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逆流色谱的原理和发展原文:F.Edward ChouThe Principles and Development of Countercurrent Chromatography逆流色谱的原理和发展任何熟悉液液萃取(使用分液漏斗)和色谱(例如HPLC)技术的人都很容易理解逆流色谱液液萃取的原理(countercurrent chromatography(CCC))。液液萃取为化学家们分离大量的化学物质提供了一个简单的方法,而且使用的溶剂最少。把样品溶在两相溶剂系统中,振摇使两相充分混合,静置后,两相重新分层。这些步骤是分离样品组分的关键。这种经典的液液萃取在色谱工作者看来,最大的缺点是它在分离过程中只有一个理论塔板数。(事实上,这种情况下没什么理论可言。这一个分离塔板数是源自于工业上的分馏。因此,化学工作者要么设计一合适的单步分离方法去适应自己的需要,要么就用多次液液萃取去提高分离度。通常使用前者,因为后者太麻烦了。(尽管多次液液萃取经常用到,但溶剂系统在不同的提取中通常要改变,以便提高效率。)改善分液漏斗的尝试为了改善分液漏斗,以经过许多的尝试。克雷格逆流分布仪是其中一个最引人注意的突破。这套精妙的仪器,把一系列的分液漏斗有效的排成链,重复的进行系列的步骤:振摇(混合)、静置、分离,在重头开始,这样就提高了塔板数。假如有足够的塔板数,那这套仪器可以达到色谱级的分离。液滴逆流色谱(DCCC)在发展过程中又开发出了液滴逆流色谱(Droplet CounterCurrent Chromatograph)。这个仪器把一系列垂直的管子用毛细管连接起来。液体固定相留有直管中,把流动相慢慢的泵进去,(如果流动相比较重就从上方泵进去;反之,则从下方)。象所有的色谱那样,组分比较容易溶于流动相中的就移动的快;而比较容易溶于固定相中就滞后了。于是就分离开来了。很显然,每一个直管只有最小可能的理论塔板数。所以,要有显著的效能就要用大量这样的直管。其分离步骤如下:把样品液滴与流动相混合,通过不移动的固定相,期间没有发生振摇。液滴的大小与其他溶剂系统的参数限制了溶质在两质中的分配。静置最终在直管末端形成,在这儿,流过固定相的流动相在通过毛细管进入下一根直管前先聚集起来。如果流速过高就会干扰静置并破坏了分离。通过毛细管,流动相从一个直管流入下一个直管,达到分离的目的。DCCC最大的弱点是可允许的流速太低,因此分离时间长,两相混合差,相对来说,造成效率就低了。离心液滴逆流色谱(centrifugal DCCC,centrifugal planetary chromatograph,CPC)比DCCC进步的地方就是使用离心加快重力分离。离心液滴逆流色谱更通用的叫法是离心行星色谱,使用很小的直管和毛细管(用多性塑料制成多层的)。一套实用的仪器包含数以千计的直管,可以获得几百个理论塔板数的效能。CPC的缺点和DCCC相似,只是用离心代替了地球重力分离。另外,CPC还多了个缺点,就是它在流动相的进口和出口必须使用旋转流体密封件;而这些密封件性能不好,价格又高,容易损耗,并且限制了泵液的压力,进而限制了流速和离心速度。高速逆流色谱(High-Speed Countercurrent Chromatography,HSCCC)现代的CCC源于Dr.Yoichiro Itod(国家健康研究中心)的研究:行星离心分离机,及其能支持的许多可能的柱几何学。这些巧妙的仪器运用了鲜为人知的离心分离机定子与转子非旋转连接的方法。(这超出了当前的讨论范围,涉及到如何达到这一目的的方法,任何一本讨论CCC的书对此都有详细的阐述)。功能上,高速逆流色谱有能自转和公转的螺旋盘绕的惰性管(既进行绕自轴旋转的行星式旋转,又同时进行绕公轴旋转。)组成。自轴和公轴(像行星自轴和恒星的公轴)必须同步,这里的讨论只集中于不同HSCCC的共同的地方。这两种旋转造成螺旋盘绕管中作令人昏乱的运动的液体产生混合区和静置分层区。这就为色谱形成造就了非常好的分离环境。
pH-区带精制逆流色谱(pH-Zone-Refining Countercurrent Chromatography)是Ito等1994年在应用HSCCC分离纯化溴乙酰三碘甲腺氨酸(BrAcT3)时发现的,它是在普通的高速逆流色谱仪器的基础上,通过对分离样品所用的溶剂系统的组成的调配,采用化学的手段,使样品组分的色谱分离过程增添了按pH区带聚集的特征,同时,使组分的洗脱过程表现为类似置换(顶替)色谱(Displacement Chromatography)的洗脱过程,因此,它的色谱图不再是高斯分布的色谱峰形系列,而成为按pH值的大小排列的边界陡削的矩形区带系列,其结果是能把相同容积的逆流色谱仪器的分离制备量提高数倍乃至十倍。 pH-区带精制逆流色谱的分离原理,以分离酸性物质为例,在分离柱内,有机相固定相占据上半部分的空间,水溶性流动相占据下半部分空间。基于其非线性等温线的作用,保留酸形成了一个陡峭的缓行边界。该边界在柱中移动的速度比流动相慢,当酸性被分离物出现在流动相中时,由于低的pH值而形成了疏水的质子化形式,随后,它进入了有机相固定相。随着陡峭保留边界的前移,分离物将暴露在一个较高的pH的位置,这时,分离物会失去质子并且转移到水溶性的下相中。在水溶性流动相中,被分离物快速迁移穿过陡峭的保留边界,进而重复上述的循环。因此,被分离物总是被限制在陡峭的保留边界周围的狭窄区域,并且伴随着陡峭的保留酸边界洗脱成一个尖峰。被分离物的流出,按区带的pH值大小密排成顺序,而每一个区带的pH值则是由被分离物的电离常数pKb 值及亲水性所决定,可以表达为以下关系式: pHzone= pKa+log], 式中,Kd为分配率 (反映被分离物的亲水性的强弱);K[
