size][size=16px]aspase[/size][size=16px]途径被激活，细胞发生凋亡。例如：西达本[/size][size=16px]胺增强[/size][size=16px]B[/size][size=16px]淋巴瘤细胞组蛋白[/size][size=16px]H3[/size][size=16px]、[/size][size=16px]H4 [/size][size=16px]乙酰化水平，使线粒体膜电位降低随后激活[/size][size=16px]C[/size][size=16px]aspase[/size][size=16px] [/size][size=16px]3[/size][size=16px]，促进细胞凋亡；在肾癌中，它可以[/size][size=16px]下调[/size][size=16px]Bcl-2[/size][size=16px]表达，上调[/size][size=16px]Bax[/size][size=16px]表达[/size][size=16px]，随着药物浓度增加引起[/size][size=16px]786-O [/size][size=16px]细胞凋亡[/size][size=16px]。[/size][size=16px]西达本[/size][size=16px]胺可以[/size][size=16px]调控[/size][size=16px]R[/size][size=16px]OS[/size][size=16px]水平。[/size][size=16px]H[/size][size=16px]DACI[/size][size=16px]可以上调[/size][size=16px]R[/size][size=16px]OS[/size][size=16px]水平，导致[/size][size=16px]D[/size][size=16px]NA[/size][size=16px]双链损伤。研究证明，西达本[/size][size=16px]胺作用[/size][size=16px]于白血病细胞后，诱导细胞内[/size][size=16px]R[/size][size=16px]OS[/size][size=16px]产生，细胞凋亡增加。此外，在胰腺癌细胞系中，西达本[/size][size=16px]胺明显[/size][size=16px]增强细胞内[/size][size=16px]ROS[/size][size=16px]的产生，上调γ[/size][size=16px]H2AX[/size][size=16px]（[/size][size=16px]D[/size][size=16px]NA[/size][size=16px]双链断裂的标志物）表达水平，诱发细胞[/size][size=16px]DNA[/size][size=16px]损伤[/size][font='times new roman'][size=16px][[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]18][/size][/font][size=16px]。[/size][size=16px]西达本[/size][size=16px]胺通过[/size][size=16px]调控细胞周期蛋白（[/size][size=16px]Cyclin[/size][size=16px]）、细胞周期蛋白依赖性激酶（[/size][size=16px]Cyclin-dependent kinases[/size][size=16px]，[/size][size=16px]CDKs[/size][size=16px]）以及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（[/size][size=16px]Cyclin-dependent kinases inhibition[/size][size=16px]，[/size][size=16px]CDKI[/size][size=16px]）的表达阻滞细胞周期。例如，西达[/size][size=16px]本胺使[/size][size=16px]MM[/size][size=16px]细胞系[/size][size=16px]P21[/size][size=16px]、[/size][size=16px]P27[/size][size=16px]的表达量增高，[/size][size=16px]C[/size][size=16px]DK4[/size][size=16px]、[/size][size=16px]C[/size][size=16px]DK6[/size][size=16px]、[/size][size=16px]Cyclin D2[/size][size=16px]表达[/size][size=16px]量下降，阻滞[/size][size=16px]M[/size][size=16px]M[/size][size=16px]细胞系于[/size][size=16px]G[/size][size=16px]1[/size][size=16px]期。在[/size][size=16px]N[/size][size=16px]K/T[/size][size=16px]细胞淋巴瘤中，西达本胺上调[/size][size=16px]P21[/size][size=16px]表达，下调[/size][size=16px]Cyclin E[/size][size=16px]表达，诱[/size][size=16px]导细胞发生[/size][size=16px]G0/G1[/size][size=16px]期阻滞，从而抑制细胞的增殖[/size][size=16px]。[/size][size=16px]目前为止，关于西达[/size][size=16px]本胺在[/size][size=16px]S[/size][size=16px]CLC[/size][size=16px]中的研究并不多，为探究西达本胺对[/size][size=16px]S[/size][size=16px]CLC[/size][size=16px]细胞系[/size][size=16px]的作用及机制，探究[/size][size=16px]西达本胺对[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]细胞系在体外水平的作用及机制[/size][size=16px]，发掘西达[/size][size=16px]本胺在[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]治疗中的潜力，为[/size][size=16px]SCLC[/size][size=16px]靶[/size][size=16px]向治疗[/size][size=16px]提供新的思路[/size][size=16px]仍有重要意义[/size][size=16px]。[/size]

细胞冻存是细胞培养的关键步骤，一般推荐的冻存液比例为：1：3：6（或1：2：7） 配冻存液1份DMSO3份血清和6份培养基(养细胞时用什么培养基冻存时就用什么培养基)。取生长状态良好的细胞进行冻存处理，小编实验室有一个秘密配方，就是10%DMSO和90%的纯血清，这个冻存液有一些奢侈，但是对于一些比较脆弱的细胞，或者是一些冻存条件比较差的实验室（例如没有-80冰箱）有非常良好的效果。除此之外和大家分享六大注意事项1、错误的时机：细胞状态不好（长的太过了，培养液已经很黄；细胞可疑污染；细胞已经开始凋亡或崩解；连续培养超过二个月，细胞性状已有改变改变）。解决：最佳时机：细胞增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好，复苏后两周内。2、细胞太少：冻存时细胞浓度低于1-5×1000,000/ml。（复苏很难成功）。解决：离心后调整细胞浓度。（不要重新洗细胞）。3、盖子不紧：冻存管的盖子一定要拧紧，否则复苏水浴时会渗水，造成污染。解决：选择原配的管子和盖子（不同牌子/型号的颜色会有差别）。4、单薄的冻存盒：放在－80度的冻存盒，壁太薄，细胞在被迅速降温。解决：选择厚壁泡沫塑料盒，或塞入大量干棉花。（冻存的原则：缓降！）。5、-80度太久：放在－80度冰箱的时间超过半年。（冰箱的温度难以恒定:开门/关门，电压不稳等）解决：尽快转入液氮。6、液氮不足：液面不能漫过所有细胞。解决：定期测量液氮储备，保证细胞全部浸在液面下。

细胞冻存是细胞培养的关键步骤，一般推荐的冻存液比例为：1：3：6（或1：2：7） 配冻存液1份DMSO3份血清和6份培养基(养细胞时用什么培养基冻存时就用什么培养基)。取生长状态良好的细胞进行冻存处理，小编实验室有一个秘密配方，就是10%DMSO和90%的纯血清，这个冻存液有一些奢侈，但是对于一些比较脆弱的细胞，或者是一些冻存条件比较差的实验室（例如没有-80冰箱）有非常良好的效果。除此之外和大家分享六大注意事项1、错误的时机：细胞状态不好（长的太过了，培养液已经很黄；细胞可疑污染；细胞已经开始凋亡或崩解；连续培养超过二个月，细胞性状已有改变改变）。解决：最佳时机：细胞增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好，复苏后两周内。2、细胞太少：冻存时细胞浓度低于1-5×1000,000/ml。（复苏很难成功）。解决：离心后调整细胞浓度。（不要重新洗细胞）。3、盖子不紧：冻存管的盖子一定要拧紧，否则复苏水浴时会渗水，造成污染。解决：选择原配的管子和盖子（不同牌子/型号的颜色会有差别）。4、单薄的冻存盒：放在－80度的冻存盒，壁太薄，细胞在被迅速降温。解决：选择厚壁泡沫塑料盒，或塞入大量干棉花。（冻存的原则：缓降！）。5、-80度太久：放在－80度冰箱的时间超过半年。（冰箱的温度难以恒定:开门/关门，电压不稳等）解决：尽快转入液氮。6、液氮不足：液面不能漫过所有细胞。解决：定期测量液氮储备，保证细胞全部浸在液面下。