逆流色谱技术 Countercurrent Chromatigraphy(CCC)是当今国际分离科学技术的一个新颖的分支。它的突出特点是在用很长的软管(如聚四氟乙烯管)绕制成的色谱柱内不加入任何固态支撑体或填料。使用时由使用人根据被分离混合物的理化特征,选择某一种有机/水两相溶剂体系或双水相溶剂体系,此体系可以是二元的或多元的。用此体系的上层或下层作为色谱过程的固定相,首先将其注满管柱内,然后让此管柱作特定的旋转运动,用由此形成的离心力场来支撑住柱内的液态相。这时,若用溶剂体系中的另一层作为流动相,带着混合样品由泵的压力推入分离管柱,样品就会穿过两个液相对流的整个管柱空间,各个组分也就会按其在两相中的分配系数(即某一组分在流动相中的溶解度同它在固定相中的溶解度的比值)分离开来。 一、逆流色谱技术的特点 1.逆流色谱不用固态支撑体,完全排除了支撑体对样品组分的吸附、玷染、变性、失活等不良影响。所以,能避免不可逆吸附所造成的溶质色谱峰拖尾现象,能实现很高的回收率。例如,对于黄酮等易被填料吸附的物质的分离与制备就具有明显的优势。 2.逆流色谱的分配分离是在旋转运动中完成的,两相溶剂都被剧烈振动的离心力场依其界面特征见成极微小的颗粒,样品各组分会在两相微粒的极大表面上分配,并且能在颗粒振荡与对流的环境中有效地传递。所以,它就象是把通常的溶剂萃取过程成千上万次地、高效地、自动连续地予以完成。 3.没有填料在柱内的占空体积,逆流色谱的分离柱又容易做得容积大些,柱内空间全部是有效空面。所以,它的样品负载能力很强,制备量较大,而且重视性很好。 4.逆流色谱不用填料,分离过程不是淋洗或洗脱过程,而是对流穿透过程。所以,能节省昂贵的材料消耗和溶剂消耗,运行使用的后续投入较低。 逆流色谱的分离效率比不上[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]和高效液相色谱等技术,不适宜用它去完成组成复杂的混合物的全谱分离分析。而它对于样品预处理条件的放松,以及它的回收率高,制备量大的优点,作为特定部位和特定组分的分离纯化与制备则是十分可取的。 二、逆流色谱技术的发展概况 逆流色谱的基本模型早在20世纪60年代就由Dr.Yoichiro Ito创立,经过数10年在美国国家健康研究院刚(NIH)的实验室研究,特别是在近20年,高速逆流色谱技术(High-Speed CCC,HSCCC)的出现,使它进入了在世界范围内推广应用的阶段。每年一度的美国匹兹堡国际分析化学与应用光谱学学术会议上,都设有CCC的专题组:“Journal of Chromatography”、“Journal of Liquid Chromatography”等重要学术刊物曾多次出版这一技术的论文专辑。近10年间,HSCCC在生物化学、医药学、农业、环境、材料、化工、海洋生物以及无机离子等众多领域的成功应用,使之成为一种引人注目的技术手段。1996年,在美国由John Wiley&Sons,Inc出版了《High-Speed Countercurrent Chro-matography》一书,笔者应邀撰写了该书的HSCCC onMedicinal Herbs一章,此书被选编为著名的分析化学丛书第132卷,作为一项新技术向世界传播。2000年9月,逆流色谱技术国际委员会在英国Brunel大学召开了此技术的第一届国际学术会议CCC-2000,笔者参加了会议的组织领导工作并作了天然产物分离纯化方面的特邀报告。受该国际委员会的委托,我们将于2002年4月在北京召开此项新技术的第二届国际学术会议,CCC-2002将突出天然产物研究与开发的主题。 1978年,当时任我国卫生部药品生物制品检定所所长的周海钧教授,从世界卫生组织的资料中获知Dr.Ito正在美国NIH研究开发实现逆流色谱的设备,并已用于抗生素异构体的分离。周先生建议笔者研制此种设备以配合我国的抗生素质检工作。1980年,我们研制出了我国第一台逆流色谱仪,并由检定所抗生素室用于抗生素成分的分离与分析检定。在蔡定国教授等植物药学专家的帮助与合作下,完成了首批生物碱、黄酮等类中药成分的分离应用研究,其结果引起了国内外的关注。这些工作,确立了我国在CCC技术及其应用研究方面的国际领先地位。1987年,笔者应美国NIH邀请,赴美同Dr.Ito合作从事CCC技术及相关生物工程技术的研究,共同推进了HSCCC技术的发展并获得美国发明专利。在美期间,笔者还同蔡定国教授、中国医学科学院药物所方起程教授、华西医科大学药学院肖悼英教授、肖蓉教授等密切合作,发表了一批用HSCCC分离制备天然药物活性成分的论文,为形成我国CCC技术在这一应用研究领域的国际领先优势和技术特色打下了基础。近10多年来,我国关于CCC技术的研究开发工作始终同天然产物(如中草药和农产物)的研究开发工作密切地结合着。