北京高信泰格贸易有限公司专营进口生化试剂,包括分子生物学产品,常规生化试剂,抗体,细胞凋亡,染色剂,分离试剂,生物缓冲液 常用试剂：大孔树脂xad-2 聚酰氨粉 葡萄糖G6152,1KG 蔗糖S1888,5KG TRISE,T1503,1KG 甘油G7757,2.5L 二乙基甲氧基硼烷328839-500ml 溶血卵磷脂62962-50ml aldrich d91055-1L二乙苯 fluka63559-250g甘露醇 sigma-a5710-100g acros-hydriodic acid,氢碘酸-50ml sigma-M6400-25ML SIGMA-C9538-100mg fluka-55200 sigma-c8667-5g acros-122020020咪唑 N-3甲基硅烷基咪唑100ml 氟氏完全左剂sigma-f5881 sigma-p5147 MOPS 99.5% MES 99.5% CAPS PIPES HEPES 99.5% CHAPS 丙烯酰铵 Acrylamide 99.9%适合电泳 甲叉双丙烯酰铵N,N-Methyline Bisacrylamide 99.9% 过硫酸胺Ammonium persulfate 十二烷基硫酸钠（SDS）分子生物级99.9% 蛋白胨(肉) Peptone 明胶高强度 丙酮酸钠 Pyruvic acid,sodium Deosyribonucleic acid,sodium salt 95% 三磷酸腺苷二钠盐 ATP 99% 胃蛋白酶抑制剂Pepstatin 纤维素酶Cellulase 750u/mg 果胶酶 Pectolase 50u/mg 溶菌酶 2wu/mg 蛋白酶抑制剂Aprotinin α-淀粉酶 4000uu/mg dNTPSMix(dATPdGTPdTTPdCTP10MMEach)原液 凝血酶 Thrombin (普通用300u/mg) 氨苄青霉素钠盐Ampicillin 水溶 盐酸四环素 (Tetracyclin Hcl)99% 卡那霉素硫酸盐 KanamycinSulfate99% 硫酸庆大霉素 GentamycinSulfate99% G418 (Geneticin) G-418硫酸盐 700u/mg 利福平 (Rifampicin) 99.5% 分子生物级 盐酸万古霉 (VancomycinHcl)1100u/mg97%不是去甲基万古霉素 硫酸链霉素 (Streptomycin Sulfate) 99% 噻孢霉素Cefotaxime Sodium 99.5%（别名头孢噻亏钠） 氯霉素 (Chloramphenicol)99% 羧苄青霉素 (Carbenicillin Na2) 盐酸壮观霉素 (Spectinomycin) 99% 制霉菌素 （Nystatin）4400u/mg 链脲佐菌素 (Streptozotocin STZ) 99.5% 丝裂霉素C Mitomycin C 950u/mg 99% 放线菌素D Actinomycin D 99.5% 染色剂: 考马斯亮蓝R250 Coomassie Brilliant Blue R-250 考马斯亮蓝G250 Coomassie Brilliant Blue G-250 3、3 5、5-四甲基联苯胺 溴酚兰 Bromphenol Blue MTT (Thiazolyl blue) 噻唑蓝 99% 十六烷基三甲基溴化铵CTAB 99.9% 叠氮钠 NaN3 99.5% 甘油 99.9% EGTA乙二醇-双-(2-氨基乙基)四乙酸 99% 乙二胺四乙酸二钠盐 EDTA-2Na99.99% 尿素Urea 99.5% 异硫氰酸胍 Guanidine Thiocyanate99.5% 盐酸胍 Guanidine Hyiochloride 99.8% 2-巯基乙醇 2-Mercaptoethanol 99.9% 咪唑 99.9% Imidazole 聚乙二醇4000 聚乙二醇6000-8000 聚乙二醇2000 二甲基亚砜 (DMSO) 笨甲基磺酰氟（PMSF）99.5%酶稳定剂 D-甘露醇 D-Mannitol 焦碳酸二乙脂 DEPC 97% 异丙基-B-D-硫代半乳糖苷（IPTG） 5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷 X-Gal 二硫代苏糖醇(DTT) 99.5% TWEEN20 99.5% TWEEN80 99.5% N，N-二甲基甲酰胺 （DMF） X-Gluc(Bromo-4-chloro-3-indolyl B-D-glucuronide cyclohexylamine salt)99% 植物试剂 6-苄氨基嘌呤 6-BA 99.9% D-生物素(可作标记用) 99.5% D-Biotine 葡萄糖Glucose（Dextrose） 肌醇 Inositol 99.5% 3-吲哚丁酸 IBA 99％ 3-吲哚乙酸 IAA 99％ a-萘乙酸 a-NAA 蛋白胨(肉) Peptone 硼酸 Boric actd 赤酶素 Gibberellic acid 玉米素 噻苯隆 适合HPLC，GC，农残，光谱分析,有机合成及组合化学的多用途高纯溶剂BJ101甲醇Methanol4×4L(长期现货)BJ102乙腈Acetonitrile4×4L(长期现货)BJ103丙酮Acetone4×4L(长期现货)BJ104异丙醇Isopropyl Alcohol4×4L(长期现货)BJ105异辛烷Iso-Octane4×4LBJ106乙酸乙酯Ethyl Acetate4×4L(长期现货)BJ107四氢呋喃Tetrahydrofuran4×4L(长期现货)BJ108石油醚Petroleum Ether4×4LBJ109氯仿Chloroform4×4LBJ110N,N-二甲基甲酰胺N,N-Dimethylformamide4×4L 北京高信泰格贸易有限公司地址：北京市西三旗金燕龙大厦1713室电话：010-62715771 62717893传真：010-62718548手机：13910810775联系人：程力